COL4A5基因新發(fā)突變致ALPORT綜合征1例并文獻(xiàn)復(fù)習(xí)

孫婉 林毅 張冉冉 邵樂平 張秋業(yè)

(1 青島大學(xué)附屬醫(yī)院兒科，山東 青島 266003； 2 青島市市立醫(yī)院腎臟科)

ALPORT綜合征(ALPORT syndrome, AS)是由編碼腎小球基底膜Ⅳ型膠原蛋白的基因突變導(dǎo)致的遺傳性腎臟疾病[1]。腎小球基底膜Ⅳ型膠原α鏈的α3、α4以及α5鏈分別由COL4A3、COL4A4以及COL4A5基因編碼[2]，上述基因突變可導(dǎo)致患者出現(xiàn)血尿、蛋白尿及慢性進(jìn)行性腎功能減退，部分患者可以表現(xiàn)為高頻神經(jīng)性耳聾、近視等腎外表現(xiàn)[3-4]。由于缺乏有效治療手段，該病預(yù)后較差，最終多進(jìn)展為終末期腎病(ESRD)[5]?，F(xiàn)有研究表明，ESRD發(fā)生的早晚及進(jìn)展速度取決于治療開始時疾病所處的階段或狀態(tài)[6]。因此，AS的早期診斷與合理干預(yù)非常重要。本研究報道了1例由COL4A5基因新發(fā)突變導(dǎo)致的AS，并對患者的分子遺傳學(xué)資料進(jìn)行了分析，以期提高對本病的認(rèn)識，為本病的診斷和臨床干預(yù)提供參考。

1 臨床資料

患者，男，8歲，因“尿檢異常6月余”于2019年11月3日入住我院心腎免疫兒科?；颊?019年4月18日于“上呼吸道感染”后1周出現(xiàn)肉眼血尿伴輕微眼瞼浮腫，就診當(dāng)?shù)貎和t(yī)院。尿常規(guī)顯示隱血,紅細(xì)胞10.21×109/L,蛋白，血清補(bǔ)體C3 0.40 g/L，抗鏈球菌溶血素O(ASO)316 kU/L，血清免疫球蛋白IgG 5.59 g/L，24 h尿蛋白定量為53 mg/kg，尿紅細(xì)胞形態(tài)檢查顯示嚴(yán)重變形紅細(xì)胞占40%。疑診為“急性鏈球菌感染后腎小球腎炎”，采用青霉素類藥物抗感染及對癥治療2周，尿蛋白及血尿情況未見好轉(zhuǎn)。隨后給予甲潑尼龍[10 mg/(kg·d)，連用3 d]治療2個周期，治療后患者肉眼血尿消失，予以出院。出院后每天1次口服福辛普利(10 mg)；繼續(xù)口服強(qiáng)的松[1 mg/(kg·d)]治療，后逐漸減量，于2019年10月15日停用。2019年8月復(fù)查血清補(bǔ)體C3、ASO及血清IgG均恢復(fù)正常,尿常規(guī)顯示尿蛋白、尿紅細(xì)胞10.20×107/L，偶有晨起眼瞼浮腫，尿量基本正常。為進(jìn)一步診治，2019年11月3日就診于我院門診，以“腎炎綜合征”收入院。

入院體格檢查：體溫36.5 ℃，脈搏92 min-1，呼吸23 min-1，體質(zhì)量38 kg，血壓122/63 mmHg。神志清，精神好，全身無皮疹，無顏面及眼瞼水腫，腎區(qū)無叩擊痛，雙下肢無浮腫。余體格檢查未見明顯異常。輔助檢查：尿液分析顯示尿蛋白，隱血，紅細(xì)胞10.20×107/L；24 h尿蛋白定量測定為35.7 mg/kg；血生化檢查結(jié)果示總蛋白50.31 g/L，白蛋白32.61 g/L，球蛋白17.7 g/L，谷丙轉(zhuǎn)氨酶23 U/L，谷草轉(zhuǎn)氨酶30 U/L，尿素氮3.84 mmol/L，肌酐30 μmol/L，總膽固醇3.96 mmol/L，低密度脂蛋白2.19 mmol/L，三酰甘油1.21 mmol/L；血清IgG 4.09 g/L，IgA 1.02 g/L，IgM 0.79 g/L，IgE 14.39 kU/L；血清補(bǔ)體C3 1.29 g/L，C4 0.28 g/L；血常規(guī)、血清電解質(zhì)、調(diào)節(jié)性淋巴細(xì)胞亞群、紅細(xì)胞沉降率、血凝指標(biāo)等檢測無異常。聽力傳導(dǎo)通路檢查未見異常。腎臟組織穿刺活檢病理學(xué)檢查結(jié)果：①光鏡下蘇木精-伊紅(HE)染色結(jié)果顯示，毛細(xì)血管袢開放良好，節(jié)段系膜區(qū)輕度增寬，系膜細(xì)胞與基質(zhì)增多，囊壁增厚(圖1A)；過碘酸六胺銀染色(PASM)、Masson染色均陰性；糖原染色(PAS)顯示腎小管間質(zhì)病變輕，小灶狀小管上皮細(xì)胞扁平、刷狀緣脫落，偶見蛋白管型，腎間質(zhì)較多泡沫細(xì)胞聚集(圖1B)；腎臟組織免疫熒光染色檢查(未進(jìn)行Ⅳ型膠原α鏈免疫熒光染色檢查)：IgG、IgA、IgM、C3、C1q、λ鏈、κ鏈、PLA2R均陰性；病理診斷：腎小球節(jié)段系膜輕度增生性病變；②普通透射電子顯微鏡檢查：腎小球基底膜厚薄不一，基底膜致密層增厚，部分呈撕裂狀和蛛網(wǎng)狀，足突部分融合，未見電子致密物沉積(圖1C、D)。

A：光鏡下腎臟組織HE染色結(jié)果，200倍；B：光鏡下腎臟組織PAS染色結(jié)果，100倍；C：普通透射電子顯微鏡照片，基底膜致密層分層狀改變，5 000倍；D：普通透射電子顯微鏡照片，毛細(xì)血管袢明顯撕裂分層，呈蛛網(wǎng)狀，12 000倍晶狀體和斑點(diǎn)狀視網(wǎng)膜病變，前者臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性加重的近視，后者一般不會影響視力，多不需要進(jìn)行治療[12]。

為進(jìn)一步明確病因，經(jīng)患者家屬知情同意后，采集患者及其父親和母親外周血各2 mL，提取DNA，靶向探針捕獲，選擇增強(qiáng)全外顯子組點(diǎn)突變項(xiàng)目對患者進(jìn)行高通量二代測序，患者父親和母親均采用一代測序技術(shù)(Sanger)對同一可疑的致病變異進(jìn)行驗(yàn)證(由深圳安吉康爾醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室協(xié)助完成)?；颊呋驒z測結(jié)果顯示X染色體長臂2區(qū)2帶3亞帶(Xq22.3)上的COL4A5基因存在一處半合子變異(c.3393_3419del)，即第38號外顯子編碼區(qū)第3393～3419位堿基缺失，導(dǎo)致第1128～1136號氨基酸缺失(p.G1128_S1136del)(圖2A)，該突變?yōu)榭騼?nèi)缺失突變，患者父母該位點(diǎn)均無變異(圖2B、C)。在OMIM、Pubmed、HGMDpro、Clinvar、dbSNP、Varcards等數(shù)據(jù)庫對該突變位點(diǎn)進(jìn)行檢索，均未見收錄，為首次發(fā)現(xiàn)的新發(fā)突變。根據(jù)美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)會(ACMG)發(fā)布的基因序列變異解讀指南[7]進(jìn)行致病性分析，同時結(jié)合患者臨床表現(xiàn)及典型腎臟組織病理學(xué)特征，判定該突變?yōu)橹虏⌒酝蛔儭?/p>

A：患者，箭頭處27個堿基缺失(c.3393_3419del)；B：患者父親；C：患者母親

根據(jù)患兒病史、體征、相關(guān)輔助檢查、腎臟組織病理及基因檢測結(jié)果，明確診斷為AS。繼續(xù)每天一次口服福辛普利(10 mg)，以減少尿蛋白分泌、延緩腎臟病變，門診隨訪半年。隨訪期間患兒尿常規(guī)顯示尿蛋白，隱血，紅細(xì)胞8.28×108/L，腎功能尚未受損。眼科及耳鼻咽喉科門診隨訪過程中無感音神經(jīng)性耳聾，無近視、斜視、圓錐形角膜、眼底病變等情況出現(xiàn)。

2 討 論

AS是兒童最常見的遺傳相關(guān)性腎炎[8]。多在10歲前以腎小球源性血尿起病[9]，起病隱匿，隨著時間進(jìn)展可伴有不同程度蛋白尿，腎功能呈進(jìn)行性衰竭。除了嚴(yán)重的腎臟損害，AS也可引起聽力損傷及眼部損傷。其中聽力損傷的發(fā)生率為50%～67%[10]，可為AS患者的首發(fā)癥狀之一，且多為雙側(cè)對稱性感音性耳聾，最初多累及高頻區(qū)，而后進(jìn)行性累及全音域[11]。AS的眼部損傷主要包括圓錐狀A(yù)S的診斷標(biāo)準(zhǔn)為持續(xù)性腎小球性血尿或血尿伴蛋白尿的患者符合以下任意一條標(biāo)準(zhǔn)即可確診：電鏡下腎小球基底膜致密層撕裂分層、腎小球基底膜Ⅳ型膠原α3、α4、α5鏈免疫熒光染色異常、皮膚基底膜Ⅳ型膠原α5鏈免疫熒光染色異常、基因檢測發(fā)現(xiàn)COL4A5基因有一個致病性突變或COL4A3/4基因有兩個致病性突變[5]。但本研究認(rèn)為腎組織電鏡檢查及Ⅳ型膠原α鏈免疫熒光染色檢查均為間接性結(jié)果，疾病早期癥狀不典型，易造成漏診?；驒z測不僅有助于明確突變類型、確診疾病，也可為該病的產(chǎn)前診斷提供線索[13-14]。本研究中患者為8歲男孩，慢性病程，以肉眼血尿及大量蛋白尿起病，糖皮質(zhì)激素治療無效，結(jié)合腎臟活檢組織電鏡觀察，顯示腎小球基底膜厚薄不一，基底膜致密層增厚，部分呈撕裂狀和蛛網(wǎng)狀；基因檢測發(fā)現(xiàn)COL4A5基因存在致病性缺失突變，可明確AS診斷。該患者總病程6個月，病初發(fā)現(xiàn)補(bǔ)體C3下降，ASO輕微升高，后當(dāng)?shù)蒯t(yī)院門診隨診時完善補(bǔ)體及ASO檢查，發(fā)現(xiàn)指標(biāo)恢復(fù)正常，因此該患者病初不能排除合并急性鏈球菌感染后腎小球腎炎的可能性。

AS遠(yuǎn)期預(yù)后不佳，男性尤為突出，常在20～30歲進(jìn)展至ESRD[15]，進(jìn)行性加重的蛋白尿?yàn)閷?dǎo)致AS不良預(yù)后的主要相關(guān)因素[16]。也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，AS患者腎臟損傷程度與聽力受損程度具有正相關(guān)性[17]。該患者以腎臟損傷為主，且程度較重，因此住院期間于我院耳鼻咽喉科行畸變產(chǎn)物耳聲發(fā)射檢查，顯示聽力傳導(dǎo)通路未見異常。推測一方面可能與其年齡尚幼、臨床表型尚不完全有關(guān)。另一方面，感音神經(jīng)性耳聾起病較為隱匿，臨床多采用純音測聽、聲導(dǎo)抗、畸變產(chǎn)物耳聲發(fā)射、聽性腦干反應(yīng)等方法聯(lián)合進(jìn)行早期篩查，而該患者僅完善了畸變產(chǎn)物耳聲發(fā)射檢查。該檢查是一種評價外周聽覺通路的方法，可精確地反映耳蝸毛細(xì)胞在相應(yīng)頻率上的功能狀態(tài)；但檢測靈敏度較低，可能存在漏診的可能。

根據(jù)遺傳方式的不同，AS可分為以下3種類型[18]，COL4A5基因突變所致的X連鎖顯性遺傳性AS(XLAS)、COL4A3或COL4A4基因突變所致的常染色體隱性遺傳AS(ARAS)及常染色體顯性遺傳AS(ADAS)，其中以XLAS最常見，大約占85%。檢索HGMD數(shù)據(jù)庫中COL4A5基因突變的患者，迄今為止，有1 286個COL4A5基因突變位點(diǎn)，尚未見有熱點(diǎn)突變。其中錯義/無義突變620個(錯義突變占41.8%左右，無義突變占6.3%左右)，缺失突變?yōu)?42個(26.6%)，剪接突變?yōu)?22個(17.3%)，插入突變74個(5.8%)，插入/缺失突變13個(1.0%)，插入/重復(fù)突變7個(0.5%)，復(fù)雜重組8個(0.6%)。缺失或插入導(dǎo)致移碼突變占7.8%左右。本研究中患者基因檢測顯示COL4A5基因第38號外顯子編碼區(qū)第3393～3419位堿基缺失，導(dǎo)致第1128～1136號氨基酸缺失，并致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，之后16個氨基酸后出現(xiàn)終止密碼子，該突變類型為整碼突變。根據(jù)ACMG指南[7]分析：該突變?yōu)樾掳l(fā)突變，經(jīng)家系驗(yàn)證，其父母在該位點(diǎn)均無變異，為強(qiáng)致病性證據(jù)(PS2)；該突變?yōu)榉侵貜?fù)區(qū)域中的閱讀框內(nèi)插入/缺失或終止密碼子喪失導(dǎo)致蛋白質(zhì)長度改變，為中等致病性證據(jù)(PM4)；該突變在gnomAD數(shù)據(jù)庫、千人數(shù)據(jù)庫、ExAC數(shù)據(jù)庫的正常人群中未發(fā)現(xiàn)(或極低頻位點(diǎn))，是罕見變異，為中等致病性證據(jù)(PM2)。聯(lián)合上述證據(jù)，確定其變異性質(zhì)為PS2+PM2+PM4，初步判定為“可能致病性變異”中的組合b。結(jié)合患者已出現(xiàn)持續(xù)性血尿、蛋白尿等臨床表現(xiàn)及典型腎臟組織病理學(xué)特征，提示該突變已導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及功能改變，因此該突變?yōu)橹虏⌒酝蛔?。該基因突變遺傳方式為X連鎖顯性遺傳，基因突變信息應(yīng)該僅遺傳給其女兒。

目前相關(guān)研究表明，COL4A5基因突變的類型、位置不同，則相應(yīng)臨床表型、ESRD進(jìn)展速度也不同[18-24]。無義突變、移碼突變及供體剪接突變等突變類型的患者相應(yīng)臨床表型較為嚴(yán)重，20歲左右即可進(jìn)展為ESRD，且大多合并腎外損害，其中聽力異?？蛇_(dá)80%。第21～47號外顯子甘氨酸突變、非甘氨酸錯義突變、受體剪接突變及不引起移碼突變的缺失或插入病變患者臨床表型嚴(yán)重程度較前者次之，多在25歲左右進(jìn)展為ESRD，其腎外損害較少。而發(fā)生在第1～20號外顯子甘氨酸替代突變的患者臨床癥狀往往較輕，ESRD患者多于30歲之后發(fā)生[18,24]。本研究中患者COL4A5基因第38號外顯子編碼區(qū)存在致病性缺失突變，在幼年期即存在持續(xù)血尿伴間斷大量蛋白尿，無聽力、眼部損害等腎外表現(xiàn)，與上述研究相符；該患者目前長期口服福辛普利治療，尚未出現(xiàn)腎衰竭癥狀，后續(xù)需密切隨訪。

綜上所述，臨床上不明原因的血尿、蛋白尿患者，若糖皮質(zhì)激素治療無效，或存在腎功能慢性進(jìn)行性損傷、聽力受損、眼部異常等腎外表現(xiàn)，建議盡早行腎臟穿刺活檢和(或)基因檢測以明確病因。AS的早期診斷有助于避免使用糖皮質(zhì)激素及免疫抑制劑帶來的副作用，可以更加合理地選擇治療方案及評估患者預(yù)后。另外，對于患者家屬的再生育也具有一定的指導(dǎo)作用。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。

ConflictsofInterest： All authors disclose no relevant conflicts of interest.

倫理批準(zhǔn)和知情同意：本研究涉及的所有試驗(yàn)均已通過青島大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會的審核批準(zhǔn)(文件號QYFYWZLL26836)。所有試驗(yàn)過程均遵照《人體醫(yī)學(xué)研究的倫理準(zhǔn)則》的條例進(jìn)行。受試對象或其親屬已經(jīng)簽署知情同意書。

EthicsApprovalandPatientConsent： All experimental protocols in this study were reviewed and approved by The Medical Ethics Committee of The Affiliated Hospital of Qingdao University (Approval Letter No.QYFYWZLL26836), and all experimental protocols were carried out by following The Ethical Guidelines for Human Medical Research. Consent letters have been signed by the research participants or their relatives.

作者貢獻(xiàn)：張秋業(yè)、孫婉、張冉冉、邵樂平參與了研究設(shè)計；孫婉、林毅、張秋業(yè)參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發(fā)表該論文。

Contributions： The study was designed byZHANGQiuye,SUNWan,ZHANGRanran, andSHAOLeping. The manuscript was drafted and revised bySUNWan,LINYi, andZHANGQiuye. All the authors have read the last version of the paper and consented submission.