西紅花球莖病變對(duì)內(nèi)生真菌多樣性及菌群結(jié)構(gòu)的影響

任航潔， 吳啟婷， 陸潔淼， 張家豪， 鄭呂， 秦路平， 朱波

(浙江中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院， 浙江 杭州 311402)

中藥西紅花是鳶尾科植物番紅花(CrocussativusL.)的干燥柱頭，具有活血化瘀、涼血解毒、解郁安神的功效，用于治療經(jīng)閉癥瘕、產(chǎn)后瘀阻、溫毒發(fā)斑、優(yōu)郁痞悶 、驚悸發(fā)狂[1]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，西紅花有著抗腫瘤、抗氧化、降血脂、抗凝血、保護(hù)腦損傷等作用[2]。我國西紅花主要分布于浙江、上海、河北、江蘇、西藏、安徽等地區(qū)，國外主要分布在伊朗、新西蘭與西班牙等地[3-4]。球莖腐爛病是西紅花生產(chǎn)上常見的一種重要病害，其主要危害部位是未成熟的球莖，在重茬田、低洼田和排水不良的田塊中發(fā)病較為嚴(yán)重，嚴(yán)重影響西紅花球莖產(chǎn)量與藥材質(zhì)量[5]。

植物內(nèi)生菌是指生活史中某一階段或整個(gè)階段生活在健康植物組織或細(xì)胞內(nèi)，并對(duì)宿主植物沒有引起明顯病害癥狀的一類真菌[6]。植物內(nèi)生真菌和宿主植物之間存在著相互依存、互利共惠的關(guān)系[7]?，F(xiàn)有報(bào)道表明，西紅花中存在數(shù)量眾多的內(nèi)生真菌，部分內(nèi)生真菌有著抑制病原菌生長、促進(jìn)宿主西紅花生長等作用[8-9]。

植物體良好的內(nèi)生微環(huán)境對(duì)正常生長發(fā)育至關(guān)重要，目前，針對(duì)西紅花內(nèi)生真菌種群結(jié)構(gòu)與分布規(guī)律鮮有報(bào)道。因此，本試驗(yàn)在前期西紅花內(nèi)生真菌分離鑒定的基礎(chǔ)上，擬分析西紅花健康球莖與病變球莖在內(nèi)生真菌菌群結(jié)構(gòu)、多樣性等方面的差異，探討球莖病變對(duì)西紅花內(nèi)生微環(huán)境的影響，以期為西紅花大田栽培與病害防治提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種材料

課題組前期從浙江建德、浙江湖州、河北保定3個(gè)產(chǎn)地收集了健康與病變西紅花球莖，并從中分離純化得到內(nèi)生真菌380株，根據(jù)菌株的形態(tài)學(xué)特征以及通過5.8S以及ITS區(qū)片段序列進(jìn)行相似性對(duì)比及系統(tǒng)發(fā)育分析，共鑒定了26個(gè)分類單位，歸屬于10個(gè)屬，6個(gè)目，3個(gè)綱，2個(gè)門。其中22個(gè)分類單位(占總數(shù)的86.58%)歸屬于子囊菌門，4個(gè)(占15.79%)歸屬于擔(dān)子菌門。

1.2 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

統(tǒng)計(jì)物種數(shù)、物種優(yōu)勢(shì)度與多樣性指數(shù)：物種數(shù)用來記錄西紅花球莖中內(nèi)生真菌的種類數(shù)目；物種優(yōu)勢(shì)度用來判斷所有內(nèi)生菌群中占有優(yōu)勢(shì)的菌群及內(nèi)生菌群的組成情況。常用相對(duì)分離頻率(relative frequency，RF)體現(xiàn)，RF=(某類內(nèi)生真菌菌株數(shù)/內(nèi)生真菌菌株總數(shù))×100%[10]。優(yōu)勢(shì)菌種的判定：Pi>1/S[11]。Pi即相對(duì)分離頻率，i表示第i種菌落，S表示該類別中總的菌落數(shù)。多樣性指數(shù)(diversity index)用來描述內(nèi)生真菌的菌種數(shù)量及其分布的均勻度，常使用Shannon-Wiener多樣性指數(shù)(H′)[12]與Simpson多樣性指數(shù)(1-D)[13]。Shannon-Wiener(H′)=-ΣPi×lnPi；Simpson指數(shù)(1-D)=1-Σ(Ni/N)2；其中Ni為類別中第i種的個(gè)體數(shù)，N為類別中所有種的個(gè)體數(shù)。

2 結(jié)果和分析

2.1 物種數(shù)和物種組成

西紅花健康球莖共有內(nèi)生真菌10個(gè)屬，26個(gè)種；病變球莖共有內(nèi)生真菌7個(gè)屬，19個(gè)種。健康球莖中，湖州產(chǎn)地內(nèi)生真菌物種數(shù)最高，為16；病變球莖中，建德產(chǎn)地內(nèi)生真菌物種數(shù)最高，為11(表1)。

表1 3個(gè)產(chǎn)地西紅花球莖中內(nèi)生真菌的物種數(shù)

3個(gè)產(chǎn)地西紅花球莖在病變后內(nèi)生真菌物種數(shù)均下降，其中湖州產(chǎn)地下降最多。病變同時(shí)影響了內(nèi)生真菌的物種分布，如湖州健康球莖中分離有黏帚霉屬(Clonostachys)真菌，而病變球莖中卻未發(fā)現(xiàn)。部分真菌物種分布未受球莖病變影響，如鐮刀屬(Fusarium)、青霉屬(Penicillium)和踝節(jié)菌屬(Talaromyces)內(nèi)生真菌在健康和病變球莖中均有分布(表2)。

表2 西紅花球莖中內(nèi)生真菌的物種組成

2.2 種群優(yōu)勢(shì)度

球莖病害影響西紅花內(nèi)生真菌菌群結(jié)構(gòu)與種群優(yōu)勢(shì)度，病變后，球莖中鐮刀屬Fusarium的相對(duì)豐度明顯增加。在屬水平，河北健康球莖最優(yōu)勢(shì)屬為踝節(jié)菌屬Talaromyces(RF=50.00%)，其次為青霉屬Penicillium(RF=44.12%)，病變后最優(yōu)勢(shì)屬為青霉屬(RF=42.31%)，其次為鐮刀屬Fusarium(RF=38.46%)；湖州健康球莖最優(yōu)勢(shì)屬為踝節(jié)菌屬(RF=38.00%)，病變后最優(yōu)勢(shì)屬為鐮刀屬Fusarium(RF=43.48%)；建德健康球莖最優(yōu)勢(shì)屬為青霉屬(RF=54.05%)，病變球莖最優(yōu)勢(shì)屬為踝節(jié)菌屬(RF=48.48%)，其次為鐮刀屬(RF=24.24%)(表3)。

表3 球莖病變后西紅花內(nèi)生菌在屬水平的相對(duì)豐度變化

在種水平，F(xiàn)usariumoxysporum病變球莖中豐度顯著升高，除建德產(chǎn)地外，其他產(chǎn)地病變后西紅花球莖的最優(yōu)勢(shì)種從Talaromycesrugulosus變?yōu)镕usariumoxysporum(圖1)。

圖1 不同產(chǎn)地西紅花優(yōu)勢(shì)菌種相對(duì)分離頻率比較

2.3 多樣性指數(shù)

球莖病變影響西紅花內(nèi)生真菌多樣性，病變后3個(gè)產(chǎn)地內(nèi)生真菌多樣性指數(shù)均下降，其中建德產(chǎn)地下降幅度最大，Shannon-Wiener(H′)指數(shù)下降20.26%，Simpson指數(shù)(1-D)下降11.68%(表4)。

表4 3個(gè)產(chǎn)地西紅花球莖中內(nèi)生真菌的多樣性指數(shù)

3 小結(jié)與討論

本文對(duì)浙江建德、浙江湖州、河北保定3個(gè)產(chǎn)地的健康與病變球莖中分離得到的內(nèi)生真菌進(jìn)行了多樣性與菌群結(jié)構(gòu)的分析，研究發(fā)現(xiàn)，西紅花球莖病變后內(nèi)生真菌的物種數(shù)下降，物種優(yōu)勢(shì)度也發(fā)生了改變，病變后西紅花球莖的優(yōu)勢(shì)種從Talaromycesrugulosus變?yōu)镕usariumoxysporum。西紅花健康球莖的內(nèi)生真菌多樣性指數(shù)在病變后下降，內(nèi)生真菌多樣性的降低與鐮刀菌等有害菌群的增加可能是西紅花球莖病變的主要原因。

已有多項(xiàng)研究表明，植物病害會(huì)影響植物內(nèi)生真菌的菌群結(jié)構(gòu)。周琳等[14]對(duì)崇明西紅花球莖根腐病進(jìn)行研究，從屬水平分析得出，西紅花球莖中細(xì)菌和真菌群落組成和相對(duì)豐度存在明顯差異。唐鑫等[15]在對(duì)天麻褐腐病的研究中發(fā)現(xiàn)健康天麻中的優(yōu)勢(shì)真菌屬為被孢霉屬(Mortierella)和隱球菌屬(Cryptococcus)，而褐腐天麻中的優(yōu)勢(shì)為真菌屬(Neobulgaria)、土赤殼屬(Ilyonectria)和花邊傘屬(Hypholoma)。

西紅花球莖腐爛病是西紅花種植過程中最主要的病害之一，其致病菌種類繁多，如鐮刀菌(Fusarium)、青霉菌(Penicillium)、叢花青霉(Penicilliumcorymbiferum)等[16-17]。吳李芳[5]在對(duì)建德西紅花球莖病變研究中得出茄病鐮刀菌(Fusariumsolani)是主要致病菌之一。趙麗娟[2]從崇明西紅花病變球莖中分離得到3種致病菌，鑒定為曲霉屬(Aspergillus)的巴西曲霉(Aspergillusbrasiliensis)、鐮刀菌屬(Fusarium)的尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)和青霉菌屬(Penicillium)的橘青霉菌(Penicilliumcitrinum)[2]。本文分析了球莖病變后西紅花內(nèi)生真菌菌群結(jié)構(gòu)與多樣性變化，為西紅花病害生物防治真菌的篩選及防治策略提供了參考依據(jù)。