響應面法優(yōu)化藜麥發(fā)酵飲料配方的研究

陸 陽

（中央儲備糧通遼東郊直屬庫有限公司，內(nèi)蒙古 通遼 028012）

藜麥是藜科的一種植物，已經(jīng)有近7 000年的種植歷史[1-2]，它具有特殊的營養(yǎng)特性，并含有高濃度的蛋白質(zhì)、必需氨基酸和不飽和脂肪酸，特別是賴氨酸和蛋氨酸含量最高[3-5]，它還含有多種維生素，礦物質(zhì)和其它有益化合物，該作物被認為是最好的植物蛋白來源之一。此外，藜麥中還含有皂苷、多酚、γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）、黃酮等多種功能性成分，同時含有豐富的膳食纖維，食用后使人產(chǎn)生飽腹感，非常適合糖尿病人群長期食用[6-9]。研究表明，長期食用藜麥可以有效地緩解高血壓、高血糖、心臟病等，還具有增強人體免疫力、補充營養(yǎng)及減肥等功效。本文以藜麥為發(fā)酵原料接種乳酸菌研制藜麥發(fā)酵飲料，為藜麥產(chǎn)品開發(fā)進行了研究探索。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

藜麥，吉林省中谷藜麥實業(yè)有限公司提供；蔗糖、檸檬酸、黃原膠均為食品級；試驗菌種，乳酸菌購于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；MRS培養(yǎng)基，青島海博生物技術有限公司；GABA標準品（純度≥98%），北京索萊寶科技有限責任公司；鄰苯二甲醛，上海笛柏有限公司；乙腈，上海笛柏有限公司；2-巰基乙醇，上海笛柏有限公司；四氫呋喃，上海笛柏有限公司；MRS培養(yǎng)基，青島海博生物技術有限公司；乙酸鈉，天津歐博凱化工有限公司；碳酸鈣，天津歐博凱化工有限公司；硼酸、無水乙醇、甲醇均為國產(chǎn)分析純。

1.2 試驗儀器

FA1204B電子天平，上海佑科儀器儀表有限公司；BL-50A立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海東亞壓力容器制造有限公司；SW-CJ-2FD型凈化工作臺：上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；RE-2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；HHS型電熱恒溫水浴鍋，上海博訊實業(yè)有限公司；Sigma3K15型高速離心機，北京五洲東方科技發(fā)展有限公司；SHP-250型生化培養(yǎng)箱，上海精宏試驗設備有限公司；FW100型萬能粉碎機，瑞安市永歷制藥機械有限公司；HZQ-C空氣浴振蕩器，哈爾濱市東聯(lián)電子技術開發(fā)有限公司；SHZ-D（III）循環(huán)水式真空泵，鞏義予華儀器有限責任公司；D-30M型高壓均質(zhì)機，美國Phd科技公司；高效液相色譜儀Waters2695，美國Waters公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 藜麥發(fā)酵飲料加工工藝

藜麥→挑選→粉碎→加水→放入搖床→接種乳酸菌→發(fā)酵→離心→過濾 （無菌）→濃縮→發(fā)酵原液→調(diào)配→均質(zhì)→灌裝密封→殺菌→冷卻→成品

1.3.2 操作要點

1.3.2.1 藜麥粉的制備

挑選籽粒完整、無蟲蝕的藜麥進行粉碎，過80目標準篩，收集過篩后的樣品備用。

1.3.2.2 菌種活化

用無菌移液槍吸取200 μL液體培養(yǎng)基，滴入菌種保藏管內(nèi)，使其呈懸浮狀態(tài)，然后將乳酸菌菌液接種在MRS培養(yǎng)基中平板涂布，在37℃下培養(yǎng)48h后，將培養(yǎng)基于9 000 r/min的高速冷凍離心機中離心10 min，制得菌泥，并用無菌水來重新溶解調(diào)整菌液濃度在108CFU/mL作為發(fā)酵劑。

1.3.2.3 發(fā)酵液制備

參考先前研究的發(fā)酵液制備方法[10]，準確稱取25 g粉碎好的藜麥粉，加入滅菌處理后的去離子水150 mL，放置于發(fā)酵罐內(nèi)，接入4%乳酸菌，發(fā)酵溫度34℃，搖床轉(zhuǎn)速140 r/min，發(fā)酵24 h，將發(fā)酵液放入5 000 r/min的離心機內(nèi)離心15 min，發(fā)酵液進行過濾、濃縮，得到藜麥發(fā)酵液。

1.3.2.4 調(diào)配、均質(zhì)、灌裝、殺菌

將上述原輔料按優(yōu)化實驗所得的最佳比例進行調(diào)配，在30 MPa的條件下均質(zhì)兩次，于100 mL的玻璃瓶進行灌裝，95℃殺菌15 min。

1.3.3 液相色譜法測γ-氨基丁酸含量

1.3.3.1 發(fā)酵飲料預處理

將發(fā)酵飲料放入8 000 r/min的離心機內(nèi)離心15 min，上清液進行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器進行濃縮，過0.45 μm濾膜，超聲波除泡10 min備用。

1.3.3.2 標準溶液的制備

按參考文獻[11]的方法進行標準溶液配制，準確稱取0.1 g γ-氨基丁酸標準品，用蒸餾水溶解并定容到100 mL,過0.45 μm濾膜，用超聲波除泡10 min備用。

1.3.3.3 OPA衍生液制備

稱取0.1 g鄰苯二甲醛（OPA），用1 mL乙腈溶解，然后加入130 μL巰基乙醇最后用 0.4 mol/L的硼酸緩沖液定容到10 mL備用。

1.3.3.4 衍生化反應

取預處理好的樣品20 μL，加入100 μL OPA衍生液，震蕩5 s后靜置3 min，進樣20 μL。

1.3.3.5 色譜分析條件

色譜柱：Kromasil-C18色譜柱 （4.6 mm×250 mm，5 μm）。流動相：流動相A為乙酸鈉溶液加三乙胺用5%醋酸調(diào)pH 7.2±0.02，最后加入四氫呋喃混合后過濾備用；流動相B為乙酸鈉溶液用5%醋酸調(diào)pH 7.2±0.02，再添加乙腈和甲醇使其三者比例為 1：2：2（體積比），混合后過濾膜備用。設置液相色譜流動相流速為1 mL/min,洗脫程序方法按表1進行，柱溫 40 ℃，檢測波長 338 nm[12～14]。

表1 梯度洗脫程序參數(shù)表

1.3.4 藜麥發(fā)酵飲料配方單因素實驗

選取蔗糖添加量（1%、3%、5%、7%、9%）、檸檬酸添加量 （0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%）、黃原膠添加量 （0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%）、發(fā)酵液添加量（10%、30%、50%、70%、90%），四個因素不同水平進行單因素試驗，以感官評分為指標，研究藜麥發(fā)酵飲料單因素最佳配方。

1.3.5 藜麥發(fā)酵飲料配方響應面優(yōu)化實驗

在單因素試驗的基礎上，選取蔗糖、檸檬酸、黃原膠、發(fā)酵液添加量4個因素，以感官評分作為實驗設計的響應值，根據(jù)Box-Benhnken利用四因素三水平的實驗設計優(yōu)化藜麥發(fā)酵飲料配方[15-16]。響應面設計實驗因素及水平見表2。

表2 響應面試驗因素水平設計表

1.3.6 藜麥發(fā)酵飲料理化指標及微生物指標測定

1.3.6.1 理化指標測定

酒精度測定參照GB/T 394.2-2008對藜麥發(fā)酵飲料進行酒精度的測定。

pH測定參照GB/T 5009.237-2016對藜麥發(fā)酵飲料進行pH值的測定。

1.3.6.2 微生物指標測定

藜麥發(fā)酵飲料菌落總數(shù)檢測參照GB/T 4789.2-2016對藜麥發(fā)酵液進行菌落總數(shù)測定。

藜麥發(fā)酵飲料大腸菌群檢測參照GB/T 4789.3-2016對藜麥發(fā)酵液進行大腸菌群測定。

藜麥發(fā)酵飲料致病菌檢測參照GB/T 4789.4-2016進行沙門氏菌檢驗、GB/T 4789.10-2016進行金黃色葡萄球菌檢驗、GB/T 4789.15-2016進行霉菌檢驗和酵母計數(shù)。

1.3.7 感官評定

請10位專業(yè)的食品感官評價人員對藜麥發(fā)酵飲料進行專業(yè)的食品感官評定，感官指標包括藜麥發(fā)酵飲料的色澤、口感、氣味及組織狀態(tài)（是否有明顯雜質(zhì)），評價滿分設定為100分，按照評分標準進行評分。評分標準見表3。

表3 藜麥發(fā)酵飲料感官評分標準

1.3.8 數(shù)據(jù)處理

本文所使用的圖片均采用Origin 7.5制得，結(jié)果采用SPSS22.0軟件對兩組數(shù)據(jù)間進行方差分析：p＜0.01表示差異極顯著，p＜0.05表示差異顯著，數(shù)據(jù)具有統(tǒng)計學意義。使用Design-Expert 8.0軟件進行響應面試驗設計、優(yōu)化和分析，每組試驗均做了三組平行試驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 藜麥發(fā)酵飲料配方單因素結(jié)果分析

2.1.1 蔗糖添加量對感官評分的影響

蔗糖添加量單因素實驗結(jié)果見圖1，蔗糖添加太少不足以中合發(fā)酵飲料中的酸味，從而影響口感。但蔗糖添加量過多則會影響藜麥發(fā)酵后飲料獨特的酸味，選擇蔗糖添加量為5%左右為宜。

圖1 蔗糖添加量對感官評分的影響

2.1.2 檸檬酸添加量對感官評分的影響

檸檬酸添加量單因素實驗結(jié)果見圖2，由圖2可知藜麥經(jīng)發(fā)酵后所產(chǎn)生的酸味比較單一，適當?shù)靥砑訖幟仕釙鰪姵善返娘L味，添加太少風味較差，添加太多則會影響發(fā)酵后所產(chǎn)生的獨特酸味，從而影響口感。選擇檸檬酸添加量為0.03%左右為宜。

圖2 檸檬酸添加量對感官評分的影響

2.1.3 黃原膠添加量對感官評分的影響

黃原膠添加量單因素實驗結(jié)果見圖3，由圖3可知黃原膠添加太多，飲用時產(chǎn)品過于粘稠，口感會差，黃原膠添加過少，成品口感不細膩且不穩(wěn)定。選擇黃原膠添加量為0.15%左右為宜。

圖3 黃原膠添加量對感官評分的影響

2.1.4 發(fā)酵液添加量對感官評分的影響

發(fā)酵液添加量單因素實驗結(jié)果見圖4，由圖4可知由于藜麥發(fā)酵后口感獨特，添加量太多，飲用時產(chǎn)品中藜麥的風味太濃，口感較差。添加太少又不具藜麥發(fā)酵后的獨特風味，選擇發(fā)酵液添加量為50%左右為宜。

圖4 發(fā)酵液添加量對感官評分的影響

2.2 響應面優(yōu)化藜麥發(fā)酵飲料配方結(jié)果分析

2.2.1 響應面設計及試驗結(jié)果

響應面設計及試驗結(jié)果見表4。

表4 響應面優(yōu)化試驗結(jié)果

2.2.2 回歸模型方差分析結(jié)果

對實驗結(jié)果進行回歸分析，并對各因素回歸擬合后得到如下回歸方程：Y=92.80+2.67A-1.92B-1.17C-1.08D+0.50AB+0.75AC+3.25AD-0.50BC+0.25BD+0.25CD-5.15A2-7.02B2-2.40C2-3.03D2

對此回歸模型進行方差分析，結(jié)果見表5。由表5可得出回歸模型R2=0.9736，由方差分析可知回歸模型的p值＜0.01，說明此回歸方程模型差異極顯著，模型實際值與預測值擬合較好。失擬項p=0.2535＞0.05，不顯著，試驗誤差較小。四個因素中蔗糖、檸檬酸、黃原膠及發(fā)酵液添加量為極顯著，由F值可知各因素對感官評分影響的強弱為發(fā)酵液添加量＞檸檬酸添加量＞蔗糖添加量＞黃原膠添加量。

經(jīng)Design-expert軟件對回歸方程的分析，得到藜麥發(fā)酵飲料最佳配方為：蔗糖添加量5.33%，檸檬酸添加量0.032%，黃原膠添加量0.14%，蔗糖添加量5%，發(fā)酵液添加量50.16%，考慮到實際可行性調(diào)整為蔗糖添加量5%，檸檬酸添加量0.03%，黃原膠添加量0.15%，發(fā)酵液添加量50%，此時產(chǎn)品感官評分為93，與預測值相接近，表明此配方具有可行性。

2.3 γ-氨基丁酸發(fā)酵飲料色譜圖及標準曲線

采用液相色譜法對GABA（γ-氨基丁酸）進行分析，圖5為GABA標準品的色譜圖。從圖5中我們可以看出，GABA的保留時間為5.8 min左右，標準品色譜圖中目標峰分離效果好，峰型對稱。圖6為發(fā)酵飲料色譜圖，GABA的保留時間為5.7 min左右，圖中可以看出GABA發(fā)酵飲料中可檢測物質(zhì)種類較多，但是GABA與各物質(zhì)可以清晰、有效地分離并且峰型較好。說明該高效液相方法可以用于GABA檢測并計算其含量。

圖5 GABA標準品色譜圖

圖6 發(fā)酵飲料的色譜圖

標準曲線是以GABA標準品濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標所繪制的，如圖7所示。由圖7得到回歸方程為Y=8853X-3.2011，線性相關系數(shù)R2=0.9998，當 GABA 濃度在（0.005～0.1）mg/mL 范圍內(nèi)線性良好，經(jīng)計算發(fā)酵飲料中GABA含量為0.625 mg/mL

圖7 GABA標準曲線

表5 回歸模型及方差分析

2.4 藜麥發(fā)酵飲料感官評定及衛(wèi)生學指標測定

2.4.1 藜麥發(fā)酵飲料衛(wèi)生學檢測指標

按照國家標準對藜麥發(fā)酵液中菌落總數(shù)和大腸菌群進行檢測，檢測結(jié)果如表6所示。

表6表明本試驗制得的藜麥發(fā)酵飲料的清潔狀態(tài)較好，符合國家衛(wèi)生標準，可以放心飲用。

2.4.2 藜麥發(fā)酵飲料理化指標

按照國家標準，藜麥發(fā)酵飲料pH和酒精度檢測結(jié)果如表7所示。

表6 藜麥發(fā)酵液中菌落總數(shù)和大腸菌群的含量

表7 藜麥發(fā)酵飲料pH和酒精度檢測結(jié)果

2.4.3 藜麥發(fā)酵飲料感官評定

本試驗所研制的藜麥發(fā)酵飲料經(jīng)過10名專業(yè)食品感官評價人員的感官評定，評分結(jié)果表明本試驗制得的藜麥發(fā)酵飲料口感較好，可被大眾接受。

3 結(jié)論及展望

本試驗利用響應面法對藜麥發(fā)酵飲料配方進行優(yōu)化，得到最佳配方為蔗糖添加量5%，檸檬酸添加量0.03%，黃原膠添加量0.15%，發(fā)酵液添加量50%。此條件下測得成品中GABA含量為0.625mg/mL，該產(chǎn)品口感酸甜適中，既有藜麥和乳酸菌發(fā)酵后獨特的風味，也有一定功能性，試驗為藜麥產(chǎn)品的開發(fā)奠定了基礎，具有一定的應用前景和實際意義。

藜麥經(jīng)過發(fā)酵后，會產(chǎn)生許多發(fā)酵殘渣，這些殘渣中也含有很多營養(yǎng)物質(zhì)。如果直接將這些殘渣丟棄，會造成很大的資源浪費，為了避免這種資源浪費，可將其用于藜麥餅干、代餐粉等產(chǎn)品開發(fā)，以期達到合理利用藜麥資源并創(chuàng)造更大經(jīng)濟效益目的。