蘭州百合和大花卷丹遠緣雜交胚挽救技術研究

尹燕 楊道蘭 馮煒弘 ?；坻? 李愛兵 何瀟 王璐

摘要：利用蘭州百合與大花卷丹進行正反交，研究了花期調控、不同授粉方式、蒴果采收時間及胚挽救培養(yǎng)基配方對雜種胚萌發(fā)率及成苗率的影響。結果表明，蘭州百合延后種植及大花卷丹提前種植，可有效地解決花期不遇的問題;蘭州百合與大花卷丹雜交授粉時，花期授粉的蒴果膨大率可達93.3%，種子有胚率為2.00%;大花卷丹與蘭州百合雜交授粉時，切割柱頭的授粉膨大率最高，僅為7.6%，但種子有胚率為0%。蘭州百合與大花卷丹雜交授粉后60～70 d的蒴果進行胚培養(yǎng)較為適宜。蘭州百合與大花卷丹的雜交胚適宜培養(yǎng)基為MS+0.3 mg/LNAA+0.2 mg/L6-BA。

關鍵詞：蘭州百合;大花卷丹;遠緣雜交;胚挽救

中圖分類號：S644.1 ? ? ? ? ? ?文獻標志碼：A ? ? ? ? ? ?文章編號：1001-1463（2022）04-0029-05

doi：10.3969/j.issn.1001-1463.2022.04.006

Study on the Embryo Rescue Techniques of the Distant Hybrids of Lilium davidii var. unicolor and Lilium leichtlinii var. maximowiczii

YIN Yan， YANG Daolan， FENG Weihong， NIU Huiting， LI Aibing， HE Xiao，WANG Lu

（Lanzhou Agricultural Science and Technology Research Extension Center， Lanzhou Gansu 730000， China）

Abstract：The effects of flowering regulation， different pollination methods， capsule harvesting time and embryo rescue medium formula on the germination rate and seedling rate of hybrid embryos were studied by positive and negative cross between Lilium davidii var. unicolor and Lilium leichtlinii var. maximowiczii. The results showed that delayed planting at different time points of low temperature storage during cold storage of Lilium davidii var. unicolor and early planting protection measures of Lilium leichtlinii var. maximowiczii could effectively resolve the problem of flowering; Flowering pollination can be used in hybrid pollination of Lilium davidii var. unicolor × Lilium leichtlinii var. maximowiczii， capsule expansion rate can reach 93.3%， the embryo rate of seeds ?was 20‰; while Lilium leichtlinii var. maximowiczii hybrided with Lilium davidii var. unicolor， the expansion rate of cutting stigma pollination was the highest， only 7.6%， but the embryo rate of seeds was 0%; It was more suitable for embryo culture of capsules 60 d～70 d after pollination by Lilium davidii var. unicolor × Lilium leichtlinii var. maximowiczii; the optimum medium for the hybrid embryos of Lilium davidii var. unicolor hybirded with Lilium leichtlinii var. maximowiczii was MS+0.3 mg/L NAA+0.2 mg/L 6-BA.

Key words：Lilium davidii var. unicolor;Lilium leichtlinii var. maximowiczii;Distant hybridization;Embryo rescue

蘭州百合（Lilium davidii var. unicolor）作為我國三大主栽食用品種[龍牙百合（Lilium brownie var.viridulum Baker）、 宜興百合（Lilium lancifolium Thunb）、蘭州百合（Lilium davidii var. unicolor）]之一 [1- 2 ]，因其較高的含糖量、獨特的風味 [3 - 4 ]，成為了食用百合中的佼佼者。隨著蘭州百合產(chǎn)業(yè)近些年來的向好發(fā)展[5 ]，一些突出問題也已顯現(xiàn)，主要表現(xiàn)在產(chǎn)量低、品種退化嚴重、千字頭多、黃化現(xiàn)象嚴重等方面[6 - 8 ]，要從根本上解決這些問題，還需要源源不斷地選育新品種。耿興敏等[9 ]研究了蘭州百合/大花卷丹、大花卷丹/蘭州百合采用延遲授粉和切割柱頭授粉的有胚率和萌發(fā)率，但未對雜交后代進行胚挽救技術研究。我們選用蘭州百合和長勢強、產(chǎn)量高的藥食兩用的大花卷丹為研究材料，通過花期調控、不同的授粉方式、蒴果采收時間及胚挽救培養(yǎng)基優(yōu)化，以期探索一套可行的胚挽救技術，為食用百合的遠緣雜交提供技術支撐。

1 ? 材料與方法

1.1 ? 試驗材料

供試的蘭州百合（Lilium davidii var. unicolor）和大花卷丹（Lilium leichtlinii var. maximowiczii），均種植在蘭州市榆中縣新營鄉(xiāng)百合種質資源基地。

1.2 ? 試驗方法

1.2.1 ? 百合花期調控 ? 2018年及2019年的種植試驗表明，當年4月15日種植蘭州百合和大花卷丹，蘭州百合的花期一般在7月1 — 15日，大花卷丹的花期一般在7月15 日至 8月15日，百合雜交授粉時2種百合花期無法相遇。因此采用蘭州百合冷庫低溫貯存延后種植及大花卷丹保護措施提前種植方法，具體方法見表1。

1.2.2 ? ?百合雜交授粉方法比較 ? ?參照李潤根[10 ]的方法并作部分修改。采用花期授粉、蕾期授粉、切割柱頭授粉[11 ]、混合蒙導授粉4種方法進行授粉。開花前1 d將雜交母本去雄，隨后立即用錫箔紙將母本的柱頭進行包裹，以免受到其他植株花粉的干擾。授粉時間選取在當天開花的8：00 — 12：00時，待母本的柱頭有大量粘液分泌時，將雜交父本當天開放的花粉授予母本柱頭上，隨后繼續(xù)用錫箔紙將其母本的柱頭包裹。授粉20 d后統(tǒng)計雜交蒴果膨大率，蒴果膨大情況參照李婕等[12 ]的方法并作修改，如表2所示。當蒴果皮開始變黃時，統(tǒng)計有胚率。

蒴果膨大率=[（C2+C3+C4）/授粉花朵數(shù)]×100%

有胚率=（有胚種子數(shù)/總種子數(shù)）×100%

1.2.3 ? ?蒴果不同采收時間對雜交胚萌發(fā)的影響

百合雜交授粉的試驗結果表明，大花卷丹與蘭州百合雜交授粉的種子有胚率為0，因此選用蘭州百合與大花卷丹雜交后的蒴果。在蘭州百合與大花卷丹雜交授粉后30、40、50、60、70 d各采收蒴果30個，采用子房分段培養(yǎng)的方法[13 ]，將切段子房接種在MS+0.2 mg/L NAA+0.6 mg/L 6-BA+蔗糖30 g/L+瓊脂4 g/L，pH 5.8培養(yǎng)基上。150 d后調查胚萌發(fā)率，并將已萌發(fā)的胚珠繼續(xù)接種在MS+ 0.2 mg/L NAA+0.6 mg/L 6-BA+蔗糖30 g/L+瓊脂4 g/L，pH 5.8培養(yǎng)基，培養(yǎng)60 d后統(tǒng)計成苗率。

萌發(fā)率=（萌發(fā)的個數(shù)/接種胚珠數(shù)）×100%（統(tǒng)計得到每個膨大蒴果內胚珠個數(shù)平均為300個）

成苗率=（成苗的個數(shù)/接種胚珠數(shù)）×100%

1.2.4 ? ?不同激素配比對雜交胚萌發(fā)的影響 ? ? 摘取授粉60 d的蘭州百合與大花卷丹的雜交蒴果，采用子房分段培養(yǎng)的方法[13 ]，將切段子房接種在添加不同配比NAA與6-BA的MS培養(yǎng)基上，NAA濃度設置為0.1、0.3、0.5 mg/L，6-BA濃度設置為0.2、0.4、0.8 mg/L。150 d后調查胚的萌發(fā)率，將已萌發(fā)的胚珠繼續(xù)接種在最適的胚萌發(fā)培養(yǎng)基上，60 d統(tǒng)計成苗率。胚萌發(fā)率及成苗率計算方法同1.2.3。

1.2.5 ? ?數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 ? ?試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2007與SPSS 7.0軟件分析。

2 ? 結果與分析

2.1 ? 百合花期調控技術評價

由表3可以看出， 4月15日、5月1日、5月15日3個不同時間節(jié)點種植蘭州百合，可保證在7月1日至8月15日均有蘭州百合開花; 4月1日、4月15日2個時間點種植大花卷丹，可使大花卷丹在7月1日至8月15日均可開花。因此，蘭州百合冷庫低溫貯存不同時間點延后種植及大花卷丹保護措施提前種植，可有效地解決花期不遇的難點，可從源頭上保障雜交授粉的可行性。

2.2 ? 不同授粉方式對百合雜交結實率的影響

由表4可知， 各種授粉方式均能使蘭州百合/大花卷丹、大花卷丹/蘭州百合雜交蒴果膨大，但子房膨大率存在較大差別。蘭州百合與大花卷丹雜交授粉的子房膨大率為82.6%～94.5%，而大花卷丹與蘭州百合雜交授粉膨大率僅為4.4%～7.5%。

蘭州百合/大花卷丹無論采用哪種授粉方式，子房膨大率均在82.6%以上，種子有胚率均在2.00%左右。其中子房膨大率以切割柱頭授粉最高，達到了94.5%;蕾期授粉最低，為82.6%。子房膨大率各處理間差異顯著。各處理的種子有胚率從小到大依次為切割柱頭、花期授粉、蕾期授粉和混合萌導授粉，但花期授粉、蕾期授粉、混合萌導授粉差異不顯著，從授粉的便利性考慮，可選擇花期授粉。

2.3 ? 蒴果不同采收時間對雜種胚萌發(fā)的影響

由圖1可知，隨著蒴果采收時間的延后，胚萌發(fā)率及成苗率均有提高，授粉后70 d采收的蒴果，經(jīng)培養(yǎng)后的胚萌發(fā)率及成苗率均達到最高，分別為1.356%和1.267%，授粉后60 d采收的蒴果經(jīng)培養(yǎng)后萌發(fā)率及成苗率與授粉后70 d差別不大。經(jīng)試驗觀察，授粉70 d之后蒴果已經(jīng)干枯，種子含水量較低，子房切片時不宜操作，故選擇授粉后60～70 d的雜交蒴果進行胚培養(yǎng)較為適宜。

2.4 ? 不同激素配比對雜交胚萌發(fā)的影響

由表5可知，蘭州百合與大花卷丹雜交胚在不同激素配比的MS 培養(yǎng)基上萌發(fā)率和成苗率有較大差異。NAA濃度為0.3 mg/L時，蘭州百合與大花卷丹雜交胚的萌發(fā)率及成苗率要高于NAA其他濃度。當NAA濃度一致、6-BA 濃度為0.8 mg/L時，蘭州百合與大花卷丹雜交胚的萌發(fā)率及成苗率低于其他2個6-BA 濃度。當NAA濃度為0.3 mg/L，6-BA 濃度為0.2 mg/L時，胚萌發(fā)率及成苗率均達到了最大?？梢?，蘭州百合與大花卷丹雜交胚的適宜培養(yǎng)基為MS+0.3 mg/L NAA+0.2 mg/L 6-BA。

3 ? 小結

通過蘭州百合冷庫低溫貯存不同時間點延后種植及大花卷丹保護措施提前種植，可有效地解決花期不遇的難點，從而從源頭上保障了雜交授粉的可行性。蘭州百合與大花卷丹雜交授粉時，可采用花期授粉，蒴果膨大率可達93.3%，種子有胚率為2.00%;大花卷丹與蘭州百合雜交授粉時，切割柱頭授粉膨大率最高，為7.5%，但種子有胚率為0%;

從種子有胚率來看，蘭州百合/大花卷丹組合無論哪種授粉方式，種子有胚率均在2.00%左右，而大花卷丹/蘭州百合組合的種子有胚率均為0。耿興敏等[9 ]在研究野生百合組間雜交時也發(fā)現(xiàn)，大花卷丹與蘭州百合雜交種子有胚率為0，蘭州百合與大花卷丹通過延遲授粉種子有胚率為2.4%，與本研究基本相一致。耿興敏等[9 ]研究發(fā)現(xiàn)，大花卷丹/蘭州百合通過延遲授粉，子房膨大率可達80%，切割柱頭授粉的子房膨大率為50%;蘭州百合/大花卷丹通過延遲授粉，子房膨大率為92.5%，而切割柱頭未觀察到子房膨大現(xiàn)象。上述結果與本研究結果相差較大，原因可能是與授粉方式與授粉時間有關。

采用蘭州百合與大花卷丹雜交授粉后60～70 d的蒴果進行胚培養(yǎng)較為適宜。雷家軍等[14 ]在研究百合種間雜種胚培養(yǎng)時，發(fā)現(xiàn)50 d蒴果雖已干枯，但萌發(fā)率及成苗率仍然較高，與本實驗結果一致。

蘭州百合與大花卷丹的雜交胚適宜培養(yǎng)基為MS+0.3 mg/L NAA+0.2 mg/L 6-BA。

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收稿日期：2021 - 12 - 30

基金項目：蘭州市人才創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項目（2020-RC-144）;隴原青年創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)人才項目（2022）。

作者簡介：尹 ? 燕（1983 — ），女，甘肅金昌人，農(nóng)藝師，碩士，研究方向為種質資源選育與采后生物學。Email：544895391@qq.com 。

作者簡介：楊道蘭（1970 — ），女，甘肅皋蘭人，農(nóng)藝師， 研究方向為蔬菜育種。Email：875516380@qq.com。