非編碼RNA調(diào)控牙囊干細(xì)胞成骨分化的研究進(jìn)展

洪婭婭 陳學(xué)鵬 姒蜜思

1.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院正畸科 浙江大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院浙江省口腔生物醫(yī)學(xué)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 杭州 310006；

2.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院種植科 浙江大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院浙江省口腔生物醫(yī)學(xué)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 杭州 310006

牙周炎、先天性畸形、頜面部外傷、感染和腫瘤等均會導(dǎo)致不同程度的牙槽骨缺損，造成顏面部畸形的同時，對咀嚼、吞咽、語言等功能也產(chǎn)生嚴(yán)重影響。目前，臨床上牙槽骨缺損的治療方法（引導(dǎo)性組織再生、自體骨移植等）存在各種局限性，比如組織再生有限、供體不足、供骨區(qū)并發(fā)癥等，尚無法獲得理想的牙槽骨再生效果。因此，牙槽骨缺損的再生治療成為口腔領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)和難點(diǎn)。近年來，牙周組織工程技術(shù)為牙槽骨缺損的結(jié)構(gòu)再生和功能重建提供了全新的思路和路徑，其需要理想的種子細(xì)胞、安全可降解的支架材料和適宜的微環(huán)境[1-2]。牙囊干細(xì)胞（dental follicle stem cell，DFSC）起源于神經(jīng)嵴細(xì)胞，具有自我更新和多向分化潛能，是牙周組織的直接前體細(xì)胞，能分化為成骨細(xì)胞、牙周膜細(xì)胞和成牙骨質(zhì)細(xì)胞，在牙周組織發(fā)育中發(fā)揮不可或缺的作用；體外DFSC在特定條件下可以誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、神經(jīng)元、唾液腺細(xì)胞、導(dǎo)管細(xì)胞、心肌細(xì)胞等[3-4]。此外，DFSC易于獲取和保存，相比于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cell，BMSC）及其他牙源性干細(xì)胞，具有更好的增殖分化能力以及免疫調(diào)節(jié)作用，是目前極具開發(fā)前景的種子細(xì)胞[4-6]。

探索DFSC成骨分化機(jī)制是牙周組織工程的前提和基礎(chǔ)。隨著微陣列技術(shù)和高通量測序技術(shù)的發(fā)展，非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA）的重要作用不斷為學(xué)者所認(rèn)知。ncRNA是一類基因組DNA轉(zhuǎn)錄而來但缺乏編碼或翻譯蛋白質(zhì)能力的RNA，通過與蛋白質(zhì)、DNA、RNA等分子相互作用調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，在表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮生物學(xué)功能[7]。表觀遺傳調(diào)控狹義上一般是指在DNA序列不發(fā)生改變的情況下，通過調(diào)整染色質(zhì)狀態(tài)從而實(shí)現(xiàn)對基因表達(dá)的調(diào)控，主要包括DNA甲基化、組蛋白修飾和染色質(zhì)重塑等。轉(zhuǎn)錄調(diào)控是指對包括轉(zhuǎn)錄起始、延長、終止在內(nèi)的轉(zhuǎn)錄過程的調(diào)控，包括轉(zhuǎn)錄因子、增強(qiáng)子等。轉(zhuǎn)錄后調(diào)控是指對基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行一系列加工、修飾等過程，包括mRNA前體選擇性剪切、mRNA穩(wěn)定性調(diào)節(jié)、RNA干擾等。目前研究證實(shí)：ncRNA可多水平調(diào)控DFSC成骨分化，在基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中扮演著重要的角色。

1 ncRNA概述

高通量轉(zhuǎn)錄分析[8]表明：高達(dá)90%的真核生物基因組被轉(zhuǎn)錄，而僅1%～2%的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（RNA）具有蛋白質(zhì)編碼能力，其余不編碼蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄本被稱為ncRNA，最初被認(rèn)為是“轉(zhuǎn)錄噪音”。但近年來大量的研究[9-15]表明：ncRNA是基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的重要組成部分，參與許多生理和病理過程，包括發(fā)育、免疫應(yīng)答、應(yīng)激反應(yīng)、干細(xì)胞調(diào)控、疾病發(fā)生等。轉(zhuǎn)錄ncRNA的DNA序列包括蛋白質(zhì)編碼基因、增強(qiáng)子區(qū)域和轉(zhuǎn)座子元件，ncRNA根據(jù)功能可分為管家ncRNA（housekeeping ncRNA）和調(diào)控ncRNA（regulatory ncRNA）[16]。管家ncRNA通常很小，大小為50～500 nt，組成性表達(dá)于所有細(xì)胞類型，主要調(diào)節(jié)細(xì)胞的一般功能，為細(xì)胞生存所必需，包括參與蛋白質(zhì)合成的核糖體RNA（ribosomal RNA，rRNA）和轉(zhuǎn)運(yùn)RNA（transfer RNA，tRNA），RNA剪接中的小核RNA（small nuclear RNA，snRNA）和RNA修飾中的小核仁RNA（small nucleolar RNA，snoRNA）。調(diào) 控ncRNA通常在特定細(xì)胞中特異性表達(dá)，在基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)控作用，根據(jù)其大小可進(jìn)一步分為小型ncRNA（＜200 nt）和長鏈ncRNA（long non-coding RNA，lncRNA）（＞200 nt），前者包括微小RNA（microRNA，miRNA）、小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）、piwi相互作用RNA（piwi-interacting RNA，piRNA）。一部分長度可變的ncRNA可能同時屬于兩類，比如啟動子相關(guān)轉(zhuǎn)錄本（promoter-associated transcript，PAT）、增強(qiáng)子RNA（enhancer RNA，eRNA）和環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）。

目前，研究較多的ncRNA主要是miRNA、lnc-RNA和circRNA這三類調(diào)控ncRNA。

1.1 miRNA的形成與作用機(jī)制

miRNA是一類在植物、動物和病毒中廣泛表達(dá)的ncRNA，大小為21～24 nt，在進(jìn)化上表現(xiàn)出高度的保守性[14]。miRNA（lin-4 locus2）于1993年在秀麗隱桿線蟲中被發(fā)現(xiàn)[17]，隨后，哺乳動物中的miRNA（Let-7）于2000年被發(fā)現(xiàn)[18]。在哺乳動物中，miRNA可控制約50%蛋白質(zhì)編碼基因的活性，幾乎參與了所有細(xì)胞過程的調(diào)控[19]。miRNA的合成開始于細(xì)胞核中的轉(zhuǎn)錄，然后到細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)一步加工和成熟。在細(xì)胞核中，獨(dú)立的miRNA基因或蛋白質(zhì)編碼基因內(nèi)含子序列被RNA聚合酶Ⅱ（RNA polymeraseⅡ）轉(zhuǎn)錄成初級轉(zhuǎn)錄本（primary miRNA，pri-miRNA），然后再被Drosha（RNaseⅢ家族）和DiGeorge綜合征關(guān)鍵區(qū)域8（DiGeorge syndrome critical region 8，DGCR8）微處理器復(fù)合體切割形成含有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的約70 nt的前 體miRNA（precursor miRNA，pre-miRNA）；exportin 5-RanGTP穿梭系統(tǒng)將pre-miRNA輸出到細(xì)胞質(zhì)，被Dicer（RNaseⅢ家族）加工成約20 nt的miRNA/miRNA*雙鏈體，其中成熟的miRNA鏈[又叫引導(dǎo)鏈（guide strand）]整合到RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物（RNA-induced silencing complex，RISC），通過與靶基因mRNA 3’非翻譯區(qū)（3’untranslated region，3’UTR）堿基配對，促進(jìn)mRNA降解或抑制蛋白質(zhì)翻譯進(jìn)而沉默基因表達(dá)，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)生物學(xué)過程，而miRNA*鏈[又叫過客鏈（passenger strand）]則大多被降解[19-20]。生物信息學(xué)研究顯示：單個miRNA可以靶向至少數(shù)百個基因，且一個基因由多個miRNA調(diào)控，這使得miRNA在復(fù)雜的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮核心作用[21]。miRNA是干細(xì)胞生物學(xué)行為的關(guān)鍵調(diào)控因子，敲除參與miRNA形成的關(guān)鍵蛋白DGCR8的干細(xì)胞在分化方面存在缺陷[22]。

1.2 lncRNA的形成與作用機(jī)制

lncRNA是一類長度大于200 nt的調(diào)控ncRNA，來源于基因間和重疊蛋白編碼區(qū)，幾乎不具有蛋白質(zhì)編碼能力[23]。lncRNA保守性較低，但具有高度的組織特異性[24]。根據(jù)其結(jié)構(gòu)和位置可分為5類[25]：1）反義lncRNA；2）基因間lncRNA；3）有義重疊lncRNA；4）有義內(nèi)含子lncRNA；5）加工過的轉(zhuǎn)錄本。lncRNA以往被認(rèn)為是RNA PolymeraseⅡ轉(zhuǎn)錄的無功能副產(chǎn)物，但近期研究[24]顯示lncRNA參與多種生物學(xué)過程，包括染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、細(xì)胞分化、增殖、凋亡、器官形成、疾病發(fā)展等。lncRNA定位在細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)中，其功能取決于亞細(xì)胞定位[26]。lncRNA能夠折疊成獨(dú)特的二級構(gòu)象，包括DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和蛋白質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域，充當(dāng)支架、誘餌、信號和向?qū)?，與DNA、RNA和蛋白質(zhì)形成廣泛的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，在表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)[25,27]：1）在表觀遺傳水平上，lnc-RNA通過組蛋白修飾、DNA甲基化和染色質(zhì)重塑調(diào)節(jié)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)；2）在轉(zhuǎn)錄水平上，lncRNA可通過結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子（transcription factor，TF）、干擾臨近基因轉(zhuǎn)錄，或通過與RNA結(jié)合蛋白（RNAbinding protein，RBP）相互作用并靶向啟動子調(diào)節(jié)基因表達(dá)[23,28]；3）在轉(zhuǎn)錄后水平上，lncRNA作為miRNA“海綿”，減弱miRNA介導(dǎo)的靶基因調(diào)控[28]。lncRNA還可在轉(zhuǎn)錄后水平通過與蛋白形成lncRNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物（lncRNA-protein complex，lncRNP），或與其他RNA配對募集參與mRNA降解的蛋白質(zhì)，調(diào)節(jié)基因表達(dá)[29]。許多定位于細(xì)胞器（比如外泌體、線粒體）的lncRNA還可調(diào)節(jié)細(xì)胞器功能[29]。

1.3 circRNA的形成與作用機(jī)制

circRNA是一類具有獨(dú)特共價閉環(huán)結(jié)構(gòu)的調(diào)控ncRNA，在pre-mRNA成熟期間通過反向剪接產(chǎn)生，于1976年由Sanger等[30]提出。circRNA廣泛存在于哺乳動物細(xì)胞內(nèi)，在進(jìn)化上具有比miRNA更高的保守性，且具有組織特異性和時空特異性[31-33]。circRNA主要定位于細(xì)胞質(zhì)，相比于線性RNA，circRNA形成共價閉合環(huán)，無3’和5’末端，對核酸外切酶RNaseR有抵抗力，具有更好的穩(wěn)定性[33]。根據(jù)形成機(jī)制，circRNA可分為外顯子circRNA、內(nèi)含子circRNA、基因間circRNA、有義重疊circRNA和反義circRNA五類[34]。circRNA作為一類新型的保守內(nèi)源性ncRNA，在轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮功能：1）與RBP結(jié)合形成RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物（RNA-protein complex，RPC），調(diào)控線性基因的轉(zhuǎn)錄；2）充當(dāng)miRNA“海綿”；3）含有內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（internal ribosome entry site，IRES）的合成cirRNA可翻譯成蛋白質(zhì)[35]。隨著技術(shù)的發(fā)展和研究的深入，最初被認(rèn)為是異常剪接副產(chǎn)物的circRNA不斷被報道參與基因表達(dá)的調(diào)控和某些疾病的發(fā)生。

2 DFSC的成骨分化

牙囊（dental follicle，DF）是來源于外胚間充質(zhì)的疏松結(jié)締組織，在牙齒發(fā)育期間包繞成釉器和牙乳頭。Morsczeck等[36]在體外從人第三磨牙的DF中分離出DFSC。牙囊組織通過組織塊法、酶消法或兩者結(jié)合可獲得牙囊細(xì)胞（dental follicle cell，DFC），而后經(jīng)過多次差速傳代純化；純化的DFC通過有限稀釋法可分離并單克隆擴(kuò)增DFSC，相較于DFC，DFSC表現(xiàn)出增強(qiáng)的增殖能力[37]。DFSC表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cell，MSC）標(biāo)志物、胚胎干細(xì)胞標(biāo)志物和神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物，但不表達(dá)造血干細(xì)胞標(biāo)志物[38]。在含抗壞血酸、β-甘油磷酸和地塞米松的培養(yǎng)基中，DFSC可誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞，表現(xiàn)為成骨相關(guān)標(biāo)志物上調(diào)，如runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（runt-related transcription factor 2，RUNX2）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、骨鈣素（osteocalcin，OCN）、Ⅰ型膠原（collagen type-1，COL1）、骨橋蛋白（osteopontin，OPN）、骨唾液蛋白（bone sialoprotein，BSP）、成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子抗體（osterix）和同源轉(zhuǎn)錄因子5（distal-less homeobox-5，DLX-5）[3,39]。動物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，DFSC具有體內(nèi)成骨能力，將DFSC與支架材料結(jié)合植入體內(nèi)可修復(fù)大面積骨缺損。Rezai-Rad等[40]將接種DFSC的聚己內(nèi)酯（polycaprolactone，PCL）支架植入到大鼠臨界骨缺損（critical-sized bone defect，CSD）處，可實(shí)現(xiàn)約50%的骨再生。Nie等[41]將接種骨形成蛋白9重組腺病毒（recombinant adenoviruses expressing BMP9，Ad-BMP9）轉(zhuǎn)染DFC的珊瑚羥磷灰石（coralline hydroxyapatite，CHA）支架植入大鼠牙槽骨缺損模型，在6周后觀察到顯著的新骨形成。在炎癥環(huán)境下，DFSC相比牙周膜干細(xì)胞（periodontal ligament stem cells，PDLSC）表現(xiàn)出更為強(qiáng)大的適應(yīng)能力和牙周組織再生能力[42]。因此，DFSC作為理想的種子細(xì)胞，在牙周組織工程中具有廣闊的應(yīng)用前景。然而，DFSC的成骨分化需要適宜的微環(huán)境，在沒有相關(guān)生物活性分子的誘導(dǎo)下其不能礦化或形成骨組織[43]。自從DFSC成功分離以來，許多學(xué)者致力于其成骨潛能的研究。DFSC的成骨分化機(jī)制復(fù)雜，受多種因素的調(diào)節(jié)，包括細(xì)胞間相互作用、細(xì)胞因子，涉及復(fù)雜的信號通路[3]。人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）[44]或Hertwig上皮根鞘細(xì)胞（Hertwig’s epithelial root sheath cell，HERSC）[45]與DFSC或DFC共培養(yǎng)時，成骨分化能力顯著增強(qiáng)；BMP9[46]、BMP6[47]、牙源性成釉細(xì)胞相關(guān)蛋白（odontogenic ameloblast-associated protein，ODAM）[48]、牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白1（dentin matrix protein 1，DMP1）[49]等促進(jìn)DFSC成骨分化；Wnt/βcatenin信號通路[50]、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路[46]等參與DFSC的成骨分化。以往對DFSC成骨分化機(jī)制的研究多聚焦于TF和細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）蛋白。近年來的相關(guān)研究證實(shí)，ncRNA是DFSC成骨分化基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中至關(guān)重要的信號分子，以BMP為代表的成骨分化上游啟動因子，以RUNX2為代表的下游成骨分化相關(guān)標(biāo)志基因等均受到ncRNA的調(diào)控（表1）[51-59]。

表1 參與調(diào)控DFSC成骨分化的ncRNATab 1 ncRNAs involved in the regulation on osteogenic differentiation of DFSCs

3 miRNA與DFSC成骨分化

3.1 miRNA在DFSC中的表達(dá)特點(diǎn)

miRNA的調(diào)控表現(xiàn)出明顯的組織和細(xì)胞特異性，不同組織來源的干細(xì)胞具有其獨(dú)特的miRNA表達(dá)譜。Ogura等[60]比較MSC和DFC的miRNAmRNA表達(dá)譜，miR-196-a、-b和miR-10-a、-b僅在MSC中高表達(dá)，而miR-20a*、miR-129-3p和miR-19b-1*僅在DFC中高表達(dá)，且miRNA的表達(dá)水平與相關(guān)靶基因在兩種干細(xì)胞的表達(dá)水平一致，表明miRNA的組織特異性表達(dá)影響不同組織的特征性mRNA表達(dá)，提示miRNA-mRNA表達(dá)譜可用于表征組織類型和作為細(xì)胞特異性標(biāo)志物。同樣，與3T3細(xì)胞、BMSC和脂肪干細(xì)胞（adipose stem cell，ADSC）成骨細(xì)胞分化相關(guān)的miRNA（如miR-26a、miR-125b和miR-20a）在DFSC中并未差異表達(dá)[61-64]。

3.2 miRNA調(diào)控DFSC成骨分化

DFSC成骨細(xì)胞分化過程中多種miRNA上調(diào)或下調(diào)，這些miRNA通過靶向TF、信號分子等參與調(diào)控成骨分化。其中，miRNA更加傾向于靶向TF，同時又更多地受到TF的調(diào)節(jié)，兩者之間構(gòu)成相互聯(lián)系的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[65]。同時，miRNA協(xié)調(diào)成骨相關(guān)信號通路，在復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮重要的核心作用。

3.2.1 正向調(diào)控DFSC成骨分化的miRNA miR-101：Klingelh?ffer等[51]發(fā)現(xiàn)miR-101在hDFSC成骨分化過程中上調(diào)，miR-101-mimic轉(zhuǎn)染增加ALP活性，成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子SP7顯著上調(diào)，表明miR-101正向調(diào)控DFSC成骨分化；miR-101調(diào)節(jié)與癌細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)基因，而轉(zhuǎn)錄因子DLX3調(diào)節(jié)DFSC的細(xì)胞增殖和凋亡，且參與成骨分化，推測BMP2/DLX3信號通路作為RUNX2和SP7的上游通路，可能是miR-101調(diào)控DFSC成骨分化的重要靶點(diǎn)，但具體的機(jī)制有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

3.2.2 負(fù)向調(diào)控DFSC成骨分化的miRNA miR-29：Tomoki等[52]研究hDFC成骨分化過程中miRNA的表達(dá)譜發(fā)現(xiàn)，miR-29（miR-29a、-29b和-29c）在成骨分化過程中顯著下調(diào)；進(jìn)一步研究顯示miR-29以COL1（礦化組織的主要ECM）為靶點(diǎn)，抑制成骨分化，其中以miR-29b的抑制作用最為強(qiáng)烈。

miR-146a：RUNX2作為成骨細(xì)胞特異TF，影響細(xì)胞的生物學(xué)行為，其中RUNX2突變是顱骨鎖骨發(fā)育不良（cleidocranial dysplasia，CCD）患者乳牙滯留和恒牙遲萌的原因。Chen等[53]研究了RUNX2與miRNA對DFSC分化的影響，RUNX2突變的hDFSC表現(xiàn)為更長、更大的細(xì)胞形態(tài)，降低的增殖活性以及增強(qiáng)的成骨分化能力；微陣列分析顯示RUNX2突變影響多個miRNA的表達(dá)，其中miR-146a在RUNX2突變DFSC中顯著降低；當(dāng)miR-146a過表達(dá)或抑制時，RUNX2、骨保護(hù)素（osteoprotegrin，OPG）、EGFR和集落刺激因子-1（colony stimulating factor 1，CSF-1）的表達(dá)變化顯著，EGFR是miR-146a的潛在靶基因，EGFR參與調(diào)節(jié)成骨分化過程中RUNX2的表達(dá)[66]，提示RUNX2基因與miRNA之間的相互作用可能是DFSC成骨分化的關(guān)鍵調(diào)控機(jī)制之一。

miR-204：Ito等[56]的研究發(fā)現(xiàn)hDFC成骨分化過程中miR-204表達(dá)降低，miR-204的轉(zhuǎn)染降低了ALP活性以及SPARC和RUNX2的蛋白水平，同時伴隨三者mRNA水平的降低，表明miR-204通過靶向RUNX2、ALP和SPARC負(fù)向調(diào)控hDFC的成骨分化。

miR-335：左婕等[54]的研究顯示rDFSC體外誘導(dǎo)成骨分化過程中miR-335下調(diào)，miR-335負(fù)向調(diào)控DFSC的成骨分化。miR-335在未分化人間充質(zhì)干 細(xì) 胞（human mesenchymal stem cell，hMSC）中高表達(dá)，在成骨分化過程中發(fā)生下調(diào)，miR-335直接靶向RUNX2的3’UTR抑制其表達(dá)，同時miR-335的表達(dá)又受到經(jīng)典Wnt信號通路的調(diào)控[67]。而miR-335-5p通過下調(diào)Wnt通路拮抗劑Dickkopf相關(guān)蛋白1（Dickkopf-related protein 1，DKK1）激活Wnt信號通路，參與MSC成骨分化。Wnt信號通路同樣是DFSC成骨分化中的重要信號通路，包括經(jīng)典Wnt/β-catenin信號通路和非經(jīng)典Wnt信號通路，提示W(wǎng)nt信號通路可能參與miR-335對DFSC成骨分化的調(diào)控。

miR-214：王智亨等[55]發(fā)現(xiàn)miR-214過表達(dá)的rDFSC伴隨β-catenin表達(dá)水平的下調(diào)，并抑制ALP、骨粘連蛋白（osteonectin，OSN）及RUNX2的表達(dá)，抑制成骨分化。

miRNA通過靶向相關(guān)基因，與成骨相關(guān)信號通路相互作用，同時又受其調(diào)控，在基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮重要的核心作用。由于miRNA體積小，容易傳遞到細(xì)胞中，被認(rèn)為是未來治療牙槽骨缺損的潛在方法。但是目前許多對miRNA和DFSC成骨分化的研究僅僅停留在功能層面，或只是運(yùn)用生物信息學(xué)預(yù)測靶基因，對調(diào)控機(jī)制的研究需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

4 lncRNA與DFSC成骨分化

4.1 lncRNA MEG3

MEG3是母系表達(dá)的lncRNA，位于人類染色體14q32.3區(qū)域DLK1-MEG3印記位點(diǎn)。研究顯示，hDFC中的lncRNA MEG3顯著低于人牙周膜干細(xì)胞（human periodontal ligament stem cells，hPDLC），

lncRNA MEG3在胚胎發(fā)生和發(fā)育上發(fā)揮重要作用，MEG3耗盡伴隨著DFSC多能性相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄減少，表明MEG3在DFSC多能性中可能發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA MEG3定位于細(xì)胞質(zhì)，與zeste基因增強(qiáng)子同源物2（enhancer of zeste homolog 2，EZH2）相互作用，下調(diào)MEG3或EZH2降低Wnt基因啟動子上的H3K27me3水平，在表觀遺傳水平上激活Wnt/βcatenin信號通路，進(jìn)而促進(jìn)DFSC的成骨分化[57]。

4.2 lncRNA HOTAIRM1

lncRNA HOTAIRM1是位于同源異形盒A1/2（homeobox A1/2，HOXA1/2）基因間區(qū)的反義轉(zhuǎn)錄物，Chen等[58]的研究發(fā)現(xiàn)lncRNA HOTAIRM1和HOXA2在hDFSC中的表達(dá)顯著高于hPDLSC，兩者具有相似的表達(dá)模式，進(jìn)一步研究證實(shí)lncRNA HOTAIRM1通過抑制DNMT1表達(dá)以及其在HOXA2啟動子區(qū)域的富集，維持HOXA2啟動子的低甲基化水平，促進(jìn)HOXA2的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)DFSC的成骨分化。

4.3 其他可能參與DFSC成骨分化的lncRNA

hDFC顯示出比hPDLC更優(yōu)的胚胎特性，包括多能性和異質(zhì)性，微陣列檢測顯示845個lncRNA在兩者中差異表達(dá)，包括lncRNA NR_033932、lncRNA RGMB-AS1、lncRNA T152410、lncRNA ENST00000540293等，表明lncRNA在DFC分化中可能起關(guān)鍵作用，lncRNA RGMB-AS1可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期來促進(jìn)DFC的遷移、增殖和分化；lncRNA ENST00000540293可能通過調(diào)節(jié)鄰近基因的表達(dá)促進(jìn)DFC存活和分化；lncRNA uc021sxs.1和lncRNA ENST00000609146可能通過調(diào)節(jié)mRNA表達(dá)而參與相關(guān)的信號傳導(dǎo)途徑（比如Wnt信號通路），調(diào)節(jié)DFC的成骨分化。但這些差異表達(dá)的lncRNA主要基于生物信息學(xué)分析，具體的作用機(jī)制有待進(jìn)一步深入探究。

lncRNA數(shù)量龐大且作用機(jī)制復(fù)雜，目前關(guān)于lncRNA與DFSC成骨分化的研究較少，僅闡述了lncRNA在表觀遺傳水平調(diào)控DFSC成骨分化的機(jī)制，對轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控機(jī)制至今仍無涉及，需要更多的研究來豐富對DFSC調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的認(rèn)知。

5 circRNA與DFSC成骨分化

circRNA參與協(xié)調(diào)成骨相關(guān)的分子和信號通路，在成骨分化過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。circRNA通過靶向miRNA，與Wnt/β-catenin、MAPK、BMP信號通路中的mRNA相互作用，調(diào)控成骨分化。研究[59]發(fā)現(xiàn)：DFSC成骨分化過程中circFgfr2充當(dāng)miR-133的“分子海綿”，抑制miR-133表達(dá)，使下游BMP6基因表達(dá)增強(qiáng)，促進(jìn)DFSC的成骨分化。目前關(guān)于circRNA調(diào)控成骨分化主要集中在充當(dāng)“分子海綿”方面，但關(guān)于circRNA-miRNAmRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的確切機(jī)制尚不清楚。此外，circRNA在基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的作用機(jī)制復(fù)雜，是否能通過直接與RBP結(jié)合調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄或直接翻譯成蛋白質(zhì)來調(diào)控成骨分化仍是個未知數(shù)。關(guān)于circRNA調(diào)控DFSC成骨分化機(jī)制的研究尚處于起步階段，需要更多地挖掘DFSC成骨相關(guān)circRNA并進(jìn)一步探究其作用機(jī)制。

6 總結(jié)與展望

miRNA、lncRNA、circRNA、mRNA和TF之間相互作用，協(xié)調(diào)多種信號通路，構(gòu)成復(fù)雜而精準(zhǔn)的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，參與DFSC的成骨分化調(diào)控。DFSC作為牙周組織工程理想的種子細(xì)胞，明確ncRNA在DFSC成骨分化中的角色和作用機(jī)制，對實(shí)現(xiàn)牙周組織再生和功能重建具有重要意義。雖然關(guān)于ncRNA在DFSC成骨分化過程中的認(rèn)識尚只是冰山一角，部分研究僅僅在功能上闡述了促進(jìn)或抑制成骨分化，但是ncRNA的關(guān)鍵調(diào)控作用不容忽視。因此，需要借助生物信息學(xué)方法和基因組學(xué)技術(shù)深入挖掘ncRNA的功能，并進(jìn)一步探索其調(diào)控機(jī)制，豐富基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，以期實(shí)現(xiàn)對DFSC成骨分化的精準(zhǔn)調(diào)控，為干細(xì)胞的再生治療提供新的策略。隨著ncRNA重要作用和DFSC成骨分化機(jī)制的不斷被揭示，牙周組織工程有望廣泛應(yīng)用到臨床治療當(dāng)中。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。