血漿β-淀粉樣蛋白42、β-淀粉樣蛋白40、α-突觸核蛋白及p-tau181蛋白水平對(duì)初診帕金森病患者輕度認(rèn)知功能障礙的診斷價(jià)值

劉濤，閆磊，王雅潔，劉衛(wèi)國

帕金森病(PD)輕度認(rèn)知功能障礙(PD-MCI)是PD癡呆(PDD)的早期癥狀，對(duì)患者生活質(zhì)量有一定影響[1]。研究[2]認(rèn)為邊緣葉及大腦皮質(zhì)的α-突觸核蛋白(α-syn)異常沉積是PDD的主要病理生理機(jī)制，同時(shí)也有相當(dāng)大比例的PDD患者存在Alzheimer’s病(AD)病理變化，如β-淀粉樣蛋白(Aβ)形成的神經(jīng)炎性斑塊及p-tau181蛋白形成的神經(jīng)原纖維纏結(jié)。因此，研究PD-MCI時(shí)也將CSF和周圍血液α-syn和Aβ42、Aβ40、α-syn及p-tau181蛋白水平作為生物標(biāo)志物用于PD-MCI的輔助診斷和預(yù)測，但研究結(jié)果并不一致。有研究[3]發(fā)現(xiàn)初診PD患者的MCI發(fā)生率已達(dá)到40%，但上述指標(biāo)在該病程階段的研究較少。目前單分子陣列技術(shù)(SiMoA)已成為國際上體液蛋白組學(xué)研究的標(biāo)準(zhǔn)方法。本研究使用SiMoA技術(shù)對(duì)南京腦科醫(yī)院初診PD-MCI患者血漿α-syn和Aβ42、Aβ40、α-syn及p-tau181進(jìn)行檢測，探討其變化規(guī)律及對(duì)PD-MCI的臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 (1)PD組：選取2018年7月至2021年5月至南京腦科醫(yī)院門診就診的早期PD患者55例[Hoehn-Yahr(H-Y)分級(jí)為1～2.5級(jí)]，男性21例，女性34例；平均病程(1.9±1.1)年；平均年齡(58.1±7.8)歲。入組均符合英國腦庫原發(fā)性PD診斷標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)蒙特利爾認(rèn)知評(píng)估量表統(tǒng)(北京版)(BJ-MoCA)進(jìn)行認(rèn)知評(píng)估，分為PD伴MCI組(PD-MCI組，32例)和PD認(rèn)知功能正常組(PD-NC組，23例)。(2)正常對(duì)照組(NC組)：選取21名性別、年齡、教育程度相匹配的男性9人，女性12人；平均年齡(61.5±6.9)歲。所有入組者均無明顯頭部外傷、嚴(yán)重心腦血管病病史、精神疾病及其他干擾本研究的病史。PD組和NC組年齡、性別、受教育程度均匹配。本試驗(yàn)已經(jīng)獲得了南京腦科醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有入組者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 問卷量表評(píng)估 應(yīng)用BJ-MoCA量表進(jìn)行認(rèn)知評(píng)估。MCI診斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)2011年賈建平教授針對(duì)中國老年群體提出的常模獲得MCI的截?cái)嘀担航逃晗逓?年者，MoCA評(píng)分≤13分；教育年限<7年者，MoCA評(píng)分<19分；教育年限>7年者，MoCA評(píng)分<24分。該常模適應(yīng)中國老年人群的人口學(xué)特征且具有較高的敏感性和特異性。計(jì)算MoCA子域視空間與執(zhí)行功能、命名注意、語言、抽象、延遲回憶、定向力等得分。同時(shí)采用漢密爾頓抑郁量表(HAMD)、漢密爾頓焦慮量表(HAMA)、非運(yùn)動(dòng)癥狀問卷(NMS-Q)、統(tǒng)一PD評(píng)定量表第三部分(UPDRSⅢ)等對(duì)患者病情進(jìn)行評(píng)估。

1.2.2 血漿中蛋白組學(xué)測定 使用全自動(dòng)SiMoA HD-X平臺(tái)(GBIO，中國杭州)，通過SiMoA方法檢測Aβ42、Aβ40、α-syn 、p-tau181血漿濃度。在SiMoA測定之前，將血漿樣品分成等分試樣并儲(chǔ)存在-80 ℃冰箱。所有血漿樣品使用Quanterixy樣品稀釋劑B以1∶4的比例稀釋。樣品先在冰面上解凍，渦旋混勻，4 ℃下10 000 r/min離心5 min。將RGP溶液溫育30 min進(jìn)行解凍。將生物素化的檢測抗體25% QBlock緩沖液中稀釋至2 μg/ml。在SβG稀釋劑中將SβG稀釋至300 pM。HD-X儀器選擇“2-Step Assay”進(jìn)行所有樣品溫育，洗滌和檢查步驟。儀器全自動(dòng)的將捕獲抗體包被的磁珠與樣品和檢測抗體一起溫育，然后與SβG一起溫育形成免疫復(fù)合物。將免疫復(fù)合物重新懸浮在RGP溶液中，然后整個(gè)反應(yīng)體系會(huì)加載到SiMoA定制的光盤中。所有的檢測結(jié)果用AEB值表示。通過讀取標(biāo)準(zhǔn)品及檢測樣品的AEB值，對(duì)血漿樣本中的蛋白含量進(jìn)行精準(zhǔn)定量，操作過程嚴(yán)格按照SiMoA檢測試劑盒說明書。通過校準(zhǔn)曲線確定未知樣品的濃度。將測得的血漿中Aβ42、Aβ40、α-syn 、p-tau181水平進(jìn)行對(duì)數(shù)變換，以得到正態(tài)分布的數(shù)據(jù)供進(jìn)一步分析。

2 結(jié) 果

2.1 各組間基線資料的比較 見表1、表2。PD組MoCA評(píng)分明顯低于NC組，HAMD、HAMA、NMS-Q評(píng)分明顯高于NC組(均P<0.05)。PD-MCI組HAMD評(píng)分明顯高于PD-NC組(P<0.05)。

2.2 PD-NC組、PD-MCI組及NC組血漿蛋白組學(xué)水平的比較 見表3。PD-NC組、PD-MCI組及NC組間血漿Aβ42、Aβ40、α-syn、p-tau181蛋白水平及Aβ40/p-tau181、Aβ42/p-tau181比值的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而PD-MCI組患者血漿Aβ42/Aβ40比值明顯低于PD-NC組(P<0.05)。

2.3 血漿中Aβ42/Aβ40、Aβ40/p-tau181、Aβ42/p-tau181值與各個(gè)認(rèn)知域評(píng)分的Pearson相關(guān)性分析 見圖1。Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，在PD組患者中，血漿中Aβ42/Aβ40比值與MoCA總分無明顯相關(guān)性，而與MoCA細(xì)項(xiàng)中的視空間與執(zhí)行功能(r=0.274，P=0.043)、語言認(rèn)知域評(píng)分呈正相關(guān)(r=0.322，P=0.016)；Aβ40/p-tau181、與Aβ42/p-tau181比值MoCA總分及其細(xì)項(xiàng)均無明顯相關(guān)性。

圖1 血漿中Aβ42/Aβ40與PD-MCI組視空間與執(zhí)行功能及語言認(rèn)知域相關(guān)分析 圖2 血漿中Aβ42/Aβ40值ROC曲線

2.4 血漿中Aβ42/Aβ40值對(duì)PD MCI的診斷價(jià)值分析 見圖2。將三組比較有差異的Aβ42/Aβ40值納入制作ROC曲線。血漿Aβ42/Aβ40值對(duì)PD-MCI診斷的曲線下面積(AUC)為0.738，P值為0.003。約登指數(shù)最大值為0.451，對(duì)應(yīng)的Aβ42/Aβ40比值診斷截點(diǎn)為0.0738，該比值預(yù)測PD-MCI的敏感性為82.6%，特異性為62.5%。

表1 NC組與PD組基線資料的比較[ x±s,例(%)]組別例數(shù)年齡(歲) 性別(男)受教育年限(年)MoCA(分)HAMD(分)HAMA(分)NMS-Q(分)NC組2161.5±6.9 9(42.9)11.3±2.826.5±2.21.2±2.30.5±1.21.4±1.4PD組5558.1±7.821(38.2)10.1±3.222.8±3.48.6±5.86.0±4.37.5±3.5P值0.6790.7090.3790.0120.0000.0000.000

表2 PD-NC組與PD-MCI組基線資料的比較( x±s)組別例數(shù)病程(年)HAMD(分)HAMA(分)H-Y分級(jí)(級(jí))UPDRSⅢ(分)NMS-Q(分)PD-NC組232.1±1.35.5±3.94.8±3.41.6±0.522.2±10.16.5±3.4PD-MCI組321.7±0.910.8±6.06.9±4.61.5±0.421.5±9.18.2±3.4P值0.4520.0010.0760.5330.7910.068

表3 PD-NC組、PD-MCI組及NC組血漿蛋白組學(xué)水平的比較[ x±s,例(%)]組別α-synAβ40Aβ42p-Tau181Aβ42/Aβ40Aβ40/p-tau181Aβ42/p-tau181NC組(n=21)3.641±0.3411.987±0.1080.832±0.1080.184±0.7960.071±0.01166.541±22.4134.622±1.327PD-NC組(n=23)3.561±0.4981.944±0.0850.836±0.5370.202±0.1450.079±0.00157.956±21.2724.486±1.377PD-MCI組(n=32)3.668±0.3831.978±0.0930.813±0.0960.224±0.2100.069±0.012△63.428±30.4474.330±1.920F值0.4711.3440.5370.4075.1150.6320.212P值0.3430.1880.3460.6170.0030.4410.725 注:與PD-NC組比較△P<0.05

3 討 論

臨床上確定PD-MCI多依靠量表，但評(píng)估者之間的差異和患者文化程度等多種因素會(huì)對(duì)評(píng)估結(jié)果產(chǎn)生影響，因此尋找能體現(xiàn)疾病病理過程的生物標(biāo)記物已成為該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。CSF的成分反映了腦實(shí)質(zhì)的代謝過程，源于CSF的成分研究是目前國際上神經(jīng)系統(tǒng)疾病生物標(biāo)志物研究的標(biāo)準(zhǔn)方法。但腰椎穿刺屬于有創(chuàng)操作，輕癥和大多數(shù)患者都不容易接受，這就限制了該方法的應(yīng)用。而周圍血液標(biāo)本的研究越來越成為一種重要的替代方法。

血清中的Aβ42、Aβ40、α-syn、p-tau181蛋白濃度遠(yuǎn)低于CSF，傳統(tǒng)ELISA存在靈敏度低、測量差異大等問題，故本研究采取SiMoA進(jìn)行檢測。這是一種超靈敏的技術(shù)，可檢測飛克(fg/ml)水平的細(xì)胞因子，比ELISA檢測靈敏度提高了1 000倍以上[4]。本研究通過該方法測定了早期初診未服用抗PD藥物患者血漿中的Aβ42、Aβ40、p-tau181、α-syn的血漿蛋白水平，觀察該類指標(biāo)在PD病程早期認(rèn)知障礙識(shí)別中的價(jià)值。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Aβ42、Aβ40、p-tau181、α-syn水平在PD與NC組及PD-NC與PD-MCI組間均沒有明顯差異。與既往研究[5-7]發(fā)現(xiàn)的p-tau181、α-syn的血漿蛋白水平在PD的中晚期相較于NC組中有更高的濃度水平結(jié)果不一致。Lin等[5]在檢測血漿α-syn的蛋白水平時(shí)采用的是免疫磁還原法，該方法準(zhǔn)確性與SiMoA檢測方法類似，因此造成結(jié)果不一致的原因可能與本研究選擇的患者是早期初診PD患者，患者的病程較短、癥狀較輕有關(guān)。PD在不同疾病階段的病理生理學(xué)機(jī)制是不同的。Hall等[8]提出在PD的早期階段，毒性α-syn的隔離效應(yīng)導(dǎo)致了功能性α-syn在細(xì)胞內(nèi)聚集，因此CSF中的α-syn水平也降低，而隨著病情進(jìn)展隔離效應(yīng)代償功能減退，CSF中的毒性α-syn水平也逐漸增高，與此同時(shí)血液中的α-syn也逐漸增高。測定血漿中的Aβ濃度本來就存在很大挑戰(zhàn)，而且血漿中的Aβ更容易受到血小板和其他能產(chǎn)生Aβ的腦外組織的影響[9]。因此血液中的Aβ42、Aβ40、p-tau181、α-syn與PD關(guān)系復(fù)雜，不僅能反映疾病本身，可能還可以反映疾病的分期。但這需要更多的縱向研究來研究分析不同疾病階段的上述生物標(biāo)志物的血漿值變化。

國外在研究AD及其他類型的癡呆時(shí)發(fā)現(xiàn)，血漿或CSF中的Aβ42/Aβ40、β42/p-tau181及Aβ40/p-tau181對(duì)診斷AD具有較高的準(zhǔn)確性及敏感性，特別是血漿中的Aβ42/Aβ40比值，早期MCI患者較正常人明顯偏低，且該比值偏低可使患者的癡呆風(fēng)險(xiǎn)增加70%，因該比值具有較高的敏感性及特異性，已經(jīng)被納入AD的診斷框架之中[10-12]，但在PD中這種類型的研究尚較少。本研究另一個(gè)重要的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Aβ42/40比值在PD-NC組及PD-MCI組之間具有明顯的區(qū)別，PD-MCI組較PD-NC組顯著降低，可作為早期區(qū)分PD是否合并有認(rèn)知功能障礙的客觀依據(jù)。使用該指標(biāo)來診斷PD是否合并認(rèn)知功能障礙的敏感性達(dá)到了82.6%，這與國外對(duì)AD的研究[10]結(jié)果一致。而目前，國內(nèi)外類似利用血漿中Aβ42/40比值來研究PD-NC及PD-MCI的很少。Alves等[13]發(fā)現(xiàn)，PD合并有認(rèn)知功能障礙的患者CSF中的Aβ42/Aβ40水平明顯低于正常對(duì)照組。這與本研究在血漿中發(fā)現(xiàn)的結(jié)果是一致的，但上述研究只局限于CSF研究。本研究進(jìn)一步的數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)Aβ42/40比值與PD受試者的MoCA認(rèn)知量表細(xì)項(xiàng)評(píng)分也具有正相關(guān)性，如在視空間與執(zhí)行功能、語言認(rèn)知方面具有相關(guān)性。這可能與PD在不同疾病階段損害的認(rèn)知域不同有關(guān)。早中期PD患者認(rèn)知功能障礙主要表現(xiàn)為皮質(zhì)下癡呆，以視空間與執(zhí)行功能、注意力、工作記憶下降為突出；而晚期PDD患者兼具皮質(zhì)下癡呆及皮質(zhì)性癡呆的特點(diǎn)，在注意力、執(zhí)行能力、視空間能力及記憶力方面均表現(xiàn)出異常[1]。有一項(xiàng)31個(gè)月的縱向研究[14]評(píng)估PD患者認(rèn)知下降的模式發(fā)現(xiàn)，從PD-NC進(jìn)展到PD-MCI的過程中，患者的執(zhí)行功能障礙和語言認(rèn)知能力下降最為突出。這與本研究發(fā)現(xiàn)在PD組Aβ42/Aβ40比值與視空間與執(zhí)行功能、語言認(rèn)知具有顯著正相關(guān)結(jié)果一致。因此在臨床工作中可使用該比值來識(shí)別PD患者特定領(lǐng)域的認(rèn)知損害。PD發(fā)展為癡呆的危險(xiǎn)因素中，常見的如年齡>75歲、受教育程度低、病程超過10年等，還包括語義流暢受損及視空間能力受損，因此早期識(shí)別患者特定受損領(lǐng)域，重視危險(xiǎn)因素的篩查有助于早期發(fā)現(xiàn)PDD，盡早給予干預(yù)治療。

本研究存在一定的局限：SiMoA是一種較新的檢測方法，其價(jià)格較昂貴，入組的健康對(duì)照及PD患者數(shù)量較少，可能存在統(tǒng)計(jì)誤差；未來仍需要更多的研究來驗(yàn)證SiMoA的準(zhǔn)確性；本研究入組患者為早期初診PD患者，尚缺乏進(jìn)一步的隨訪資料。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)，PD-MCI患者血漿Aβ42/Aβ40比值明顯低于PD-NC組，且該指標(biāo)對(duì)診斷PD-MCI具有較高的敏感性，因此可用于PD認(rèn)知功能障礙篩查和輔助診斷，具有一定的臨床推廣與應(yīng)用價(jià)值。