miR-29c-3p與缺血性腦卒中患者疾病嚴(yán)重程度及短期預(yù)后的關(guān)系

張玲，趙小輝，王洪志，耿彪

缺血性腦卒中是因腦組織缺血缺氧導(dǎo)致的腦組織病變壞死，進(jìn)而引起神經(jīng)功能缺損的一種疾病。其致死致殘率極高，發(fā)病3個(gè)月內(nèi)的病死率為9%，病情進(jìn)展迅速，影響預(yù)后[1-2]。因此，及時(shí)了解患者病情進(jìn)展并進(jìn)行有效評估對于臨床治療策略的調(diào)整和預(yù)后評估具有重要意義。微小RNA(miR)是一種小型的非編碼RNA，在疾病的發(fā)生和發(fā)展中扮演重要的角色，miR調(diào)節(jié)功能障礙與急性心肌梗死、急性腦梗死等多種疾病有關(guān)，但miR-29c-3p在缺血性腦卒患者病情發(fā)生發(fā)展的作用尚不清楚[3-4]?；诖?，本研究以本院126缺血性腦卒中患者作為研究對象，檢測其miR-29c-3p表達(dá)，分析其表達(dá)與病情程度及短期預(yù)后的關(guān)系，旨在為臨床病情程度及預(yù)后評估提供指導(dǎo)依據(jù)，進(jìn)而指導(dǎo)臨床治療及干預(yù)，以期改善預(yù)后，提高患者生活質(zhì)量。

1 對象與方法

1.1 對象及分組 選取2019年1月至2019年12月我院收治的126例經(jīng)頭顱MRI確診為缺血性腦卒中的患者作為觀察組，其中男性71例，女性55例；年齡47～78歲，平均(59.32±3.26)歲。采用NIHSS[5]對缺血性腦卒中患者進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評分，根據(jù)患者神經(jīng)功能缺損嚴(yán)重程度將患者分為輕度組(NIHSS評分<7分，42例)、中度組(NIHSS評分7～15分，46例)、重度組(NIHSS評分>15分，38例)。隨訪6個(gè)月內(nèi)患者預(yù)后情況，采用mRS評分評估患者短期預(yù)后情況，將患者分為預(yù)后良好組(mRS評分0～2分，89例)和預(yù)后不良組(mRS評分3～5分，37例)。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合第四屆腦血管病學(xué)術(shù)會議修訂的腦卒中診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]，經(jīng)頭顱MRI確認(rèn)為缺血性腦卒中；(2)臨床資料完整；(3)患者或家屬知情且簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并嚴(yán)重心、肝、腎疾病者；(2)既往精神疾病史；(3)其他原因?qū)е碌纳窠?jīng)功能缺損。選取同期體檢正常的80名健康者作為對照組，其中男性46人，女性34人；年齡45～79歲，平均(59.21±3.47)歲。本研究獲保定市第二中心醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 miR-29c-3p水平的檢測方法 取患者空腹靜脈血約5 ml，于-80 ℃保持待測。離心取血清后，標(biāo)本加入TRIzol全血，使用美國Invitrogen公司RNA提取試劑盒，提取總RNA。使用TakaRa改善反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，使用上海生工生物工程有限公司熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，相關(guān)操作嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。miR-29c-3p引物序列為：上游引物為5′-CAA ACA AAG-GAC CAA GAA ATT-3′，下游引物為5′-UUU CUU G-GUC CUU UGU UUG T-3′。反應(yīng)條件為95 ℃ 30 s預(yù)變性、95 ℃ 5 s變性60 ℃ 44 s，共40個(gè)循環(huán)，于61 ℃時(shí)采集熒光，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測其表達(dá)量。以內(nèi)源性U6 小核RNA進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，引物序列設(shè)計(jì)如下：正向5′-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3′；反向 5′-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3′。通過 2-△△ct方法計(jì)算miR-29c-3p相對表達(dá)量。

1.2.2 臨床資料采集 采集入組對象年齡、性別、病史等情況，使用日本歐姆龍血壓測量儀測量其舒張壓、收縮壓，采用日立7600-010全自動(dòng)生化分析儀檢測血清總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、空腹血糖(GLU)、超敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)水平。

2 結(jié) 果

2.1 兩組一般資料的比較 見表1。觀察組患者高血壓的比例及hs-CRP、GLU水平明顯高于對照組，而miR-29c-3p相對表達(dá)量明顯低于對照組(均P<0.05)。

表1 兩組患者一般資料比較[ x±s,例(%)]項(xiàng)目觀察組(n=126)對照組(n=80)t/χ2值P值年齡(歲)59.32±3.2659.21±3.470.2300.818性別(男)71(56.35)46(57.50)0.0260.871高血壓99(78.57)45(56.25)6.3860.011糖尿病40(31.75)23(28.75)0.2070.649舒張壓(mmHg)87.35±9.4685.24±9.331.5620.120LDL-C(mmol/L)2.92±0.742.86±0.650.5940.553HDL-C(mmol/L)1.57±0.481.63±0.520.8460.398TG(mmol/L)1.84±0.511.85±0.530.1350.893TC(mmol/L)4.95±1.234.87±1.210.4580.648同型半胱氨酸(μmol/L)16.03±4.3915.37±4.281.0620.290hs-CRP(mg/L)7.14±2.232.89±0.6216.6300.000GLU(mmol/L)6.15±1.745.29±1.433.6980.000miR-29c-3p相對表達(dá)量0.83±0.261.05±0.335.3230.000 注:1mmHg=0.133kPa

2.2 不同神經(jīng)功能缺損嚴(yán)重程度患者間miR-29c-3p表達(dá)的比較 見表2。不同神經(jīng)功能缺損嚴(yán)重程度患者間miR-29c-3p表達(dá)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，重度組患者miR-29c-3p相對表達(dá)量明顯低于中度組和輕度組(均P<0.05)。

2.3 不同預(yù)后患者臨床資料的比較 見表3。預(yù)后不良組患者糖尿病的比例及NIHSS評分、hs-CRP、GLU水平均明顯高于預(yù)后良好組，miR-29c-3p相對表達(dá)量明顯低于預(yù)后良好組(均P<0.05)。

表2 不同神經(jīng)功能缺損嚴(yán)重程度患者間miR-29c-3p表達(dá)的比較組別例數(shù)miR-29c-3p相對表達(dá)量輕度組420.86±0.24中度組460.71±0.22?重度組380.56±0.13?△F值21.399P值<0.01 注:與輕度組比較?P<0.05;與中度組比較△P<0.05

表3 預(yù)后良好和預(yù)后不良患者臨床資料的比較[ x±s,例(%)]臨床資料預(yù)后良好組(n=89)預(yù)后不良組(n=37)t/χ2值P值年齡(歲)59.28±3.4660.13±3.451.2570.211性別(男性)46(51.69)25(67.57)2.6800.102高血壓56(62.92)24(64.86)0.0430.837糖尿病28(31.46)20(54.05)5.6570.017舒張壓(mmHg)140.35±24.19146.57±25.321.2970.197NIHSS評分(分)4.31±1.229.26±2.3415.5570.000血脂異常26(29.21)12(32.43)0.1290.720TG(mmol/L)1.84±0.521.92±0.560.7690.443TC(mmol/L)4.52±1.334.63±1.380.4180.677HDL-C(mmol/L)1.14±0.321.26±0.391.7950.075LDL-C(mmol/L)2.96±0.723.04±0.850.5380.592hs-CRP(mg/L)4.16±1.237.08±1.1112.4770.000GLU(mmol/L)5.24±1.396.37±1.454.1040.000miR-29c-3p相對表達(dá)量0.87±0.230.58±0.166.9910.000 注:1mmHg=0.0133kPa

2.4 miR-29c-3p對缺血性腦卒中患者短期預(yù)后的預(yù)測價(jià)值 見圖1。以miR-29c-3p為自變量，不良預(yù)后為因變量，繪制ROC曲線，結(jié)果顯示，miR-29c-3p相對表達(dá)量截?cái)嘀禐?.78時(shí)，預(yù)測缺血性腦卒中患者短期預(yù)后的ROC曲線下面積為0.76(95%CI：1.236～3.472)此時(shí)的敏感度和特異度分別為78.45%和68.39%。

圖1 miR-29c-3p預(yù)測缺血性腦卒中患者短期預(yù)后的ROC曲線

2.5 缺血性腦卒中患者短期預(yù)后的多因素COX回歸分析 見表4。對缺血性腦卒中短期預(yù)后相關(guān)因素進(jìn)行多因素Logistic回歸分析，結(jié)果顯示，糖尿病(OR=3.111，95%CI：1.283～7.545)、NIHSS評分(OR=3.442，95%CI：1.297～9.135)、hs-CRP(OR=3.149，95%CI：1.044～9.492)、miR-29c-3p(OR=3.187，95%CI：1.353～7.505)是缺血性腦卒中患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

表4 缺血性腦卒中患者短期預(yù)后的多因素COX回歸分析相關(guān)因素賦值BSEWaldχ2P值OR值95%CI糖尿病0=否,1=是1.1350.4526.3050.0123.1111.283～7.545NIHSS評分0=輕度,1=中重度1.2360.4986.1600.0133.4421.297～9.135hs-CRP0=正常,1=高于正常值上限1.1470.5634.1510.0423.1491.044～9.492miR-29c-3p相對表達(dá)量0=低表達(dá),1=高表達(dá)1.1590.4377.0340.0083.1871.353～7.505 注:miR-29c-3p相對表達(dá)量的截?cái)嘀等?.78

3 討 論

隨著我國人口老齡化發(fā)展，缺血性腦卒中的患病率和病死率逐漸升高，且患者多合并不同程度肢體功能障礙[6-9]。缺血性腦卒中對患者健康安全及生活質(zhì)量造成嚴(yán)重影響。影像學(xué)檢查可對神經(jīng)功能缺損進(jìn)行有效評估，但對于TIA或神經(jīng)缺損存在一定局限性。及時(shí)、有效的病情程度評估指標(biāo)對于臨床治療及預(yù)后具有重要意義[10-11]。既往研究[12]報(bào)道，急性腦梗死患者CSF miR-29c-3p表達(dá)異常下降。本次研究通過檢測外周血清樣本發(fā)現(xiàn)，缺血性腦卒中患者miR-29c-3p表達(dá)低于健康人群，同時(shí)miR-29c-3p缺血性腦卒中患者神經(jīng)功能缺損嚴(yán)重程度及短期預(yù)后密切相關(guān)，其水平表達(dá)可作為缺血性腦卒中患者疾病嚴(yán)重程度及短期預(yù)后的重要評估指標(biāo)，具有較高臨床應(yīng)用價(jià)值。

本次研究結(jié)果顯示，缺血性腦卒中患者高血壓的比例及hs-CRP、GLU水平顯著高于健康對照者，而miR-29c-3p相對表達(dá)量明顯低于健康對照者，說明高血壓、hs-CRP、GLU、miR-29c-3p與缺血性腦卒中發(fā)病有關(guān)。究其原因，缺血性腦卒中發(fā)病后腦組織缺氧缺血，釋放大量氧自由基、粒細(xì)胞活化等引起炎癥反應(yīng)急劇腦水腫，進(jìn)而引起神經(jīng)細(xì)胞損失和凋亡，進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)功能缺損[12-13]。高血壓可導(dǎo)致血管調(diào)節(jié)功能障礙，引起腦動(dòng)脈粥樣硬化，參與腦梗死發(fā)病。高血糖可引起脂質(zhì)代謝紊亂，加重腦梗死，進(jìn)一步導(dǎo)致腦組織缺血，在腦血管疾病中發(fā)揮重要作用[14-15]。hs-CRP是炎癥反應(yīng)的敏感指標(biāo)，其水平升高，促炎因子大量釋放，進(jìn)而引起神經(jīng)元損失，參與缺血性腦卒中發(fā)病過程。miR-29c-3p在神經(jīng)系統(tǒng)疾病患者血清中異常表達(dá)，miR-29c-3p表達(dá)上調(diào)時(shí)，大鼠認(rèn)知功能得到改善，證實(shí)其表達(dá)與神經(jīng)功能有關(guān)[16-17]。

NIHSS評分是評估神經(jīng)功能缺損嚴(yán)重程度的有效方法，其評分越高，患者神經(jīng)功能缺失越嚴(yán)重。本研究中，重度神經(jīng)功能缺損患者miR-29c-3p相對表達(dá)量顯著低于中度神經(jīng)功能缺損和輕度神經(jīng)功能缺損，miR-29c-3p表達(dá)隨神經(jīng)功能缺損嚴(yán)重程度的增加而降低，說明miR-29c-3p與神經(jīng)功能缺損嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系；其表達(dá)與缺血性腦卒中患者神經(jīng)功能缺損嚴(yán)重程度密切相關(guān)，提示miR-29c-3p可作為評估缺血性腦卒中患者病情嚴(yán)重程度的預(yù)測指標(biāo)。這與相關(guān)研究[16-17]中當(dāng)miR-29c-3p上調(diào)時(shí)，神經(jīng)功能缺損得到改善的報(bào)道一致。mRS是評估腦卒中后患者神經(jīng)功能恢復(fù)狀況的指標(biāo)，評分越高，患者神經(jīng)恢復(fù)越好，將其作為短期預(yù)后評估指標(biāo)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，預(yù)后不良組患者糖尿病的比例及NIHSS評分、hs-CRP、GLU水平均明顯高于預(yù)后良好組，而miR-29c-3p表相對達(dá)量明顯低于預(yù)后良好組，說明缺血性腦卒中患者短期預(yù)后與合并糖尿病、NIHSS評分、hs-CRP、GLU、miR-29c-3p表達(dá)下調(diào)有關(guān)。究其原因，合并糖尿病者機(jī)體脂糖代謝紊亂，GLU水平升高，可導(dǎo)致血管粥樣硬化，進(jìn)一步加劇腦組織缺氧缺血，加重病情。神經(jīng)功能缺失越嚴(yán)重表明腦組織受損越嚴(yán)重，病情進(jìn)一步發(fā)展，則預(yù)后較差。miR通過調(diào)節(jié)目標(biāo)基因的表達(dá)來發(fā)揮作用，可通過結(jié)合特定的序列來抑制miR的轉(zhuǎn)錄或促進(jìn)miR的降解[18]。miR-29c-3p是來自于腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞間質(zhì)細(xì)胞，可通過調(diào)控相關(guān)蛋白通路參與腫瘤相關(guān)疾病的發(fā)生、發(fā)展。近年來研究[19-20]發(fā)現(xiàn)，miR-29c-3p可通過調(diào)控STAT3信號通路參與腦梗死等腦血管疾病發(fā)病過程。miR-29c-3p表達(dá)下調(diào)可提升SH-SY5Y細(xì)胞STAT3的磷酸化水平，并促進(jìn)STAT3激活促進(jìn)神經(jīng)祖細(xì)胞的神經(jīng)膠質(zhì)分化，抑制神經(jīng)細(xì)胞的神經(jīng)元分化，進(jìn)而參與CNS調(diào)節(jié)。但STAT3過度激活會導(dǎo)致神經(jīng)膠質(zhì)過度分化，促進(jìn)神經(jīng)祖細(xì)胞神經(jīng)元分化，引起神經(jīng)元細(xì)胞損傷，進(jìn)而影響患者認(rèn)知功能，參與腦神經(jīng)損傷過程。隨著病情進(jìn)一步發(fā)展，神經(jīng)元細(xì)胞受損加劇，神經(jīng)功能缺損嚴(yán)重程度加重，影響患者預(yù)后。因此，miR-29c-3p表達(dá)下調(diào)與缺血性腦卒中短期預(yù)后密切相關(guān)。這與相關(guān)研究[21-22]中miR-29c-3p表達(dá)下調(diào)可通過影響神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分化影響腦梗死患者認(rèn)知障礙功能的報(bào)道具有一致性。

另外，對缺血性腦卒中患者短期預(yù)后相關(guān)因素進(jìn)行多因素Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，合并糖尿病、NIHSS評分>7分、CRP高于正常水平、miR-29c-3p表達(dá)下調(diào)是缺血性腦卒中預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。ROC曲線結(jié)果顯示，miR-29c-3p相對表達(dá)量截?cái)嘀禐?.78時(shí)，預(yù)測缺血性腦卒中短期預(yù)后的ROC曲線下面積為0.76(95%CI：1.236～3.472)，此時(shí)的敏感度和特異度分別為78.45%和68.39%。說明miR-29c-3p是缺血性腦卒中患者短期預(yù)后的獨(dú)立影響因素，其表達(dá)下調(diào)對缺血性腦卒中患者預(yù)后評估具有較好預(yù)測價(jià)值。由于本研究的樣本量較小，預(yù)后評估周期較短，miR-29c-3p在缺血性腦卒中患者遠(yuǎn)期預(yù)后評估中的作用還需擴(kuò)大樣本進(jìn)一步探究，完善其作為缺血性腦卒中患者神經(jīng)功能缺損程度和短期預(yù)后的評估指標(biāo)，為臨床病情程度及預(yù)后評估提供參考。

綜上所述，miR-29c-3p低表達(dá)是缺血性腦卒中患者神經(jīng)功能缺損的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，患者神經(jīng)功能缺損越嚴(yán)重，miR-29c-3p表達(dá)量越低。miR-29c-3p表達(dá)水平可為缺血性腦卒中患者病情及預(yù)后的評估提供指導(dǎo)依據(jù)，有助于臨床診療方案的制訂。