江西稻瘟病自然病圃菌群毒性相關(guān)基因的鑒定與分析

蘭 波，余 建，霍光華，李湘民，楊迎青*

（1.江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護(hù)研究所,江西 南昌 330200；2.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 菌物資源保護(hù)與利用江西省重點實驗室，江西 南昌 330045）

【研究意義】由稻瘟病菌Magnaporthe oryzae（無性態(tài)：Pyricularia oryzae）引起的稻瘟病是世界水稻生產(chǎn)中三大毀滅性病害之一，對水稻的產(chǎn)量和品質(zhì)均造成嚴(yán)重影響［1］，已成為水稻高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)的主要限制因子。江西是水稻種植大省，稻米產(chǎn)量占中國的第三位，然而江西地處溫暖濕潤的亞熱帶區(qū)也是稻瘟病常發(fā)、重發(fā)區(qū)，一般早稻發(fā)病較重，中稻次之，而以晚稻發(fā)病較輕。如2006 年發(fā)生面積5.7×105hm2，其中早稻發(fā)生面積達(dá)4.5×105hm2［2］。實踐證明，利用品種自身的抗性控制稻瘟病是最經(jīng)濟(jì)有效的方法。但是，稻瘟菌毒性相關(guān)基因高頻率變異使得病原菌小種極不穩(wěn)定，常導(dǎo)致新培育出的抗稻瘟病品種在推廣3～5年后抗性逐漸減弱或者喪失［3］?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】由于水稻寄主與稻瘟病菌之間的互作符合Flor 的“基因?qū)颉睂W(xué)說，二者存在典型的特異性識別和互作規(guī)律［4］。因此，開展稻瘟病菌群體結(jié)構(gòu)與毒性基因研究、掌握病原菌群體變化規(guī)律及毒性信息，對于品種選育和抗病品種合理布局都具有重要的意義［5-6］。目前已克隆和分析了近40 個與稻瘟病菌生活史中各個階段相關(guān)的功能基因［7］。其中MPG1，MPS1，MagB，CPKA，MNH1，MgYCA1，MgS11和MgATG5 為稻瘟病菌重要的致病相關(guān)基因。如CPKA編碼蛋白激酶A的催化亞基PKA-c是稻瘟病菌致病性所必需的基因［8］，MPG1功能作用于稻瘟病菌對外界信號的識別［9］；MPS1與附著胞的侵入、稻瘟病菌的營養(yǎng)生長、產(chǎn)孢和子囊形成密切相關(guān)［10］。稻瘟病菌無毒基因研究相對較少，已成功克隆的無毒基因僅有幾個［11］，如Avr-pia，Avr-pit，Avr-pik，Avr-pita，Avr-pizt，Avrco39，PRE1和ACE1在寄主與病原菌互作發(fā)生抗病反應(yīng)過程中發(fā)揮重要的作用。其中無毒基因Avr-pita編碼223個氨基酸的金屬蛋白酶，能與抗性基因Pi-ta直接互作，激活特異性免疫反應(yīng)［12］；AVR1-CO39可以特異的激發(fā)有抗病基因Pi-Co39（t）水稻的防衛(wèi)反應(yīng)［13］。近年來，國內(nèi)學(xué)者也開展了部分地區(qū)的稻瘟病菌無毒基因分子檢測，朱名海等檢測了Ace1、Avr-Pia、Avr-Pik、Avr-Pita、Avr-Pizt和PWL2等6 個無毒基因在南繁核心區(qū)與非核心區(qū)稻瘟病菌中的分布頻率，結(jié)果表明不同區(qū)域稻瘟病菌中無毒基因存在一定差異［14］。郭敬瑋等（2021）利用特異性引物標(biāo)記測定了Avr-Pia等7 個無毒基因在云南羅平120 個田間菌株中的存在情況［15］。鄧云等（2021）通過測定24 個無毒基因在福建省稻瘟病菌中的出現(xiàn)頻率，明確了Avr-z5、Avr-9（t）這兩個無毒基因出現(xiàn)頻率最高而且穩(wěn)定，對應(yīng)的抗病基因在今后的抗性育種中可以重點應(yīng)用［16］。而江西在利用分子鑒定方法測定稻瘟病菌中致病基因和無毒基因卻未見報道?！颈狙芯壳腥朦c】本研究于2020年在江西5個稻瘟病自然誘發(fā)病圃采集分離的189個稻瘟病菌單孢菌株，利用16個已克隆或鑒定的具有重要功能的稻瘟病菌毒性相關(guān)基因的特異性引物進(jìn)行PCR 檢測，明確相關(guān)基因在菌群中的分布情況。【擬解決的關(guān)鍵問題】通過監(jiān)測江西省不同地區(qū)稻瘟病菌的毒性相關(guān)基因的分布，掌握菌群遺傳結(jié)構(gòu)變化可為江西水稻抗病育種、抗病品種合理布局以及延長使用周期、稻瘟病綜合防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

2020 年從江西5 個稻瘟病自然誘發(fā)病圃種植的高感品種麗江新團(tuán)黑谷（LTH）病穗頸標(biāo)本分離純化的189個稻瘟病菌單胞菌株，其中都昌稻瘟病病圃42株（編號DC01～DC42），井岡山稻瘟病病圃44株（編號JGS01～JGS44），豐城稻瘟病病圃39株（編號FC01～FC39），萬安稻瘟病病圃32株（編號WA01～WA32），婺源稻瘟病病圃32株（編號WY01～WY32）。

1.2 稻瘟病菌菌絲體培養(yǎng)

將供試菌株活化后再純化一次，挑取適量菌絲在PDA 液體培養(yǎng)基中于轉(zhuǎn)速120 r/min搖床上28 ℃培養(yǎng)3～5 d，待菌絲體生長至一定量后用滅菌紗布過濾收集、烘干，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 稻瘟病菌基因組DNA提取

將收集的菌絲體分裝于2 mL 的Eppendorf 管中，加2 顆5 mm 滅菌碳鋼珠后迅速加入65 ℃預(yù)熱的CTAB 提取液，應(yīng)用上海凈信科技生產(chǎn)的全自動樣品快速研磨儀進(jìn)行磨樣，使用CTAB［18］法進(jìn)行基因組DNA提取，最后用RNAase進(jìn)行處理后抽提一次，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 供試菌株致病基因與無毒基因測定

采用公開報道的8 個致病基因MNH1、MgATG5、MPG1、MgYCA1、MgS11、MagB、MPS1、CPKA，8 個無毒基因Avr-pia、Avr-pizt、ACE1、Avr-pit、Avr-pita、Avr-co39、Avr-pik，PRE1共16 對特異性SSR 標(biāo)記引物（表1）［17-19］，經(jīng)PCR 擴(kuò)增對供試稻瘟病菌的毒性相關(guān)基因的分子檢測。PCR 反應(yīng)體系（20μL）：TaqDNA聚合酶0.2μL，10×Buffer（MgCl2）2μL，正、反向引物各1μL（0.2μmol/L），dNTP 0.5μL（2.5 mmol/L），DNA模板1μL（≤200 ng），ddH2O補(bǔ)足至20μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，50～62 ℃（根據(jù)不同引物退火溫度）退火30 s，72 ℃延伸30～60 s，具體依據(jù)目的基因片段長度而定，35個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。瓊脂糖凝膠電泳檢測：取PCR 產(chǎn)物5μL與適量的6×Loading buffer 混合液混合，在15 g/L瓊脂糖凝膠中電泳（電壓100 V，時間20 min），染色后在凝膠成像系統(tǒng)下拍照。

表1 稻瘟病菌致病基因與無毒基因分子檢測特異性引物標(biāo)記序列Tab.1 Molecular detection of pathogencity genes and avirulence genes of Magnaporthe oryzae using specific primer-marking sequences

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

根據(jù)PCR擴(kuò)增結(jié)果，建立基于稻瘟病菌毒性相關(guān)基因指紋的“0～1”數(shù)據(jù)庫。根據(jù)每個樣品電泳條帶的有無，有則賦值為“1”，無則賦值為“0”。統(tǒng)計各引物的擴(kuò)增頻率，并應(yīng)用Ntsys 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)的Nei&Li方法［20］計算遺傳距離，用最長距離法對16對引物的擴(kuò)增情況進(jìn)行聚類，分析稻瘟病菌群體遺傳宗譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 稻瘟病菌無毒基因在江西菌群的PCR測定結(jié)果

8對稻瘟病菌無毒基因特異性引物擴(kuò)增結(jié)果顯示均能擴(kuò)增出符合目的片段大小的指紋條帶，部分菌株擴(kuò)增電泳條帶結(jié)果如圖1所示。無毒基因在5個地區(qū)病圃的稻瘟病菌中檢測頻率差異較大。其中，都昌病圃菌株中8 個無毒基因的檢測頻率為0～83.33%，Avr-Pik最高為83.33%，Avr-Pit與PRE1未檢測到。井岡山病圃菌株中8 個無毒基因的檢測頻率為0～88.64%，Avr-Pizt最高為88.64%，Avr-Pit未檢測到。豐城病圃菌株中8個無毒基因的檢測頻率為2.56%～100%，Avr-Pizt最高為100%，Avr-Pit最低為2.56%。萬安病圃菌株中8 個無毒基因的檢測頻率為3.13%～100%，Avr-Pizt與Avr-Pia最高均為100%，Avr-Pit最低為3.13%。婺源病圃菌株中8 個無毒基因的檢測頻率為0～100%，Avr-Pik、Avr-co39與PRE1最高均為100%，Avr-Pit最低為0，未檢測到（表2）。

圖1 部分稻瘟病菌無毒基因Avr-Pik PCR檢測結(jié)果Fig.1 The PCR detection results of avirulence gene Avr-Pik from partial strains of Magnaporthe oryzae

表2 稻瘟病菌無毒基因在江西菌株中的分布檢測結(jié)果Tab.2 Distribution of avirulence genes of Magnaporthe oryzae in strains isolated from Jiangxi

2.2 稻瘟病菌致病基因在江西菌群的PCR測定結(jié)果

8 對稻瘟病致病基因的特異性引物除MNH1均能擴(kuò)增出符合目的基因條帶，部分PCR 檢測結(jié)果如圖2 所示。供試的稻瘟病菌致病基因在5 個地區(qū)病圃的稻瘟病菌中檢測頻率差異較大。其中，都昌病圃菌株中8 個致病基因的檢測頻率為0～90.48%，MPG1最高為90.48%，MNH1未檢測到。井岡山病圃菌株中8 個致病基因的檢測頻率為0～93.18%，MPG1與MagB最高均為93.18%，MNH1未檢測到為0。豐城病圃菌株中8 個致病基因的檢測頻率為0～100%，MPG1最高為100%，MNH1未檢測到為0。萬安病圃菌株中8 個致病基因的檢測頻率為0～100%，MPG1、MPS1與MgS11最高均為100%，MNH1未檢測到為0。婺源病圃菌株中8 個致病基因的檢測頻率為0～100%，MPG1最高為100%，MNH1最低為0，未檢測到（表3）。

圖2 部分稻瘟病菌致病基因MagB檢測結(jié)果Fig.2 The PCR detection results of pathogencity gene MagB from partial strains of Magnaporthe oryzae

表3 稻瘟病菌致病基因在江西菌株中的分布檢測結(jié)果Tab.3 Distribution of pathogencity genes of Magnaporthe oryzae in strains isolated from Jiangxi

2.3 江西稻瘟病菌群體遺傳宗譜分析

將5個地區(qū)病圃稻瘟病菌中檢測的16個毒性相關(guān)基因結(jié)果按順序排列，用專業(yè)軟件進(jìn)行聚類分析，聚類結(jié)果見圖3。在本研究中以0.72遺傳相似水平下分析稻瘟病菌群體結(jié)構(gòu)特征層次比較豐富（表4），遺傳宗譜劃分較為合理。在0.72 遺傳相似水平下，江西5 個地區(qū)病圃稻瘟病菌群可以劃分為11 個遺傳宗譜。其中宗譜JX1 占總菌株數(shù)的28.57%，宗譜JX2 占總菌株數(shù)的36.51%，宗譜JX3 占總菌株數(shù)的10.58%，宗譜JX4 占總菌株數(shù)的2.65%，宗譜JX5 占總菌株數(shù)的1.59%，宗譜JX6 占總菌株數(shù)的1.06%，宗譜JX7 占總菌株數(shù)的7.41%，宗譜JX8 占總菌株數(shù)的5.29%，宗譜JX9 占總菌株數(shù)的1.59%，宗譜JX10 占總菌株數(shù)的0.53%，宗譜JX11占總菌株數(shù)的4.23%。宗譜JX1與JX2為優(yōu)勢宗譜，JX3為婺源病圃菌株特有宗譜，其他宗譜類型為小宗譜或稀有宗譜，具有地域特有性特征。

表4 在遺傳系數(shù)0.72水平下稻瘟病菌群體的遺傳宗譜Tab.4 Genetic lineages of Magnaporthe oryzae strains at the genetic similarity coefficient level of 0.72

圖3 稻瘟病菌毒性基因檢測結(jié)果聚類分析Fig.3 Cluster map based on virulence genes detection of Magnaporthe oryzae

3 結(jié)論與討論

稻瘟病菌在長期的進(jìn)化過程中，其群體遺傳結(jié)構(gòu)隨品種、地理環(huán)境、栽培方式等因素變化而發(fā)生變異，病原菌毒性相關(guān)基因及其致病型的組成和變異直接關(guān)系到稻瘟病的發(fā)生和流行［21］。監(jiān)測區(qū)域稻瘟病毒性基因特別是無毒基因，對地區(qū)的病害防控具有科學(xué)的指導(dǎo)意義。傳統(tǒng)方法是利用含有單基因抗瘟品種接種稻瘟病菌，根據(jù)抗感反應(yīng)推導(dǎo)菌株含有與抗瘟基因相對應(yīng)的無毒基因，該方法由于受操作人員、環(huán)境等因素影響結(jié)果準(zhǔn)確率，且工作量大，勞動強(qiáng)度高。隨著越來越多的稻瘟病菌無毒基因被鑒定與克隆，利用特異性引物來檢測無毒基因被認(rèn)為是目前最有效的手段。

本研究利用已公開報道克隆的8 個致病基因和8 個無毒基因特異性引物測定了2020 年從江西5 個稻瘟病自然病圃中分離的189 個單孢菌株毒性相關(guān)基因的分布情況。結(jié)果表明：8 個無毒基因Avr-pia、Avr-pizt、ACE1、Avr-pit、Avr-pita、Avr-co39、Avr-pik、PRE1在江西都昌、井岡山、豐城、萬安、婺源5 個稻瘟病自然病圃稻瘟病菌的檢測頻率存在較大差異。其中都昌菌株中Avr-pik檢測頻率最高，井岡山、豐城、萬安菌株中Avr-pizt檢測頻率均最高，婺源菌株中Avr-pik、Avr-co39、PRE1檢測頻率均最高為100%，而Avr-pit在所有地區(qū)菌株中檢出頻率都是最低。因此，與檢出頻率高相對應(yīng)的稻瘟病抗病基因在江西具有重要的應(yīng)用潛力，而與檢出頻率低相對應(yīng)的稻瘟病抗病基因應(yīng)當(dāng)慎用。8 個致病基因MNH1、MgATG5、MPG1、MgYCA1、MgS11、MagB、MPS1、CPKA在江西5 個地區(qū)稻瘟病自然病圃菌株中只檢測到7 個，MNH1未檢測到，且存在較大的分布差異。MPG1在5 個地區(qū)病圃稻瘟病菌的檢測頻率均為最高在90%以上，可見江西稻瘟病菌遺傳多樣性較豐富。

基于稻瘟病菌毒性相關(guān)基因的遺傳宗譜測定更符合病菌本身的遺傳特性。本研究中江西5 個稻瘟病病圃菌株在16個稻瘟病菌毒性相關(guān)基因測定結(jié)果聚類被劃分為11個遺傳宗譜，其中宗譜的菌株比例存在很大的差異，3 個優(yōu)勢宗譜JX1、JX2、JX3 占總菌株數(shù)的75.66%，其他8 個小宗譜或稀有宗譜只占總菌株數(shù)的24.34%，結(jié)果表明江西稻瘟病菌株遺傳結(jié)構(gòu)豐富，但又存在優(yōu)勢種群。此外，在不同地區(qū)的稻瘟病菌群存在著獨(dú)特的遺傳宗譜類型，比如宗譜JX3 只存在婺源稻瘟病圃菌株中，宗譜JX5 只存在都昌稻瘟病圃菌株中，宗譜JX6 與JX10 只存在井岡山稻瘟病圃菌株中。不同地區(qū)的宗譜多樣性使得稻瘟病菌的毒性也不同，這也與筆者多年多點的水稻品種稻瘟病抗性鑒定結(jié)果一致，相同的品種在不同地區(qū)的稻瘟病病圃中的抗性表現(xiàn)存在差異。

由于田間稻瘟病菌具有易變性的特點，尤其是無毒基因的變異是導(dǎo)致水稻抗瘟品種抗性喪失的主要原因，抗瘟品種的持久抗性與其種植地區(qū)稻瘟菌致病基因和無毒基因的變化密切相關(guān)［22］。因此，對不同地區(qū)稻瘟病菌致病基因和無毒基因分布測定和動態(tài)變化監(jiān)測，指導(dǎo)當(dāng)?shù)厮究刮疗贩N的合理布局，是有效防控稻瘟病流行發(fā)生的重要手段，也是一項長期性的基礎(chǔ)工作。本研究結(jié)果顯示江西省稻瘟病菌無毒基因與致病基因組成復(fù)雜多樣，且遺傳宗譜具有地域特有性特點。從稻瘟病菌無毒基因檢測結(jié)果來看，在江西水稻品種安全布局中，含有抗性基因Pia、Pizt和Pik的品種具有較好的推廣價值。

致謝：江西現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科研協(xié)同創(chuàng)新專項（JXXTCX201901，JXXTCXBSJJ202119）同時對本研究給予了資助，謹(jǐn)致謝意！