SCAMP2 與Rab8a 在小鼠原代巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)中的作用

林俍良，潘海強(qiáng)，丁 航，馬衛(wèi)列，張志珍 （廣東醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，廣東東莞 523808）

動脈粥樣硬化是心血管疾病的病理基礎(chǔ)，其早期特征以巨噬細(xì)胞脂質(zhì)代謝功能障礙導(dǎo)致的泡沫細(xì)胞形成為主要標(biāo)志，是引發(fā)心血管疾病發(fā)生和患者死亡的主要原因[1]。載脂蛋白A-1（apoA-1）是高密度脂蛋白的重要結(jié)構(gòu)蛋白組分，在機(jī)體脂質(zhì)代謝過程中具有介導(dǎo)泡沫細(xì)胞膽固醇外流、維持機(jī)體膽固醇穩(wěn)態(tài)、抗動脈粥樣硬化的作用[2]。研究表明，apoA-1 能介導(dǎo)泡沫細(xì)胞內(nèi)累積的膽固醇以囊泡形式胞吐至細(xì)胞外，有多種蛋白質(zhì)參與該膽固醇囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)過程[3]。分泌載體膜蛋白2（SCAMP2）是一種進(jìn)化上保守的含有4 個跨膜區(qū)的膜整合蛋白，主要在胞內(nèi)分泌囊泡及質(zhì)膜上表達(dá)，以復(fù)合物形式參與胞吐/胞吐過程，在調(diào)節(jié)囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)及細(xì)胞分泌過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[4]。Ras 相關(guān)蛋白（Ras-related protein）Rab8a 是參與細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)和囊泡運(yùn)輸?shù)恼{(diào)控因子[5]。在巨噬細(xì)胞中，Rab8a 參與控制細(xì)胞表面蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)和循環(huán)，如基質(zhì)金屬蛋白酶、腺苷三磷酸結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1 等[6]。然而，SCAMP2 和Rab8a 是否參與apoA-1 介導(dǎo)的泡沫細(xì)胞內(nèi)膽固醇囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)以及它們是否具有相互作用，目前尚不清楚。我們前期從Jackson實(shí)驗(yàn)室引進(jìn)SCAMP2基因敲除的雜合子小鼠，并成功繁殖獲得同一品系的野生型C57BL/6NJ小鼠[7]。本實(shí)驗(yàn)將提取野生型小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，建立泡沫細(xì)胞模型，分析SCAMP2 和Rab8a的表達(dá)情況及二者之間的相互作用。

1 材料和方法

1.1 儀器與材料

1.1.1 儀器 熒光定量PCR 儀（德國Roche公司）；電泳及電轉(zhuǎn)移裝置（美國Bio-Rad 公司）；5417R 高速臺式離心機(jī)（德國Eppendorf 公司）；C400 成像系統(tǒng)（美國Azure Biosystems 公司）；SYNERGY H1 酶標(biāo)儀（美國Biotek 公司）；TCS SP8 共聚焦熒光顯微鏡（德國Zeiss公司）。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動物與材料 野生雄性C57BL/6NJ 小鼠（種鼠C57BL 品系的C57BL/6NJ-Scamp2em1J小鼠購自美國Jackson 實(shí)驗(yàn)室，庫存號：028970）按照SPF 級動物飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)于廣東醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心進(jìn)行飼養(yǎng)繁殖。RPMI 1640 培養(yǎng)基購自Invitrogen 公司；胎牛血清購自Gibco 公司；乙?；兔芏戎鞍祝╝cLDL）購自安徽經(jīng)科生物技術(shù)有限公司；apoA-1 和Protein A/G 磁珠購自Sigma 公司；細(xì)胞總RNA 抽提試劑Trizol 購自Thermo Fisher 公司；逆轉(zhuǎn)錄和定量PCR 試劑盒購自Takala 公司；羊抗兔SCAMP2 多克隆抗體、羊抗鼠Rab8a 單克隆抗體和β-tubulin 抗體購自Proteintech 公司；二抗及熒光二抗購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的分離與培養(yǎng) 雄性8 周齡SPF級C57BL/6NJ小鼠禁食過夜后，頸椎脫臼法處死，腹腔注射5 mL 預(yù)冷的RPMI 1640 培養(yǎng)基，按摩腹壁5 min 后收集腹腔內(nèi)富集的巨噬細(xì)胞。1 500 r/min離心8 min，棄上清，用含10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的RPMI 1640 培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種于6 孔板（1.2×106個細(xì)胞/孔），在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h，用RPMI 1640 空白培養(yǎng)基輕輕沖洗2～3 次，去除未貼壁細(xì)胞，培養(yǎng)板上的貼壁細(xì)胞即為實(shí)驗(yàn)所用的原代巨噬細(xì)胞。

1.2.2 建立泡沫細(xì)胞模型 提取的腹腔巨噬細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h后，用空白培養(yǎng)基洗2 次，加入含有50 mg/L 乙酰化低密度脂蛋白（acLDL）0.2% BSA 的RPMI 1640 培養(yǎng)基孵育48 h，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榕菽?xì)胞。

1.2.3 apoA-1 處理與實(shí)驗(yàn)分組 巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞用空白培養(yǎng)基洗2 次，用含0.2% BSA 的RPMI 1640 培養(yǎng)基平衡12 h，加入10 mg/L 的apoA-1 作用12 h。實(shí)驗(yàn)中未做任何處理的原代巨噬細(xì)胞作為對照組；加入acLDL 誘導(dǎo)48 h 轉(zhuǎn)變的泡沫細(xì)胞即為acLDL 組；加入apoA-1 處理12 h 的泡沫細(xì)胞即為apoA-1組。

1.2.4 qRT-PCR 實(shí)驗(yàn) 上述不同處理組細(xì)胞分別用核酸提取試劑Trizol 提取細(xì)胞總RNA，6 孔板每孔加入1 mL Trizol進(jìn)行裂解。使用Takala逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，將提取的RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，隨后用Takala試劑盒進(jìn) 行qPCR 分 析。PCR 擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃、30 s；95 ℃、5 s，60 ℃、30 s，循環(huán)40 次；95 ℃、10 s、65 ℃、60 s、97℃、1 s。以GAPDH 為內(nèi)參，計(jì)算SCAMP2 和Rab8a mRNA 相對表達(dá)量。SCAMP2、Rab8a、GAPDH 引物由上海生工生物工程有限公司設(shè)計(jì)并合成，序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.5 Western blot 實(shí)驗(yàn) 提取的腹腔巨噬細(xì)胞鋪入6 孔板（1.2×106個細(xì)胞/孔），用50 mg/L acLDL 處理48 h，再用10 mg/L apoA-1作用12 h，對照組不做任何處理。提取不同處理組細(xì)胞總蛋白，BCA 法測定蛋白含量。用10%SDS-PAGE 凝膠將等量的蛋白稀釋樣品進(jìn)行電泳分離；電泳結(jié)束后，將凝膠中的蛋白質(zhì)在4 ℃、110 V 恒壓下轉(zhuǎn)移90 min 至PVDF 膜；5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別加入SCAMP2、Rab8a、β-tubulin 一抗（1:1 000 稀釋），4 ℃孵育過夜；用1×TBST洗膜3 次，每次10 min，加入相應(yīng)的二抗（1:2 000 稀釋），室溫孵育1 h；用1×TBST 洗膜3 次，每次10 min；采用Azure Biosystems C400成像系統(tǒng)進(jìn)行曝光顯影。

1.2.6 免疫共沉淀（Co-IP）實(shí)驗(yàn) 提取腹腔巨噬細(xì)胞鋪入10 cm培養(yǎng)皿（7×106個細(xì)胞），經(jīng)acLDL和apoA-1處理后，加入500 μL 預(yù)冷的含PMSF 的RIPA（弱）蛋白裂解緩沖液，冰上裂解細(xì)胞30 min；收集細(xì)胞，12 000 r/min、4 ℃離心5 min，收集上清液。每組細(xì)胞的裂解產(chǎn)物取50 μL 作為陽性對照（input組），剩余裂解產(chǎn)物平均分成2 份，分別加入2 μg 的免疫球蛋白作為陰性對照（IgG組）和相應(yīng)SCAMP2、Rab8a、β-tubulin抗體（IP 組），置于4 ℃冰箱交聯(lián)。交聯(lián)過夜后加入30 μL protein A/G 磁珠，常溫交聯(lián)2 h，再次拉下免疫復(fù)合物，用裂解緩沖液洗滌。每個樣品加入30 μL 的2×SDS緩沖液，蛋白變性后進(jìn)行Western blot分析。

1.2.7 免疫熒光（IF）實(shí)驗(yàn) 提取的腹腔巨噬細(xì)胞鋪24孔板進(jìn)行細(xì)胞爬片（1.5×105個細(xì)胞/孔）。不同處理組的細(xì)胞用4%多聚甲醛室溫固定20 min；1×PBS 漂洗3 次，每次5 min，加入含5%BSA 的PBS 緩沖液進(jìn)行封閉，搖床1 h；加入SCAMP2 抗體、Rab8a 抗體（1:200 稀釋），4 ℃孵育過夜；1×PBS 漂洗3 次，每次時間5 min，加入熒光二抗（1∶1 000 稀釋）室溫孵育1 h；加DAPI 染液200 μL，室溫避光1 min，洗板3 次后封片，使用TCS SP8 共聚焦熒光顯微鏡觀察SCAMP2 和Rab8a的定位和表達(dá)情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPad Prism 6.02 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析及LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SCAMP2和Rab8基因表達(dá)分析

與對照組相比，acLDL 誘導(dǎo)的泡沫細(xì)胞內(nèi)SCAMP2 mRNA 表達(dá)增強(qiáng)（P＜0.01）；與acLDL 組相比，apoA-1處理的泡沫細(xì)胞內(nèi)SCAMP2 mRNA表達(dá)進(jìn)一步升高（P＜0.01），見圖1A。用apoA-1 處理泡沫細(xì)胞后Rab8a mRNA 表達(dá)水平升高，與對照組和acLDL組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖1B。

圖1 qRT-PCR檢測巨噬細(xì)胞內(nèi)SCAMP2和Rab8a mRNA的表達(dá)水平

2.2 SCAMP2和Rab8a的蛋白表達(dá)分析

Western blot 分析顯示，apoA-1 處理的泡沫細(xì)胞組SCAMP2 和Rab8a 的蛋白表達(dá)，與對照組和acLDL組相比均明顯增強(qiáng)，結(jié)果見圖2A。與acLDL 組相比，apoA-1處理組SCAMP2蛋白表達(dá)升高了38.5%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖2B；與acLDL 組相比，apoA-1 處理組Rab8a 蛋白表達(dá)升高了30.8%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖2C。

圖2 巨噬細(xì)胞內(nèi)SCAMP2和Rab8a的蛋白表達(dá)分析

2.3 SCAMP2與Rab8a在巨噬細(xì)胞內(nèi)的相互作用

免疫共沉淀結(jié)果表明，內(nèi)參β-tubulin在兩種抗體處理的不同組細(xì)胞中表達(dá)量基本一致（圖3A）。與對照組相比，acLDL誘導(dǎo)的泡沫細(xì)胞內(nèi)SCAMP2蛋白與Rab8a蛋白形成復(fù)合物，而加入apoA-1介導(dǎo)泡沫細(xì)胞膽固醇外流過程中，SCAMP2 蛋白與Rab8a 蛋白的相互作用增強(qiáng)，見圖3B的IP組。

圖3 SCAMP2與Rab8a在巨噬細(xì)胞內(nèi)的相互作用分析

2.4 SCAMP2與Rab8a在巨噬細(xì)胞內(nèi)的共定位

對不同處理組的巨噬細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色，結(jié)果見圖4。相比于對照巨噬細(xì)胞，泡沫細(xì)胞內(nèi)SCAMP2（綠色熒光）和Rab8a（紅色熒光）表達(dá)均增強(qiáng)。當(dāng)用apoA-1 處理泡沫細(xì)胞介導(dǎo)膽固醇外流時，SCAMP2 和Rab8a 的熒光強(qiáng)度進(jìn)一步增加，而且兩種蛋白在細(xì)胞膜上聚集，二者在細(xì)胞質(zhì)膜處的共定位（黃色熒光）表達(dá)增強(qiáng)。

圖4 SCAMP2和Rab8a在巨噬細(xì)胞內(nèi)的定位觀察

3 討論

分泌載體膜蛋白（SCAMPs）是高爾基體及后高爾基體循環(huán)轉(zhuǎn)運(yùn)中的一類載體蛋白，調(diào)控細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。SCAMPs 家族有5 個成員，即SCAMP1～5，參與細(xì)胞內(nèi)囊泡的運(yùn)輸及細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)到細(xì)胞膜表面的轉(zhuǎn)運(yùn)，能加速細(xì)胞膜重構(gòu)，影響胞吞和胞吐融合孔的形成、穩(wěn)定及擴(kuò)張[8]。SCAMP2 作為分泌囊泡的標(biāo)記物，早期研究發(fā)現(xiàn)在哺乳動物細(xì)胞中能夠與磷脂酸肌醇4,5-二磷酸（PIP2）相互作用，調(diào)節(jié)囊泡的胞吐過程[9]。最近研究發(fā)現(xiàn)，SCAMP2 通過其疏水性肽段CWYRPIYKAFR 與PIP2之間發(fā)生靜電相互作用，可抑制胞外分泌[10]。但SCAMP2 是否參與apoA-1 介導(dǎo)的泡沫細(xì)胞內(nèi)膽固醇囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)目前報(bào)道較少。為此，我們首先提取小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，貼壁培養(yǎng)后加入acLDL，誘導(dǎo)形成巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞。在此基礎(chǔ)上，用apoA-1 進(jìn)行處理介導(dǎo)泡沫細(xì)胞膽固醇外流，分析SCAMP2 在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)改變。研究發(fā)現(xiàn)，acLDL誘導(dǎo)形成的泡沫細(xì)胞內(nèi)SCAMP2的mRNA 和蛋白水平均升高，提示SCAMP2 參與了apoA-1介導(dǎo)的泡沫細(xì)胞膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)過程。

Ras 相關(guān)蛋白（Rab）是屬于GTP 酶超家族的一類單分子蛋白質(zhì)，大約有70 種，在細(xì)胞內(nèi)囊泡運(yùn)輸過程中發(fā)揮重要作用[11]。Rab GTP 酶充當(dāng)分子開關(guān)，由鳥嘌呤核苷酸交換因子激活后，與GDP 結(jié)合的無活性Rab 轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘腉TP-Rab 結(jié)合形式，并募集特異的效應(yīng)蛋白，進(jìn)而調(diào)控囊泡的形成、融合及與質(zhì)膜錨定[12]。小GTP 酶Rab8 在膜轉(zhuǎn)運(yùn)中起著重要作用，在分泌途徑中，Rab8 調(diào)節(jié)細(xì)胞囊泡從反面高爾基體到質(zhì)膜的運(yùn)輸，調(diào)節(jié)囊泡與質(zhì)膜的融合，控制胞吐活性[13]。Rab8 包 括Rab8a 和Rab8b 兩種亞型[6]，能調(diào)控細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)和囊泡運(yùn)輸過程。有研究發(fā)現(xiàn)Rab8a 介導(dǎo)的胞內(nèi)脂滴增大可能在帕金森發(fā)病機(jī)制中起重要作用[14]，并且Rab8a的72位磷酸化在脂滴融合和增大中發(fā)揮作用[15]。然而，Rab8a 在巨噬泡沫細(xì)胞內(nèi)膽固醇囊泡運(yùn)輸中的作用目前研究較少。我們的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Rab8a mRNA 和蛋白水平在acLDL 誘導(dǎo)形成的泡沫細(xì)胞內(nèi)升高，當(dāng)用apoA-1 處理后，泡沫細(xì)胞內(nèi)Rab8a mRNA 和蛋白水平進(jìn)一步升高，提示Rab8a 參與了apoA-1介導(dǎo)的泡沫細(xì)胞膽固醇囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)過程。

為了分析SCAMP2 蛋白與Rab8a 蛋白在巨噬細(xì)胞內(nèi)是否具有相互作用，我們分別用Rab8a 抗體和SCAMP2 抗體在巨噬細(xì)胞、泡沫細(xì)胞和apoA-1 處理的泡沫細(xì)胞的蛋白裂解液中富集蛋白復(fù)合物，分析顯示acLDL 誘導(dǎo)的泡沫細(xì)胞內(nèi)SCAMP2 蛋白與Rab8a蛋白形成復(fù)合物，提示二者存在相互作用。當(dāng)用apoA-1處理泡沫細(xì)胞后，SCAMP2與Rab8a的相互作用增強(qiáng)，說明兩種蛋白以復(fù)合物形式參與了膽固醇的轉(zhuǎn)運(yùn)過程。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這一結(jié)果，我們采用免疫熒光實(shí)驗(yàn)分析SCAMP2 蛋白和Rab8a 蛋白在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)及定位情況。與免疫共沉淀結(jié)果一致，通過激光共聚焦顯微鏡觀察到acLDL 誘導(dǎo)的泡沫細(xì)胞內(nèi)SCAMP2 的綠色熒光和Rab8a 的紅色熒光增強(qiáng)，而且二者相互作用形成復(fù)合物，出現(xiàn)疊加的黃色熒光。apoA-1 處理泡沫細(xì)胞后，綠色熒光和紅色熒光進(jìn)一步增強(qiáng)，并且在細(xì)胞質(zhì)膜處出現(xiàn)了更強(qiáng)的黃色熒光，說明兩種蛋白在細(xì)胞膜上的共定位。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了SCAMP2 與Rab8a 在巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞中具有相互作用，二者以復(fù)合物形式參與apoA-1 介導(dǎo)的泡沫細(xì)胞內(nèi)膽固醇囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)，但兩種蛋白之間是否具有直接相互作用及其作用的機(jī)制需進(jìn)一步研究。