微小RNA在牙周炎齦溝液中的表達差異及對牙周炎的調(diào)控機制

錢素婷 丁玲敏 紀雅寧 林軍

浙江大學醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院口腔科 杭州 310003

牙周炎是目前全球人類最普遍的口腔疾病之一。近年來，世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）強調(diào)了加強全世界牙周炎控制的重要性，WHO稱牙周炎是導(dǎo)致全球慢性病負擔的最重要口腔疾病之一，是一個重大的公共衛(wèi)生問題[1]。牙周炎的特征是深入牙周組織的炎癥，最終導(dǎo)致支撐性結(jié)締組織牙槽骨的喪失，是40歲以上成人牙齒脫落的主要原因[2-3]。根據(jù)最新2018年牙周病和種植體周病新分類[4]，相對于Ⅲ期和Ⅳ期牙周炎，Ⅰ期和Ⅱ期牙周炎的預(yù)后會有很大的改善，因為Ⅰ期和Ⅱ期牙周炎的鄰間附著喪失小于5 mm，且沒有因牙周炎而失牙[5]。因此，快速準確地診斷牙周炎并對牙周炎進行積極有效的防治是當今的研究熱點[6-7]。

在過去十余年中，人們已對牙周炎診斷的生物標志物投入了大量的研究[8-12]，研究的目的就是制定一套客觀和定量的牙周炎診斷標準，能夠在牙周組織處于破壞性的炎癥進展期時快速準確診斷。齦溝液微小RNA（microRNA，miRNA）因其具有獲取簡便、操作無創(chuàng)、診斷定量的特點，成為近年來一個新興的牙周診斷和治療領(lǐng)域[13-14]。本文就牙周炎齦溝液中miRNA的相關(guān)研究展開綜述，旨在闡述miRNA在牙周炎齦溝液中的表達差異及對牙周炎的調(diào)控機制，為齦溝液miRNA準確診斷牙周炎提供理論參考。

1 miRNA與相關(guān)疾病的診斷

Lee等[15]在對秀麗隱桿線蟲的研究中，報道了miRNA。miRNA的發(fā)現(xiàn)引起了生物醫(yī)學研究領(lǐng)域的一場革命，如今更是延伸至臨床領(lǐng)域[16-17]。miRNA是一類由21～25個核苷酸組成的短鏈非編碼RNA，在進化中高度保守，主要通過RNA沉默機制來調(diào)控真核生物的基因表達[18]，對人類的正常發(fā)育至關(guān)重要，并廣泛參與人體的生理過程，在幾乎所有體液中都具有高度穩(wěn)定性[19]，但在疾病發(fā)生時miRNA的表達水平會發(fā)生相應(yīng)改變[18]。miRNA是人體對細菌病原體免疫和炎癥反應(yīng)的重要因子[20]，體液中的miRNA參與了很多疾病的發(fā)病機制調(diào)控，可作為某些疾病潛在的診斷生物標志物。目前已有通過檢測血液或尿液等體液中的miRNA對肺癌、肺結(jié)核、乳腺癌、腎癌等疾病進行輔助診斷的研究[21]。另外，唾液中的miRNA也已被確認為口腔鱗狀細胞癌的診斷生物標志物[19]。而miRNA在牙周穩(wěn)態(tài)和牙周炎進展中發(fā)揮著關(guān)鍵調(diào)節(jié)的作用，具有高特異性及高靈敏度的特點[22]，因此對于牙周炎的診斷也具有重要意義；但目前還沒有公認的利用miRNA的牙周炎診斷手段。

2 齦溝液對牙周炎的診斷作用

Brill等[23]利用濾紙條在實驗動物的齦溝中首次提取出液體，之后Chambers等[24]對齦溝液中酶、炎性介質(zhì)等宿主反應(yīng)成分展開研究，但均未對齦溝液中成分的生理作用展開研究。直到后來，Socransky等[25]確定了牙周炎的周期性，即牙周炎發(fā)展存在活躍期與靜止期，牙周組織的炎癥反應(yīng)對牙周炎進展的有關(guān)鍵作用，越來越多的人才將目光放到了齦溝液成分診斷作用的研究。

在健康的齦溝中，齦溝液的含量非常少，但隨著牙周組織炎癥程度的加重，齦溝液的含量會增加[26-27]。齦溝液來源于牙周組織，是附著在牙齒表面的菌斑生物膜與牙周組織內(nèi)細胞相互作用的結(jié)果，主要由血清和組織局部反應(yīng)產(chǎn)物組成，如組織降解產(chǎn)物，炎性介質(zhì)和針對牙菌斑細菌的抗體等[28]。齦溝液是宿主的炎癥滲出物，反映了產(chǎn)生齦溝液的牙周組織的炎癥進展狀態(tài)，因此齦溝液中的成分能作為牙周炎進展的潛在診斷或預(yù)后標志物[29]，目前已有90多種不同的齦溝液成分被認為是牙周炎的診斷標志物[28]。而且齦溝液的收集是一種無創(chuàng)且簡單的臨床過程，齦溝液中特定成分的分析還可以為評估患者牙周健康狀況提供了一個定量生化指標。因此，齦溝液成分是近年來牙周炎診斷中最具前景的口內(nèi)液體之一[30]。

3 miRNA在牙周炎齦溝液中的表達差異

miRNA在牙周疾病中的表達差異及作用已經(jīng)被很多研究者提及過。多項研究[17-20,31-33]表明，牙周炎患者牙齦組織中miRNA的表達水平與牙周健康者存在明顯差異。Ghotloo等[33]就通過實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)分析牙齦組織中的miRNA，發(fā)現(xiàn)miR-146a的表達水平與牙周炎嚴重程度具有相關(guān)性。但齦溝液中miRNA表達水平的改變與牙周炎進展的關(guān)系仍不能確定。近年來，很多研究者開始對牙周炎患者的齦溝液進行實驗研究，想要進一步確定牙周炎時齦溝液中某些特定miRNA表達水平的改變，擬確定理想的miRNA作為牙周炎診斷的生物標志物。Saito等[34]檢測了619個齦溝液中的miRNA，確認了40個miRNA在牙周炎組與對照組中存在差異表達，還發(fā)現(xiàn)miR-451a、miR-223-3p、miR-486-5p及miR-1260a、miR-203a、miR-210-3p和miR-205-3p表現(xiàn)出與先前牙齦組織研究中相似的上調(diào)和下調(diào)趨勢。而miR-223-3是齦溝液樣本中表達率最高的miRNA，在牙周炎齦溝液中表達上調(diào)，是牙周炎診斷中理想的齦溝液生物標志物，可以準確反映牙周組織的炎癥狀態(tài)。還有學者[35]分別檢測了齦溝液中miR-671、miR-122、miR-1306、miR-27a、miR-223、miR-1226這6種miRNA，只有miR-1226在牙周炎組和對照組之間存在顯著差異，且miR-1226在牙周炎患者中表達下調(diào)。而Zhang等[36]將牙周臨床指標與齦溝液中miR-23a的表達水平相結(jié)合，發(fā)現(xiàn)齦溝液中miR-23a的表達水平與牙周炎檢查指標呈正相關(guān)，即miR-23a表達水平與牙周炎炎癥程度成正比。而經(jīng)過非手術(shù)牙周治療后，牙周炎的炎癥程度減輕，齦溝液中的miR-23a表達水平也顯著下降。

牙周炎與多種全身系統(tǒng)性疾病相互影響[37-40]，糖尿病就是牙周炎的明確風險因素，反映了人體氧化應(yīng)激與牙周炎癥之間的惡性循環(huán)[41]，因此很多研究者將2型糖尿病與牙周炎合并研究[42]。Elazazy等[29]發(fā)現(xiàn)，miR-223和miR-200b在非糖尿病和2型糖尿病合并牙周炎患者的齦溝液中均會上調(diào)，且有糖尿病的患者miR-223的表達水平將進一步上調(diào)，而miR-203在該兩組的齦溝液中下調(diào)。而有學者[19]對miR-146a和miR-155進行研究，發(fā)現(xiàn)在非糖尿病和2型糖尿病合并牙周炎患者的齦溝液中，miR-146a和miR-155的表達水平明顯上調(diào)，且糖尿病會進一步上調(diào)miR-146a，但經(jīng)過非手術(shù)牙周治療后，齦溝液中這兩種miRNA的表達水平會顯著下降。

近年來，牙周炎齦溝液中miRNA的研究中，最常進行研究的miRNA是miR-146a、miR-155、miR-203、miR-223和miR-200，而且大部分被研究的miRNA表達水平總體上調(diào)，miR-146a和miR-223的表達水平改變最確定，并最可能作為疾病進展診斷的生物標志物[19,29,34-37,43]。

4 miRNA在牙周炎中的調(diào)控機制

牙周炎的進展主要是由于牙周組織周圍的細菌產(chǎn)物和炎性因子引起牙周組織成骨與破骨活動的不平衡從而造成的牙槽骨逐漸喪失，其中涉及復(fù)雜的免疫級聯(lián)反應(yīng)[44]，也伴隨著巨大的細胞因子和趨化因子網(wǎng)絡(luò)。促炎因子如白細胞介素（interleukin，IL）-1α、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等，以及調(diào)節(jié)細胞因子，如IL-4等在牙周炎進展過程中均會有所增加，進一步觸發(fā)牙槽骨的成骨和破骨細胞活動，最終導(dǎo)致牙槽骨吸收[45]。而在這一系列牙周炎的進展中，miRNA調(diào)控著先天免疫和適應(yīng)性免疫的所有方面，控制免疫級聯(lián)反應(yīng)，最終決定了牙周組織的狀態(tài)[20,46]。

人體中miRNA與目的基因信使RNA的3’端非翻譯區(qū)結(jié)合從而誘導(dǎo)目的基因沉默進而調(diào)控疾病的進展[47]，miRNA的沉默機制已在多條生理和病理有關(guān)的信號通路中被發(fā)現(xiàn)。miRNA在牙周炎的進展中廣泛存在，且調(diào)控多條牙周炎相關(guān)信號通路，發(fā)揮著不同的作用，但miRNA對牙周炎的具體調(diào)控機制仍未完全明確。

學者們[48-49]初步發(fā)現(xiàn)，口腔菌斑生物膜中的牙齦卟啉單胞菌，是牙周炎的重要致病菌，其細胞壁成分特別是脂多糖（lipopolysaccharide，LSP）在引發(fā)牙周炎癥反應(yīng)時發(fā)揮著重要的作用。Jiang等[48]在研究miRNA與牙周炎進展時，發(fā)現(xiàn)miR-146a的表達水平增加，牙齦卟啉單胞菌LSP可以通過Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）信號通路，調(diào)節(jié)TLR2，TLR4和核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB），刺激宿主反應(yīng)，引起牙周炎癥反應(yīng)，誘發(fā)牙周組織破壞。而miR-146a會阻斷TLR信號通路的傳遞，作為牙周炎發(fā)病機制的負反饋調(diào)節(jié)。Moffatt等[49]發(fā)現(xiàn)LSP刺激牙周組織后，miR-203被明顯上調(diào)，從而調(diào)控下游的細胞因子信號抑制因子（suppressor of cytokine signaling，SOCS）家族而控制核因子κB受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，

RANKL）信號通路影響牙周組織的成骨與破骨活動。Kajiya等[50]也同樣提出，LSP與破骨前細胞表達的TLR4結(jié)合后，可以為由RANKL介導(dǎo)的牙槽骨吸收提供共同刺激信號，從而通過腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（tumor necrosis factor receptor associated factor 6，TRAF6）、NF-κB和絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated proteinkinase，MAPK）等因子引起下游信號通路傳導(dǎo)，之后信號分子進入細胞核內(nèi)啟動基因轉(zhuǎn)錄，激活牙槽骨的免疫應(yīng)答，釋放炎性因子，從而進行牙周炎的牙槽骨改建。Elazazy等[29]還發(fā)現(xiàn)miR-223和miR-200b在牙周炎發(fā)病機制中也具有潛在作用，具有誘導(dǎo)TNF-α分泌的能力。TNF-α主要由單核細胞和巨噬細胞分泌，是一種強大的炎癥細胞因子，是牙周炎發(fā)病機制的主要細胞因子，可以調(diào)節(jié)膠原蛋白酶、前列腺素E2、趨化因子和細胞因子、細胞粘附分子和骨吸收相關(guān)因子的產(chǎn)生[51]。而miR-203可能具有保護和阻止牙槽骨吸收的作用，因為其與TNFα的水平呈負相關(guān)[29]。

綜上所述，牙周組織炎癥的引發(fā)依賴TLR信號通路[52]。TLR是一種識別病原體的模式識別受體[53]，可以與LSP結(jié)合刺激TLR信號通路，再通過髓樣分化因子初次應(yīng)答基因88（myeloid differentiation factor 88，MYD88）的募集和NF-κB在κ-輕鏈增強子上的結(jié)合來啟動促炎途徑[50]。而miRNA作為基因修飾調(diào)節(jié)劑，已有不少miRNA被發(fā)現(xiàn)參與牙周炎進展的調(diào)節(jié)。miR-146a會阻斷TLR信號通路的傳遞和隨后的細胞因子反應(yīng)[48]，miR-203會調(diào)控RANKL介導(dǎo)牙周組織的免疫反應(yīng)，引起牙槽骨改建[49]。miR-223、miR-200b可以促進牙周組織炎癥的炎性因子釋放水平，而miR-203則會抑制[29]（圖1）。總之，牙周炎的進展由眾多的miRNA共同調(diào)控，涉及不同進展階段及多條信號通路。

圖1 miRNA的牙周炎調(diào)控信號通路Fig 1 miRNA signaling pathway in periodontitismodulation

5 小結(jié)與展望

目前，牙周炎的診斷仍然主要基于臨床的常規(guī)檢查，這些檢查作為牙周炎的診斷指標不僅敏感性低，特異性差，而且還具有主觀因素影響大和臨床操作費力的缺陷。如今牙周炎已經(jīng)越來越受到臨床醫(yī)生和普通民眾的重視，對于它的診斷也需要不斷的改進完善，以形成快速、敏感和特異性的診斷體系。確定牙周炎患者疾病進展階段是良好治療的基礎(chǔ)，因此，尋找牙周炎進展時表達水平發(fā)生顯著改變的生物標志物是目前牙周學領(lǐng)域的研究熱點。目前的研究重點就是探索出牙周炎時齦溝液中顯著改變及特異性高的miRNA，為牙周炎miRNA診斷的黃金指標提供理論支持[54]。miRNA在牙周炎進展中形成了極其復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，研究者們對其機制的探索仍為冰山一角，具體的調(diào)控信號通路仍待進一步發(fā)現(xiàn)完善。未來，通過檢測齦溝液中某些特定的miRNA對牙周炎進行準確診斷或?qū)⒊蔀榭赡堋?/p>

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