2,3,7,8-四氯二苯二噁英誘導(dǎo)C57BL小鼠腭裂發(fā)病機(jī)制的研究

羅梟 蔡生青 石冰 李承浩

口腔疾病研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 國(guó)家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院唇腭裂外科 成都 610041

作為口腔頜面部最常見的先天性畸形，唇腭裂病理機(jī)制并不明確，目前認(rèn)為它是環(huán)境和遺傳因素共同作用的結(jié)果。四氯二苯二噁英（tetrachlorodiphenyl dioxin，TCDD）是一種廣泛的環(huán)境污染物，能夠?qū)е聠渭冃噪窳训陌l(fā)生，但具體機(jī)制仍不清楚[1]。研究[2]表明，TCDD并不影響腭板的生長(zhǎng)、上抬、接觸，卻能干擾腭中嵴上皮細(xì)胞的黏附和消亡。

在TCDD作用下，小鼠腭中嵴上皮細(xì)胞表面的絲狀偽足完全消失，腭中嵴上皮細(xì)胞形態(tài)由柱狀變?yōu)楸馄絒3]。絲狀偽足是上皮細(xì)胞的一種極性結(jié)構(gòu)，細(xì)胞極性對(duì)于細(xì)胞功能的發(fā)揮有著重要的作用，極性的改變預(yù)示著細(xì)胞功能和命運(yùn)的變化[4]。在細(xì)胞極性的建立和維持中，蛋白酶活化受體/非典型蛋白激酶C（protease-activated receptor/atypical protein kinase C，PAR/aPKC）復(fù)合體發(fā)揮著重要的作用[5]。PAR/aPKC復(fù)合體由3種蛋白組成，即PAR3、PAR6、aPKC，它們都屬于PAR[6]。研究[7-9]證實(shí)，PAR/aPKC復(fù)合體在細(xì)胞極性維持與調(diào)節(jié)中起到重要作用。那么，PAR/aPKC復(fù)合物是否參與腭中嵴上皮細(xì)胞的形態(tài)維持與消亡從而影響腭發(fā)育呢？

β-連環(huán)蛋白作為經(jīng)典Wnt信號(hào)通路的重要信號(hào)分子，在腭胚突的發(fā)育及腭裂的形成中同樣發(fā)揮著重要的作用[10]。條件性敲除小鼠腭中嵴上皮細(xì)胞中的Catnb基因，腭中嵴上皮細(xì)胞同樣不能正常凋亡而產(chǎn)生腭裂[11]，這一表型與TCDD誘導(dǎo)腭裂極其相似。同時(shí)，β-連環(huán)蛋白作為黏附分子在上皮極性維持中起到重要作用。此外，研究[12]表明，β-連環(huán)蛋白與TCDD的關(guān)鍵受體AhR在胚胎發(fā)育、疾病發(fā)生中存在交互作用。因此，本研究將探討β-連環(huán)蛋白是否協(xié)同PAR/aPKC復(fù)合體參與TCDD影響腭中嵴上皮細(xì)胞的極性和凋亡調(diào)節(jié)，從而導(dǎo)致腭裂。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 8周齡C57BL小鼠（購(gòu)自四川大學(xué)華西實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心），無(wú)特定病原體（specific pathogen free，SPF）飼養(yǎng)。按照雌雄比2∶1的比例于18時(shí)合籠，次日晨8時(shí)探查雌鼠陰道栓，有陰道栓者定為胚胎0 d（embryonic day，E0）。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑和器材 兔抗PAR3抗體（11085-1-AP，ProteinTech公司，美國(guó)）、鼠抗PAR6b抗體（SC-17791，Santa Cruz公司，美國(guó)）、兔抗aPKC抗體（SC-216，Santa Cruz公司，美國(guó)）、兔抗β-連環(huán)蛋白抗體（D10A8，Cell Signaling Technology公司，美國(guó)）、免疫組織化學(xué)試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）、Western blot試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所）、Trizol試劑（Invitrogen公司，美國(guó)）、逆轉(zhuǎn)錄及熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）試劑盒[寶生物工程（大連）有限公司]。超凈工作臺(tái)和臺(tái)式離心機(jī)（Thermo公司，德國(guó)）、體視顯微鏡（Olympus公司，日本）、電子天平（Strtorius公司，美國(guó)）、微量移液器（Gilson公司，法國(guó)）、倒置顯微鏡（Nikon公司，日本）、超純水機(jī)（Millipore公司，美國(guó)）、PCR儀（BIO-RAD公司，美國(guó)）、-80℃超低溫冰箱和高壓蒸汽消毒器（Sanyo公司，日本）、紫外可見分光光度儀（NanoDrop公司，美國(guó)）。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 取E12.5孕鼠，隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，每組20只，分別稱重并記錄，按照體質(zhì)量24μg·kg-1，實(shí)驗(yàn)組孕鼠胃飼質(zhì)量濃度為4μg·mL-1的TCDD；對(duì)照組孕鼠胃飼蓖麻油。

1.2.2 標(biāo)本的獲取及染色 分別于E13.5、E14.5、E15.5、E18.5將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組孕鼠引頸處死，75%乙醇溶液消毒1 min，無(wú)菌操作環(huán)境中取出胚胎。體視顯微鏡下將E18.5胚胎從口角剪開，去除下頜及舌體，充分暴露腭部，觀察并記錄腭融合及腭裂情況。實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組各取一只E13.5、E14.5、E15.5孕鼠，直視下剪取頭部，在預(yù)冷的無(wú)菌PBS液中清洗3次，經(jīng)后續(xù)處理后進(jìn)行組織學(xué)觀察。其余孕鼠按照Lu等[13]的操作，體視顯微鏡下剪開胚胎口角，去除下頜及舌體，充分暴露腭部，剪取腭胚突，在預(yù)冷的PBS液中清洗3次，經(jīng)后續(xù)處理后進(jìn)行基因、蛋白檢測(cè)。

1.2.3 染色 將獲取的胎鼠頭部固定，脫水，透明，浸蠟，包埋后，制成6μm切片，切片脫蠟，水化。對(duì)標(biāo)本行蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色后顯微鏡下觀察腭部組織學(xué)形態(tài)。采用鏈霉親和素-生物素復(fù)合物（strept avidin-biotin complex，SABC）法，使用兔抗β-連環(huán)蛋白抗體對(duì)標(biāo)本進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，DAB顯色，蘇木精輕度復(fù)染，脫水、透明后經(jīng)中性樹膠封片，通風(fēng)廚內(nèi)晾干后顯微鏡下觀察。

1.2.4 Western blot檢測(cè) 按照總蛋白提取試劑盒的操作說(shuō)明書提取總蛋白，所有操作均冰上進(jìn)行，然后進(jìn)行總蛋白定量，按照Pierce BCA蛋白定量試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作，并進(jìn)行凝膠電泳，完成后轉(zhuǎn)膜、封閉、抗體孵育：將膜放置于含兔抗PAR3（1∶500），鼠抗PAR6b（1∶200），兔抗aPKC（1∶500）的抗體孵育袋中，4℃冰箱孵育過(guò)夜。TBST洗膜3次，每次5 min。將膜置于二抗稀釋液中37℃孵育1 h。TBST洗膜3次，每次10 min。將增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光液（Millipore公司，美國(guó)）滴加在聚偏二氟乙烯膜上，充分抹勻，將膜置于BIORAD凝膠成像系統(tǒng)中采集圖像，使用Quantity One v4.40軟件進(jìn)行分析。

1.2.5 RT-PCR檢測(cè) 總RNA提?。喊凑誘rizol（Invitrogen公司，美國(guó)）試劑說(shuō)明書進(jìn)行總RNA提取。RT-PCR檢測(cè)：按照逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，具體如下：PAR3、PAR6[14]、aPKC、β-連環(huán)蛋白[15]基因引物見表1。目標(biāo)基因的mRNA量以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）為內(nèi)參，采用2-ΔΔct公式進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

表1 引物序列Tab 1 The sequence of the primers

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腭發(fā)育及TCDD誘導(dǎo)腭裂的組織學(xué)觀察

TCDD組胎鼠在E18.5全部發(fā)生腭裂，對(duì)照組未見腭裂產(chǎn)生，TCDD誘導(dǎo)腭裂的發(fā)生率為100%。組織學(xué)觀察可見，E13.5時(shí)，TCDD組及對(duì)照組腭板均在舌體兩側(cè)垂直生長(zhǎng)，腭板形態(tài)未見明顯差異。E14.5時(shí)，對(duì)照組腭板抬升至舌體上面，兩側(cè)腭板在中線處接觸，形成中嵴上皮帶。TCDD組腭板同樣抬升至舌體上面，但是兩側(cè)腭板并未緊密接觸。E15.5時(shí)，對(duì)照組腭中嵴上皮帶消失，腭板完全融合。TCDD組腭板仍然處于分離狀態(tài)，腭裂形成（圖1）。

圖1 對(duì)照組及TCDD組C57BL/6J小鼠腭胚突發(fā)育過(guò)程HE×10Fig 1 Palatal development of C57BL/6Jmice in control and TCDD groups HE ×10

2.2 PAR/aPKC復(fù)合體在腭發(fā)育中的規(guī)律表達(dá)

通過(guò)RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組中PAR/aPKC復(fù)合體在E13.5表達(dá)最強(qiáng)。E14.5、E15.5時(shí)，PAR/aPKC復(fù)合體mRNA的表達(dá)減弱（圖2）。為了進(jìn)一步確認(rèn)PAR/aPKC復(fù)合體在腭發(fā)育中的功能，進(jìn)行了Western blot檢測(cè)，結(jié)果同樣證實(shí)PAR/aPKC復(fù)合體的表達(dá)隨著腭發(fā)育而降低（圖3）。這一結(jié)果提示，PAR/aPKC參與腭發(fā)育的進(jìn)行和腭中嵴上皮細(xì)胞的形態(tài)維持。

2.3 TCDD干擾PAR/aPKC復(fù)合體在腭發(fā)育中的表達(dá)

RT-PCR結(jié)果顯示，TCDD組PAR/aPKC復(fù)合體的表達(dá)無(wú)明顯規(guī)律。其中PAR3在E13.5表達(dá)最強(qiáng)，E14.5、E15.5的表達(dá)量低于E13.5，但是E14.5與E15.5的表達(dá)無(wú)明顯差異。PAR6的表達(dá)在E13.5、E14.5、E15.5無(wú)明顯變化。aPKC的表達(dá)在E13.5最低，E14.5、E15.5依次升高。通過(guò)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)對(duì)比分析對(duì)照組和TCDD組PAR/aPKC復(fù)合體在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，TCDD組PAR3、PAR6在E13.5、E14.5、E15.5的表達(dá)量明顯低于對(duì)照組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)，二者間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。TCDD組中aPKC在E13.5的表達(dá)低于對(duì)照組，然而在E14.5、E15.5時(shí)，TCDD組aPKC的表達(dá)高于對(duì)照組（P＜0.01）（圖2）。Western blot在蛋白水平進(jìn)一步證實(shí)了這一結(jié)果（圖3）。

圖2 RT-PCR檢測(cè)PAR/aPKC復(fù)合體mRNA基因的表達(dá)Fig 2 Gene expression of PAR/aPKCcomplex by RT-PCR

圖3 Western blot檢測(cè)PAR/aPKC復(fù)合體在蛋白水平的表達(dá)Fig 3 Protein expression of PAR/aPKCcomplex by Western blot

2.4 β-連環(huán)蛋白主要表達(dá)于腭中嵴上皮細(xì)胞

免疫組織化學(xué)染色顯示β-連環(huán)蛋白在對(duì)照組E13.5、E14.5腭中嵴上皮細(xì)胞內(nèi)呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，E15.5腭發(fā)育基本完成，腭中嵴上皮細(xì)胞消失。僅在口腔側(cè)殘留的尚未完全消失的腭中嵴上皮細(xì)胞內(nèi)可見少量β-連環(huán)蛋白的表達(dá)（圖4）。為了探究β-連環(huán)蛋白在腭發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)規(guī)律，筆者進(jìn)行了RT-PCR檢測(cè)。結(jié)果顯示，β-連環(huán)蛋白在E14.5表達(dá)最強(qiáng)，E13.5次之，E15.5表達(dá)最弱（圖5）。

2.5 TCDD抑制β-連環(huán)蛋白在腭中嵴上皮細(xì)胞中的表達(dá)

免疫組織化學(xué)染色顯示，TCDD組β-連環(huán)蛋白在E13.5、E14.5以及E15.5均表達(dá)于腭中嵴上皮細(xì)胞（圖4）。RT-PCR分析顯示，E13.5、E14.5時(shí)TCDD組β-連環(huán)蛋白的表達(dá)明顯低于對(duì)照組（P＜0.01）。E15.5時(shí)，TCDD組β-連環(huán)蛋白的表達(dá)高于對(duì)照組（圖5）。

圖4 β-連環(huán)蛋白在對(duì)照組和TCDD組腭中嵴上皮中的表達(dá) SABC ×40Fig 4 β-Catenin expression in medial edge epithelium of control and TCDD groups SABC ×40

圖5 RT-PCR檢測(cè)β-連環(huán)蛋白在腭發(fā)育不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)Fig 5 β-catenin expression at the different time of palatal development by RT-PCR

3 討論

環(huán)境中的二噁英很難通過(guò)自然降解消除，易在生物體內(nèi)積累，因而被稱為“世紀(jì)之毒”。在自然界存在的300多種二噁英同類物中，以TCDD的毒性最大。TCDD來(lái)源廣泛，能夠誘導(dǎo)多種動(dòng)物產(chǎn)生先天性腭裂。

研究[16-17]表明，TCDD并不影響腭板的垂直生長(zhǎng)及上抬，但是在腭板的接觸及融合期，腭中嵴上皮細(xì)胞形態(tài)和功能發(fā)生改變。細(xì)胞極性對(duì)于維持細(xì)胞形態(tài)、發(fā)揮功能具有重要的作用，細(xì)胞極性的調(diào)節(jié)參與細(xì)胞的遷移，上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化。同時(shí)，細(xì)胞遷移、上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化在腭中嵴上皮細(xì)胞的消亡、腭板的融合中發(fā)揮著重要的作用。這些研究提示，腭中嵴上皮細(xì)胞的極性對(duì)于腭發(fā)育具有重要的作用，同時(shí)TCDD有可能通過(guò)改變腭中嵴上皮細(xì)胞的極性而導(dǎo)致腭裂。PAR/aPKC復(fù)合體作為一種高度保守的細(xì)胞極性蛋白，對(duì)于細(xì)胞極性的建立和維持發(fā)揮著重要的作用。不僅如此，PAR/aPKC復(fù)合體還參與上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化。β-連環(huán)蛋白參與細(xì)胞的黏附、遷移[18-19]，而腭中嵴上皮細(xì)胞的黏附、遷移障礙正是腭裂畸形產(chǎn)生的機(jī)制之一；β-連環(huán)蛋白是Wnt信號(hào)通路的重要轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，而Wnt信號(hào)通路在腭發(fā)育以及腭裂形成中具有重要作用，并且敲除Catnb基因可以導(dǎo)致腭裂畸形；β-連環(huán)蛋白與AhR受體之間存在交互作用，而AhR正是TCDD的主要受體之一[20]。

本研究通過(guò)HE染色、免疫組織化學(xué)染色、RT-PCR、Western blot發(fā)現(xiàn)：1）腭發(fā)育的過(guò)程中，PAR/aPKC復(fù)合體呈現(xiàn)由高到低的變化規(guī)律，這一結(jié)果提示，腭中嵴上皮細(xì)胞的細(xì)胞極性在腭發(fā)育中存在由高到低的規(guī)律變化；2）TCDD誘導(dǎo)腭裂中，PAR/aPKC復(fù)合體的表達(dá)受到干擾，提示TCDD有可能通過(guò)干擾PAR/aPKC復(fù)合體的表達(dá)，引起腭中嵴上皮細(xì)胞的極性改變，從而導(dǎo)致腭裂；3）腭發(fā)育的關(guān)鍵階段，β-連環(huán)蛋白在腭中嵴上皮細(xì)胞內(nèi)呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，這揭示了β-連環(huán)蛋白在腭發(fā)育中的重要作用；4）TCDD誘導(dǎo)腭裂中，β-連環(huán)蛋白在腭中嵴上皮細(xì)胞中的表達(dá)降低。據(jù)此可以推測(cè)，TCDD有可能通過(guò)抑制β-連環(huán)蛋白表達(dá)而影響腭中嵴上皮細(xì)胞的消亡，從而引發(fā)腭裂。

通過(guò)本研究，筆者發(fā)現(xiàn)了TCDD能夠干擾腭中嵴上皮細(xì)胞中PAR/aPKC復(fù)合體的表達(dá)，但是具體的分子調(diào)控機(jī)制還未能闡明。TCDD能夠同時(shí)改變PAR/aPKC復(fù)合體以及β-連環(huán)蛋白的表達(dá)從而影響腭中嵴上皮細(xì)胞的極性改變和凋亡，但對(duì)于二者之間的內(nèi)在聯(lián)系還有待進(jìn)一步研究。

利益沖突聲明：作者聲明本文無(wú)利益沖突。