五倍子單寧酸中沒食子酸的去除及其含量測定

李志遙，李珂，張妮，任海，宋俊蓉，王紹江，陳超，潘衛(wèi)東*，3

(1.貴州大學(xué) 藥學(xué)院， 貴州 貴陽 550002；2.貴州醫(yī)科大學(xué) 省部共建藥用植物功效與利用國家重點實驗室， 貴州 貴陽 550014；3.貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點實驗室 貴州省天然藥物工程研究中心， 貴州 貴陽 550014；4.貴陽單寧科技有限公司， 貴州 貴陽 550001)

0 引言

五倍子(Gallachinensis)為倍蚜科昆蟲角倍蚜或蛋倍蚜在其寄主漆樹科植物鹽膚木、青麩楊或紅麩楊等樹上形成的干燥蟲癭，其藥用歷史悠久，收載于2020版《中國藥典》[1-3]。研究表明，單寧酸具有多種生物活性，如抗菌、抗癌、抗氧化、治腹瀉、止血等[4-7]。五倍子中的主要成分為單寧酸，質(zhì)量分數(shù)為50%～70%[8]。單寧酸在市場上的應(yīng)用十分廣泛，目前國家林業(yè)局根據(jù)其用途不同將單寧酸分為3個不同等級，主要包括：食品級單寧酸，在食品工業(yè)中用作食品添加劑或酒類、飲料的澄清劑和穩(wěn)定劑[9-10]；工業(yè)級單寧酸，主要用于皮革、墨水、木材粘連劑等化工行業(yè)[11-12]；藥用級單寧酸，作為止血劑、抗癌藥、重金屬解毒劑等藥品的組成廣泛運用于醫(yī)藥行業(yè)。其中食品級單寧酸和藥用級單寧酸的使用標(biāo)準最高，而沒食子酸雜質(zhì)的含量是評價其等級的重要考察指標(biāo)之一。沒食子酸不易從單寧酸中除去，嚴重影響了單寧酸的品質(zhì)，導(dǎo)致其使用范圍受限。分析沒食子酸的來源主要有2個方面：一是植物代謝；二是提取與純化過程中條件控制不當(dāng)而引發(fā)單寧酸水解生成沒食子酸。由于沒食子酸的物化性質(zhì)與單寧酸相似，因此在純化過程中不易被去除。雖然單寧酸中沒食子酸的純化工藝有所報道，如活性碳吸附、大孔樹脂吸附、膜分離技術(shù)、離子交換技術(shù)、分子蒸留技術(shù)等[13-14]；但上述純化工藝復(fù)雜，成本高，污染嚴重，不適合工業(yè)放大生產(chǎn)，因此新的純化工藝亟待研究開發(fā)。

對比分析沒食子酸與單寧酸的結(jié)構(gòu)特點，其中從沒食子酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)(3,4,5-三羥基苯甲酸)可以判斷其同時具有苯酚和羧酸的化學(xué)性質(zhì)。連苯三酚、苯甲酸的酸度系數(shù)(pKa)分別為15.2、4.2，由此可知苯甲酸的酸性比連苯三酚的酸性強，從而推測沒食子酸水溶液遇到碳酸氫鈉等堿性物質(zhì)時，優(yōu)先與羧基反應(yīng)生成3,4,5-三羥基苯甲酸鈉鹽，而單寧酸只有連苯三酚基團而無羧基，不會優(yōu)先與碳酸氫鈉等堿性物質(zhì)反應(yīng)。在荊才等[15]的實驗中，考察了以pH為6.8、7.5的磷酸鈉鹽溶液和質(zhì)量分數(shù)為1%、3%碳酸鈉溶液為反萃劑考察對單寧酸中沒食子酸殘留量的影響，單因素試驗發(fā)現(xiàn)，使用pH為6.8的磷酸鈉溶液作為反萃劑時，單寧酸中沒食子酸殘留量最低，質(zhì)量分數(shù)為1.02%，同時認為反萃劑對單寧酸中沒食子酸殘留含量有極顯著影響。在此實驗基礎(chǔ)上，本實驗設(shè)想在粗品單寧酸(除了沒食子酸含量高于食品級指標(biāo)，其他指標(biāo)均達到食品級)水溶液中加入其他堿性物質(zhì)，使沒食子酸生成鹽，溶于水中，以乙酸乙酯為萃取劑，利用單寧酸在乙酸乙酯溶液和反萃(取)劑分配系數(shù)不同，通過萃取技術(shù)使極大部分單寧酸分配進入乙酸乙酯，從而達到提純目的；采用單因素實驗方法，考察堿性物質(zhì)對單寧酸純化工藝的影響，建立單寧酸生產(chǎn)中的精制工藝，減少生產(chǎn)成本，提高相關(guān)產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟效益。

1 實驗

1.1 試劑和儀器

安捷倫1200型高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)；天平(賽多利斯，SQP型)；分析柱為C8色譜柱(依利特，4.6 mm×250 mm，5 μm)。

1.2 材料及試劑

超純水(貴陽單寧科技有限公司)；對照品：單寧酸粗品(貴陽單寧科技有限公司)，其指示為干燥失重≤ 9.0%， 灼燒殘渣質(zhì)量分數(shù)≤ 0.6%， 砷的質(zhì)量比≤ 3 μg/g，鉛的質(zhì)量比≤ 5 μg/g， 重金屬(以Pb計)的質(zhì)量比≤ 20 μg/g，樹膠、糊精試驗無渾濁，樹脂試驗無渾濁，沒食子酸質(zhì)量分數(shù)為2.47%，其中除沒食子酸含量超過食品級指示(0.75%)，其余均達到食品級指標(biāo)，單寧酸，比利時Omnichem公司；沒食子酸標(biāo)準品(北京恒元啟天化工技術(shù)研究院與北京世紀奧科生物技術(shù)有限公司聯(lián)合研制)；色譜純甲醇(美國天地)；磷酸(安耐吉)；乙酸乙酯(安耐吉)；對照品及供試品均為自行配制。

1.3 實驗方法

1.3.1 單因素實驗

根據(jù)已有研究[15]，不同反萃劑對單寧酸中沒食子酸的殘留量有一定的關(guān)系，因此，選擇在25 ℃條件下，考察不同濃度的碳酸氫鈉對單寧酸中沒食子酸殘留量的影響，進行單因素考察實驗。

分別稱取10 g單寧酸粗品于A、B、C和D瓶中，加入30 mL超純水，溶解后，攪拌下分別緩慢加入碳酸氫鈉 0.8、0.6、0.4、0.2 g，繼續(xù)攪拌30 min，分別用30、20、10 mL乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯，減壓除去乙酸乙酯后，50 ℃真空干燥5 h，得純品單寧酸DNSCP 9.1 g、DNSCP-1 9.2 g、DNSCP-2 9.1 g和DNSCP-3 9.1 g。

1.3.2 色譜條件與檢測方法

采用高效液相色譜方法(HPLC)檢測沒食子酸的含量[16-18]。C8色譜柱，柱溫為30 ℃；DAD檢測器調(diào)節(jié)檢測波長為275 nm；甲醇-0.3%磷酸水溶液(體積比為20/80，v/v)等度洗脫；流速為0.6 mL/min；進樣量為20 μL。

1.3.3 對照品溶液的制備

精密稱取標(biāo)準品沒食子酸0.24 mg于100 mL容量瓶中，用甲醇溶液定容，搖勻，過0.45 μm 微孔濾膜，即得沒食子酸對照品溶液(質(zhì)量濃度為2.4×10-4mg/μL)。

1.3.4 供試品溶液的制備

精密稱取比利時Omnichem公司單寧酸、貴陽單寧科技有限公司單寧酸粗品以及按照1.3.1方法純化的單寧酸純品DNSCP、DNSCP-1，DNSCP-2和DNSCP-3對照品適量，加入色譜甲醇配置質(zhì)量濃度為2.17×10-3、2.00×10-3、2.06×10-3、2.04×10-3、2.07×10-3、2.14×10-3mg/μL的對照品溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 單寧酸純化方法的確定

根據(jù)沒食子酸的結(jié)構(gòu)，結(jié)合文獻[15]的實驗結(jié)果分析，堿性化合物的選擇需滿足以下條件：①堿不能水解單寧酸；②堿易與沒食子酸完全反應(yīng)且不易與單寧酸反應(yīng)；③實驗體系中多余的堿易除去?；诖耍緦嶒炇紫扰懦褂糜袡C堿，有機堿通常是含氮化合物，易與酚羥基形成氫鍵，不易完全除去，從而引入新的雜質(zhì)。對于無機堿，綜合經(jīng)濟性、安全性、穩(wěn)定性的選擇原則，選擇碳酸氫鈉，相比氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸鈉、碳酸鉀、碳酸氫鈉、碳酸氫鉀等常用堿具有顯著的優(yōu)勢。其理由如下：①氫氧化鈉和氫氧化鉀是強堿，容易水解單寧酸中的酯鍵，生成沒食子酸；②與碳酸氫鈉相比，碳酸鈉和碳酸鉀不僅價格高，而且其堿性比碳酸氫鈉強，有促進單寧酸中酯鍵水解的風(fēng)險；③碳酸氫鉀與碳酸氫鈉性質(zhì)相似，但碳酸氫鈉價格更低。綜上分析，碳酸氫鈉是最優(yōu)選擇。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

試驗前期考察了不同的流動相(甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸溶液、甲醇-0.2%磷酸溶液、甲醇-0.3%磷酸水溶液、甲醇-0.5%磷酸水溶液)、流速(0.5、0.6、0.8、1.0 mL/min)、柱溫(25、30、35℃)、檢測波長190 ～ 400 nm、進樣量(5、10、15、20、25 μL)等條件，以色譜峰的分離情況、基線平穩(wěn)程度、雜質(zhì)峰的干擾情況等為評價指標(biāo)，最終確定在275 nm檢測波長，30 ℃柱溫條件下，進樣20 μL，甲醇-0.3%磷酸水溶液以流速0.6 mL/min洗脫為最佳色譜條件。

2.3 線性關(guān)系考察

對照品沒食子酸溶液2、4、6、8、10 μL按1.3.1節(jié)的色譜條件注入高效液相色譜儀。以進樣量為橫坐標(biāo)X，峰面積為縱坐標(biāo)Y進行線性回歸，求得線性回歸方程y=242.34x+ 49.06，R= 0.999 9(圖1)，結(jié)果表明峰面積與進樣量呈良好的線性關(guān)系。

圖1 沒食子酸標(biāo)準曲線Fig.1 Gallic acid standard curve

2.4 單寧酸中沒食子酸含量測定

按1.3.1節(jié)色譜條件, 將1.3.2節(jié)中制備的樣品溶液進樣20 μL，HPLC結(jié)果如圖2所示，其中沒食子酸的保留時間為7.9 min，單寧酸的保留時間為5.1 min，重復(fù)進樣3次，取平均值，根據(jù)方程y=242.34x+ 49.06計算沒食子酸含量，其結(jié)果見表1。

分別取DNSCP、DNSCP-1、DNSCP-2、DNSCP-3樣品進行沒食子酸含量分析，結(jié)果見表1。從中可以看出，DNSCP、DNSCP-1中沒食子酸含量低于進口比利時單寧酸中沒食子酸含量0.34%，但二者中沒食子酸含量差值小，分別為0.15%和0.21%，因此當(dāng)沒食子酸含量低于一定值時，隨著碳酸氫鈉使用量的增加對單寧酸純度的提高沒有成比例增加，此外，從質(zhì)量要求和成本考慮，本批次貴陽單寧科技公司的單寧酸使用碳酸氫鈉最優(yōu)質(zhì)量分數(shù)為6%最理想，當(dāng)碳酸氫鈉的用量低于單寧酸質(zhì)量4%時，其沒食子酸含量高于比利時單寧酸。

表1 單寧酸中沒食子酸含量分析Tab.1 Analysis of gallic acid content in tannic acid

(a)沒食子酸

(b)Omnichem公司單寧酸

(c)貴陽單寧科技公司粗品

(d)貴陽單寧科技公司粗品單寧酸純化后

2.5 精密度試驗

在上述優(yōu)化的色譜條件下，精密進樣單寧酸標(biāo)準液20 μL，重復(fù)5次測定，以峰面積計算系統(tǒng)的精密度，其峰面積分別為19 216.1、19 110.3、19 250.1、19 323.2、19 209.2，結(jié)果單寧酸峰面積相對標(biāo)準偏差RSD為0.4%，說明儀器的精密度良好。

2.6 工藝放大量實驗

按上述實驗方法，單寧酸的純化質(zhì)量放大為160 kg，純化后的單寧酸中沒食子酸質(zhì)量分數(shù)為0.21%，同樣實現(xiàn)了沒食子酸含量低于比利時單寧酸且超過食品級標(biāo)準。

3 結(jié)論

針對五倍子單寧酸提取物的純化工藝優(yōu)化，本研究采用簡單易得的無機堿碳酸氫鈉選擇性去除單寧酸提取物中的主要雜質(zhì)沒食子酸。使用碳酸氫鈉處理后的單寧酸，其沒食子酸的質(zhì)量分數(shù)從2.47%降低至0.15%，遠低于比利時Omnichem公司進口的單寧酸中沒食子酸雜質(zhì)含量。同時為了驗證本實驗方法的可靠性，將單寧酸的單次純化量放大至每批次160 kg，結(jié)果純化后的沒食子酸質(zhì)量分數(shù)為0.21%，仍低于比利時單寧酸中沒食子酸的含量，證明了本方法的實用性。綜上，此純化方法便捷可靠，操作簡單，具有巨大的潛在工業(yè)應(yīng)用價值。