微小RNA-7調(diào)節(jié)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子/α-突觸核蛋白軸對帕金森病細(xì)胞模型細(xì)胞凋亡的影響

李云，單艷華，劉永萍，趙鵬

帕金森病(PD)是僅次于Alzheimer’s病的第二大神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，多發(fā)于中老年，主要癥狀是運動緩慢、肌肉僵硬等，對社會和家庭的影響甚大[1]。目前，PD患者不能被治愈，只能采取藥物控制，且長時間使用藥物會導(dǎo)致患者并發(fā)癥的產(chǎn)生。以往的研究[2]表明，PD的發(fā)展進程與細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙關(guān)系密切。因此，研究PD的發(fā)病機制、尋找合適的靶點對PD患者的臨床治療來說是非常重要的。微小RNA(miR)不僅參與腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)進程，還與PD等神經(jīng)系統(tǒng)疾病有關(guān)，主要參與調(diào)控細(xì)胞自噬、凋亡等過程。周巍等[3]研究表明，miR-221在PD細(xì)胞模型中低表達，過表達miR-221可顯著抑制PD細(xì)胞模型的凋亡、自噬。劉金泉等[4]研究表明，miR-34a低表達可通過靶向調(diào)控沉默信息調(diào)控因子1表達，抑制PD模型細(xì)胞調(diào)亡以及氧化應(yīng)激損傷。徐向玲等[5]通過實驗發(fā)現(xiàn)，過表達miR-103a-3p通過靶向鈣調(diào)蛋白1表達促進MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞存活并抑制凋亡。miR-7與神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)展有關(guān)，其在腦組織中表達升高[6]。有研究[7]表明，α-突觸核蛋白(α-syn)的異常表達是導(dǎo)致PD發(fā)病的原因之一，miR-7則能調(diào)控α-syn的表達水平。然而，目前對于miR-7在PD中的分子作用機制還不完全清楚。據(jù)報道[8]，腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)和α-syn均與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和PD的發(fā)病機理有關(guān)。BDNF能夠影響海馬體的發(fā)育，從而對學(xué)習(xí)和記憶功能產(chǎn)生影響[9]。α-syn過度聚集使細(xì)胞通透性增加，從而導(dǎo)致神經(jīng)元壞死[10]。生物信息學(xué)預(yù)測發(fā)現(xiàn)BDNF是miR-7的潛在靶點，由此推測miR-7可能通過調(diào)節(jié)BDNF表達影響PD的進程。因此，本研究將通過構(gòu)建PD細(xì)胞模型，探討miR-7對PD細(xì)胞模型細(xì)胞凋亡的影響以及其與BDNF和α-syn的作用關(guān)系，為進一步研究PD的分子作用機制提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞與主要試劑 人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。6-羥多巴胺購自上海源葉生物科技有限公司；1-甲基4-苯基吡啶離子(MPP+)和MTT試劑購自美國sigma公司；RPM1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自上海浩然生物技術(shù)公司；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒、qRT-PCR試劑盒購自美國Invitrogen公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自碧云天生物公司；細(xì)胞凋亡試劑盒購自北京天根生物公司；引物、miR-7模擬物或抑制物(miR-7 mimics或anti-miR-7)及陰性對照(miR-NC或anti-miR-NC)、BDNF過表達載體/小干擾RNA(pc-BDNF/si-BDNF)及其對照(pcDNA/si-NC)購自上海生工生物公司；兔抗人BDNF、α-syn、線粒體融合蛋白(Mfn2)、核呼吸因子1(NRF1)、微管相關(guān)蛋白輕鏈3(LC3)Ⅰ、LC3Ⅱ、B淋巴細(xì)胞瘤(Bcl)-2、Bcl-2相關(guān)蛋白(Bax)、裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(cleaved caspase)-3抗體均購自美國賽默飛公司；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗購自美國Santa Cruz公司。

1.1.2 實驗動物、分組及模型制備 本研究涉及的大鼠實驗經(jīng)過本院動物倫理委員會許可。將購自河南中檢檢測技術(shù)有限公司[許可證號：SYXK(豫)2018-0006]的12只健康SPF級雄性SD大鼠(體重160～180 g)隨機分成對照組和模型組，每組6只。

1.2 方法

1.2.1 PD細(xì)胞模型的構(gòu)建 所有大鼠根據(jù)Barata-Antunes等[11]采用的單側(cè)6-羥多巴胺注射法構(gòu)建PD大鼠模型。將人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞在RPM11640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合時，加入100 μmol/L MPP+，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，PD細(xì)胞模型建立完成[12]。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組 采用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒對SH-SY5Y細(xì)胞進行轉(zhuǎn)染，并將其隨機分組為對照組(正常培養(yǎng)，未經(jīng)MPP+誘導(dǎo)細(xì)胞)、MPP+組(100 μmol/L MPP+誘導(dǎo)細(xì)胞)、MPP++miR-NC組(miR-NC轉(zhuǎn)染細(xì)胞后加入100 μmol/L MPP+誘導(dǎo))、MPP++miR-7 mimics組(miR-7 mimics轉(zhuǎn)染細(xì)胞后加入100 μmol/L MPP+誘導(dǎo))、MPP++si-NC組(si-NC轉(zhuǎn)染細(xì)胞后加入100 μmol/L MPP+誘導(dǎo))、MPP++si-BDNF組(si-BDNF轉(zhuǎn)染細(xì)胞后加入100 μmol/L MPP+誘導(dǎo))、miR-NC組(miR-NC轉(zhuǎn)染細(xì)胞)、miR-7 mimics組(miR-7 mimics轉(zhuǎn)染細(xì)胞)、anti-miR-NC組(anti-miR-NC轉(zhuǎn)染細(xì)胞)、anti-miR-7組(anti-miR-7轉(zhuǎn)染細(xì)胞)、MPP++miR-7 mimics+pcDNA組(miR-7 mimics與pcDNA共轉(zhuǎn)染細(xì)胞后加入100 μmol/L MPP+誘導(dǎo))、MPP++miR-7 mimics+pc-BDNF組(miR-7 mimics和pc-BDNF共轉(zhuǎn)染細(xì)胞后加入100 μmol/L MPP+誘導(dǎo))。24 h后，取對數(shù)生長期的各組細(xì)胞進行下一步實驗。

1.2.3 qRT-PCR檢測PD大鼠模型與細(xì)胞模型中miR-7、BDNF和α-syn mRNA表達水平 造模成功后，將大鼠處死，取出其腦組織，于冰上將大鼠左側(cè)黑質(zhì)組織迅速分離，將其制備成組織勻漿，離心，取上清液。提取各組黑質(zhì)組織及細(xì)胞總RNA，檢測濃度后，將其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，并以此為模板，進行PCR擴增。反應(yīng)體系：2 μl模板cDNA，10 μl SYBR mix，正反向引物各0.4 μl，7.2 μl ddH2O；反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性20 s，59 ℃退火25 s，72 ℃延伸25 s，38個循環(huán)。使用2-ΔΔCt方法計算miR-7、BDNF和α-syn mRNA的相對表達水平。所用引物序列見表1。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測PD細(xì)胞模型細(xì)胞凋亡 將各組細(xì)胞消化、洗滌后，制備成細(xì)胞懸液，室溫下依次加入Annexin V-FITC和PI，混勻后，檢測細(xì)胞凋亡情況并計算其凋亡率。

1.2.5 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測miR-7與BDNF的靶向關(guān)系 Target Scan預(yù)測顯示miR-7與BDNF的存在互補的核苷酸位點。分別構(gòu)建野生型載體WT-BDNF和突變型載體MUT-BDNF，并將其轉(zhuǎn)染至SH-SY5Y細(xì)胞，隨機分成四組：WT-BDNF+miR-NC組、WT-BDNF+miR-7 mimics組、MUT-BDNF+miR-NC組、MUT-BDNF+miR-7 mimics組。48 h后，檢測各組SH-SY5Y細(xì)胞的相對熒光素酶活性。

表1 miR-7、BDNF和α-syn引物序列引物名稱序列(5′-3′)miR-7FTGCGGTTCACAGTGGCTAAGRCTCAACTGGTGTCGTGGABDNFFACTATGGTTATTTCATACTTCGGTTRCCATTCACGCTCTCCAGAα-synFGGTGTGGCAACAGTGGCTGAGRAATGCTCCCTGCTCCCTCCACGAPDHFGCAAGTTCAACGGCACAGRGCCAGTAGACTCCACGACATU6FCTCGCTTCGGCAGCACARAACGCTTCACGAATTTGCGT

1.2.6 Western Blotting法檢測相關(guān)蛋白表達 將各組SH-SY5Y細(xì)胞洗滌、裂解后，提取總蛋白，測定濃度后，取20 μg蛋白樣品進行電泳，將其轉(zhuǎn)至PVDF膜，室溫下，封閉1 h，加入BDNF、α-syn、Mfn2、NRF1、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3一抗，4 ℃，培養(yǎng)過夜；加入二抗，2 h后，加入ECL發(fā)光試劑顯影，并分析各組細(xì)胞內(nèi)蛋白表達水平。

1.2.7 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 21.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，兩組間和多組間比較分別采用t檢驗和單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 miR-7、BDNF和α-syn在PD大鼠模型中的表達水平 見表2。與對照組相比，模型組大鼠腦黑質(zhì)組織中miR-7、α-syn mRNA表達水平明顯降低，BDNF mRNA表達水平明顯升高(均P<0.05)。

表2 miR-7、BDNF和α-syn在PD細(xì)胞模型細(xì)胞中的表達比較( x±s,n=6)組別miR-7BDNFmRNAα-synmRNA對照組0.98±0.111.00±0.071.02±0.08模型組0.39±0.06?2.51±0.34?0.43±0.05? 注:與對照組比較?P<0.05

2.2 miR-7、BDNF和α-syn在PD細(xì)胞模型中的表達水平 見表3。與對照組相比，MPP+組細(xì)胞中miR-7、α-syn mRNA表達水平明顯降低，BDNF mRNA表達水平明顯升高(均P<0.05)。

2.3 過表達miR-7或干擾BDNF表達對PD細(xì)胞模型細(xì)胞凋亡的影響 見表4。與對照組相比，MPP+組細(xì)胞凋亡率明顯升高，Bcl-2蛋白表達水平明顯降低，而Bax、cleaved caspase-3蛋白表達水平均明顯升高(均P<0.05)。與MPP+組、MPP++miR-NC組相比，MPP++miR-7 mimics組細(xì)胞凋亡率明顯降低，Bcl-2蛋白表達水平明顯升高，而Bax、cleaved caspase-3蛋白表達水平均明顯降低(均P<0.05)。與MPP+組或MPP++si-NC組相比，MPP++si-BDNF組細(xì)胞凋亡率也明顯降低，Bcl-2蛋白表達水平也明顯升高，而Bax、cleaved caspase-3蛋白表達水平均明顯降低(均P<0.05)。

2.4 過表達miR-7或干擾BDNF表達對PD細(xì)胞模型細(xì)胞中線粒體、自噬相關(guān)蛋白表達的影響 見表5。MPP+組細(xì)胞中miR-7及Mfn、NRF1蛋白表達顯著低于對照組，BDNF、LC3Ⅱ蛋白表達顯著高于對照組(均P<0.05)；與MPP+組和MPP++miR-NC組相比，MPP++miR-7 mimics組細(xì)胞中miR-7及Mfn、NRF1蛋白表達顯著升高，BDNF、LC3Ⅱ蛋白表達顯著降低(均P<0.05)；與MPP+組和MPP++si-NC組相比，MPP++si-BDNF組細(xì)胞中BDNF、LC3Ⅱ蛋白表達顯著下降，Mfn、NRF1蛋白表達顯著升高(均P<0.05)。

表3 miR-7、BDNF和α-syn在PD細(xì)胞模型細(xì)胞中的表達比較( x±s,n=9)組別miR-7BDNFmRNAα-synmRNA對照組1.00±0.081.01±0.091.00±0.05MPP+組0.41±0.03?2.44±0.25?0.45±0.07? 注:與對照組比較?P<0.05

表4 過表達miR-7或干擾BDNF表達對PD細(xì)胞模型細(xì)胞凋亡的影響( x±s,n=9)組別細(xì)胞凋亡率(%)Bcl-2Baxcleavedcaspase-3對照組6.31±0.620.67±0.050.30±0.020.22±0.02MPP+組26.40±2.52?0.26±0.02?0.71±0.06?0.61±0.05?MPP++miR-NC組27.32±2.670.24±0.020.73±0.050.62±0.04MPP++miR-7mimics組12.42±1.25△▲0.56±0.04△▲0.41±0.03△▲0.33±0.02△▲MPP++si-NC組25.97±2.530.22±0.020.72±0.050.64±0.04MPP++si-BDNF組14.21±1.47△○0.51±0.04△○0.47±0.03△○0.37±0.02△○ 注:與對照組比較?P<0.05;與MPP+組比較△P<0.05;與MPP++miR-NC組比較▲P<0.05;與MPP++si-NC組比較○P<0.05

表5 過表達miR-7或干擾BDNF表達對PD細(xì)胞模型細(xì)胞中線粒體、自噬相關(guān)蛋白表達的影響( x±s,n=9)組別miR-7BDNFMfnNRF1LC3ⅠLC3Ⅱ?qū)φ战M0.99±0.070.40±0.030.74±0.060.63±0.050.65±0.050.21±0.02MPP+組0.38±0.03?0.85±0.07?0.32±0.02?0.24±0.02?0.63±0.040.65±0.05?MPP++miR-NC組0.35±0.020.87±0.090.30±0.020.22±0.020.61±0.060.66±0.06MPP++miR-7mimics組0.82±0.07△▲0.60±0.07△▲0.63±0.04△▲0.52±0.03△▲0.64±0.030.34±0.02△▲MPP++si-NC組0.39±0.040.84±0.060.28±0.020.21±0.020.62±0.040.68±0.04MPP++si-BDNF組0.41±0.050.51±0.04△○0.60±0.04△○0.48±0.03△○0.59±0.030.38±0.03△○ 注:與對照組比較?P<0.05;與MPP+組比較△P<0.05;與MPP++miR-NC組比較▲P<0.05;與MPP++si-NC組比較○P<0.05

2.5 抑制miR-7表達對PD細(xì)胞模型細(xì)胞凋亡的影響 見表6。與MPP+組和MPP++anti-miR-NC組相比，MPP++anti-miR-7組細(xì)胞凋亡率明顯增加，Bcl-2蛋白表達下調(diào)，Bax、cleaved caspase-3蛋白表達上調(diào)(均P<0.05)。

2.6 miR-7靶向調(diào)控BDNF的表達 Targetscan軟件預(yù)測結(jié)果顯示，BDNF是miR-7的潛在靶基因，其結(jié)合位點見圖1。與WT-BDNF+miR-NC組相比，WT-BDNF+miR-7 mimics組細(xì)胞相對熒光素酶活性顯著降低(1.00±0.07vs.0.40±0.03)(P<0.05)，而MUT-BDNF+miR-NC組和MUT-BDNF+miR-7 mimics組細(xì)胞相對熒光素酶活性(1.02±0.08, 1.01±0.08)無顯著變化。同時，miR-7 mimics組細(xì)胞中BDNF蛋白表達顯著低于miR-NC組(0.35±0.03vs.1.01±0.05)，而anti-miR-7組BDNF蛋白表達顯著高于anti-miR-NC組(2.47±0.06vs.1.00±0.04)(均P<0.05)，說明BDNF是miR-7的直接靶基因，且BDNF被miR-7負(fù)調(diào)控。

表6 抑制miR-7表達對PD細(xì)胞模型細(xì)胞凋亡的影響( x±s,n=9)組別細(xì)胞凋亡率(%)Bcl-2Baxcleavedcaspase-3MPP+組25.69±2.340.23±0.040.68±0.090.57±0.08MPP++anti-miR-NC組26.82±2.130.25±0.030.65±0.070.59±0.05MPP++anti-miR-7組57.35±5.46?△0.12±0.04?△0.89±0.15?△0.78±0.12?△ 注:與MPP+組比較?P<0.05;與MPP++anti-miR-NC比較△P<0.05

圖1 miR-7與BDNF的結(jié)合位點

2.7 BDNF過表達逆轉(zhuǎn)了miR-7過表達對PD細(xì)胞模型細(xì)胞凋亡的影響 見表7。與MPP++miR-7 mimics組和MPP++miR-7 mimics+pcDNA組比較，MPP++miR-7 mimics+pc-BDNF組細(xì)胞凋亡率顯著升高，Bcl-2蛋白表達顯著下降，Bax和cleaved caspase-3蛋白表達顯著升高(均P<0.05)。

表7 BDNF過表達逆轉(zhuǎn)了miR-7過表達對PD細(xì)胞模型細(xì)胞凋亡的影響( x±s,n=9)組別細(xì)胞凋亡率(%)Bcl-2Baxcleavedcaspase-3MPP++miR-7mimics組12.64±1.220.57±0.040.40±0.020.32±0.02MPP++miR-7mimics+pcDNA組11.46±1.170.60±0.050.38±0.030.31±0.02MPP++miR-7mimics+pc-BDNF組19.64±0.92?△0.34±0.02?△0.63±0.04?△0.52±0.03?△ 注:與MPP++miR-7mimics組比較?P<0.05;與MPP++miR-7mimics+pcDNA組比較△P<0.05

2.8 BDNF過表達逆轉(zhuǎn)了miR-7過表達對PD細(xì)胞模型細(xì)胞中線粒體、自噬相關(guān)蛋白表達的影響 見表8。與MPP++miR-7 mimics組和MPP++miR-7 mimics+pcDNA組比較，MPP++miR-7 mimics+pc-BDNF組細(xì)胞中BDNF、LC3Ⅱ蛋白表達明顯升高，Mfn、NRF1蛋白表達明顯降低(均P<0.05)，LC3Ⅰ蛋白表達無明顯變化。

2.9 miR-7過表達或miR-7與BDNF共同過表達對PD細(xì)胞模型細(xì)胞中α-syn蛋白表達的影響 見表9。與對照組相比，MPP+組細(xì)胞中α-syn蛋白表達顯著降低(P<0.05)；與MPP+組和MPP++miR-NC組相比，MPP++miR-7 mimics組細(xì)胞中α-syn蛋白表達顯著降低(P<0.05)；而與MPP++miR-7 mimics組和MPP++miR-7 mimics+pcDNA組比較，MPP++miR-7 mimics+pc-BDNF組細(xì)胞中α-syn蛋白表達顯著降低(均P<0.05)。

表8 BDNF過表達逆轉(zhuǎn)了miR-7過表達對PD細(xì)胞模型細(xì)胞線粒體、自噬相關(guān)蛋白的影響( x±s,n=9)組別BDNFMfnNRF1LC3ⅠLC3ⅡMPP++miR-7mimics組0.38±0.020.62±0.050.51±0.040.65±0.040.33±0.02MPP++miR-7mimics+pcDNA組0.36±0.020.64±0.040.53±0.030.62±0.040.31±0.02MPP++miR-7mimics+pc-BDNF組0.70±0.06?△0.40±0.03?△0.31±0.02?△0.63±0.030.55±0.05?△ 注:與MPP++miR-7mimics組相比?P<0.05;與MPP++miR-7mimics+pcDNA組相比△P<0.05

表9 各組細(xì)胞中α-syn蛋白表達比較( x±s,n=9)組別α-syn對照組1.01±0.05MPP+組0.52±0.04?MPP++miR-NC組0.53±0.05MPP++miR-7mimics組0.29±0.03△▲MPP++miR-7mimics+pcDNA組0.30±0.04MPP++miR-7mimics+pc-BDNF組0.15±0.02○● 注:與對照組比較?P<0.05;與MPP+組比較△P<0.05;與MPP++miR-NC組比較▲P<0.05;與MPP++miR-7mimics組比較○P<0.05;與MPP++miR-7mimics+pcDNA組比較●P<0.05

3 討 論

據(jù)報道[13]，多種因素可引起PD，如遺傳、氧化應(yīng)激、免疫異常等。PD產(chǎn)生的病理基礎(chǔ)是路易小體引起的多巴胺能神經(jīng)元丟失，其中路易小體的主要成分是α-syn[14]。有研究[15-16]表明，PD的發(fā)展進程與細(xì)胞自噬和凋亡有關(guān)，且miRNA能夠通過與靶基因結(jié)合共同調(diào)控細(xì)胞自噬和凋亡進而影響PD的發(fā)展。Kim等[17]研究顯示，短暫局灶性缺血可誘導(dǎo)大鼠模型中大腦miR-7表達下降，并抑制α-Syn的表達豐度。本研究發(fā)現(xiàn)，PD大鼠腦黑質(zhì)組織中miR-7、α-syn mRNA水平顯著降低，BDNF mRNA顯著升高(均P<0.05)。因此，本研究通過在體外對SH-SY5Y細(xì)胞使用目前最常用的PD造模劑MPP+[18]進行誘導(dǎo)建立PD細(xì)胞模型，觀察過表達或沉默miR-7及抑制BDNF表達對PD模型細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞主動死亡的過程，在維持機體穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮著非常重要的作用，而異常凋亡會打破機體的穩(wěn)態(tài)從而導(dǎo)致疾病的發(fā)生。Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3是調(diào)控細(xì)胞凋亡過程的標(biāo)志蛋白。Bcl-2、Bax位于caspase-3的上游，當(dāng)Bcl-2過量表達時會抑制caspase-3活化，進而減少cleaved caspase-3含量，抑制凋亡[19]。相關(guān)研究[20]顯示，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值可反映自噬程度的大小，比值增大，自噬增強。NRF1與Mfn水平的下調(diào)可促進線粒體自噬和細(xì)胞凋亡，進而加重神經(jīng)細(xì)胞損傷。本研究結(jié)果顯示，與對照組相比，MPP+組Bcl-2、Mfn、NRF1蛋白表達水平顯著下降，細(xì)胞凋亡率及LC3Ⅱ、LC3Ⅰ、Bax、cleaved caspase-3蛋白表達水平均明顯增加，說明MPP+可促進SH-SY5Y細(xì)胞凋亡、線粒體自噬。過表達miR-7后，Bcl-2、Mfn、NRF1蛋白表達水平顯著升高，細(xì)胞凋亡率及LC3Ⅱ、LC3Ⅰ、Bax、cleaved caspase-3蛋白表達水平均明顯降低；而抑制miR-7后細(xì)胞凋亡率及Bax、cleaved caspase-3蛋白表達水平明顯升高，Bcl-2蛋白表達水平明顯降低，揭示miR-7過表達可抑制MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡和線粒體自噬。

通過Targetscan軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)，BDNF和miR-7有互補的結(jié)合位點。抑制BDNF表達可促進精神分裂癥大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞增殖并抑制凋亡[21]。而且，有研究[22]表明，BDNF與抑郁癥有關(guān)，且在抑郁癥患者血漿中BDNF表達降低。本研究通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灠l(fā)現(xiàn)，共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-BDNF和miR-7 mimics的PD細(xì)胞模型細(xì)胞中熒光素酶活性顯著降低，且miR-7過表達后PD細(xì)胞模型細(xì)胞中BDNF蛋白表達降低，而抑制miR-7表達后BDNF蛋白表達顯著升高，說明miR-7直接負(fù)調(diào)控BDNF蛋白表達。此外，BDNF沉默表達后，PD細(xì)胞模型細(xì)胞凋亡率及BDNF、LC3Ⅱ、LC3Ⅰ、Bax、cleaved caspase-3蛋白表達水平顯著下降，Bcl-2、Mfn、NRF1蛋白表達水平顯著升高，提示沉默BDNF表達可降低細(xì)胞自噬活性、抑制細(xì)胞凋亡。進一步研究表明，BDNF過表達逆轉(zhuǎn)了miR-7過表達對PD細(xì)胞模型細(xì)胞凋亡、凋亡相關(guān)蛋白及線粒體自噬相關(guān)蛋白的抑制作用。

α-syn是在大腦中廣泛表達的神經(jīng)元蛋白。已有研究[23]表明，BDNF可與酪氨酸激酶受體B(TrkB)結(jié)合來抑制α-syn表達，從而參與PD的發(fā)展。Ma等[24]發(fā)現(xiàn)α-syn與TrkB的結(jié)合受BDNF負(fù)調(diào)控，海馬組織BDNF的下調(diào)表達可造成認(rèn)知障礙。本研究通過Western blotting實驗發(fā)現(xiàn)，MPP+誘導(dǎo)后SH-SY5Y細(xì)胞中α-syn蛋白表達水平降低，miR-7過表達后α-syn蛋白表達水平下降，而miR-7和BDNF同時過表達時α-syn蛋白表達水平也下降。說明miR-7和BDNF負(fù)向調(diào)控α-syn表達，且BDNF過表達可促進miR-7過表達對α-syn蛋白表達的抑制作用。

綜上所述，PD細(xì)胞模型的miR-7表達降低，且miR-7可抑制細(xì)胞凋亡，其機制可能與下調(diào)BDNF對α-syn的抑制作用有關(guān)，有望為PD的臨床治療提供新的靶點和思路。