二次諧波光譜和布魯斯特角顯微鏡研究二棕櫚酰磷脂酰膽堿和維生素B2的相互作用

劉江清， 于長卉， 郭 源， 雷圣賓*， 張 貞*

1. 天津大學(xué)理學(xué)院化學(xué)系， 天津 300072

2. 北京分子科學(xué)國家研究中心, 中國科學(xué)院化學(xué)研究所， 北京 100190

3. 中國科學(xué)院大學(xué)， 北京 100049

引 言

界面手性是當(dāng)今物理化學(xué)及相關(guān)學(xué)科研究的重點(diǎn)科學(xué)問題。 其對于藥物特異性設(shè)計(jì)、 手性傳感器的開發(fā)以及手性分離技術(shù)的發(fā)展具有重要意義[1]。 其中， 磷脂Langmuir單層膜因?yàn)槌３Ｗ鳛檠芯可锬さ哪Ｐ腕w系而倍受青睞[2]。 二二棕櫚酰磷脂酰膽堿(dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine， DPPC)是Langmuir單層膜研究最多地分子。 其在界面的手性結(jié)構(gòu)及其與其他分子的相互作用一直是這方面研究的前沿問題。 磷脂熒光顯微鏡和布魯斯特角顯微鏡已經(jīng)發(fā)現(xiàn)L-DPPC， D-DPPC能在氣液界面形成手性相反的兩種手性微疇結(jié)構(gòu)[3]。 如何從分子水平解釋這兩種相反手性微疇結(jié)構(gòu)的形成機(jī)理及外來物質(zhì)對此的影響， 一直是一個(gè)有待解決的科學(xué)問題， 需要聯(lián)合應(yīng)用具有界面選擇性和靈敏性的譜學(xué)方法和成像技術(shù)進(jìn)行深入研究。

維生素B2(VB2)作為一種針對組織脂質(zhì)沉積疾病的有效藥物， 已經(jīng)被證明可以顯著改善乙酰-CoA脫氫酶缺乏癥(riboflavin-reactive multiple acyl-CoA dehydrogenase deficiency， RR-MADD)的臨床癥狀， 甚至減少或去除某些患者肌肉纖維中的脂質(zhì)聚集體[4]。 VB2作為一種藥物分子， 它和磷脂手性的選擇性相互作用可能有助于理解VB2如何在膜生物事件中起到關(guān)鍵性作用。

二次諧波-線二色譜(second harmonic generation linear dichroism， SHG-LD)也已經(jīng)成為單層膜手性研究中一種重要的手性識別原位方法之一， 可以通過表面手性過量值(degree of chiral excess， DCE)值的大小和方向判別界面是否具有手性結(jié)構(gòu)， 為描繪界面微疇組織中分子骨架的扭轉(zhuǎn)排列提供依據(jù)[5]。

布魯斯特角顯微鏡(Brewster angle microscopy, BAM)是一種實(shí)時(shí)原位監(jiān)測脂質(zhì)單層膜形貌和相變過程的技術(shù)[6]。 其最大優(yōu)勢是可以給出共存相上微疇的位置、 密度、 形狀、 大小和數(shù)目及分子之間的相互作用[7]。

本工作利用二次諧波光譜、 Langmuir膜天平和布魯斯特角顯微鏡研究了L-DPPC， D-DPPC以及race-DPPC三者與VB2分子間相互作用， 發(fā)現(xiàn)VB2既可以調(diào)控界面DPPC微疇尺寸， 也能誘導(dǎo)race-DPPC Langmuir單層膜出現(xiàn)手性相分離。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料和樣品制備

本研究中使用的L-DPPC， D-DPPC， race-DPPC購買于Sigma-Aldrich 公司(>99.5%)， 甲醇和氯仿(98%)購自Fisher Scientific公司， VB2購買于Sigma-Aldrich公司(純度>99.5%)。 L-DPPC， D-DPPC和VB2分子結(jié)構(gòu)式如圖1所示， 以上試劑均未經(jīng)進(jìn)一步處理直接使用。 實(shí)驗(yàn)所用純水為超純水儀(Millipore company， 18.2 MΩ·cm)處理過的去離子水。 所有實(shí)驗(yàn)均在室溫(23 ℃)和常壓下進(jìn)行。 L-DPPC， D-DPPC， race-DPPC溶于氯仿/甲醇混合物(體積比： 3∶1V/V)， 配制成0.5 mmol·L-1濃度的溶液。 為了研究VB2分子對DPPC單層膜微疇的影響， 本實(shí)驗(yàn)將該DPPC溶液用微量進(jìn)樣器鋪展在純水界面和亞相為VB2溶液(0.085 mmol·L-1)上形成Langmuir單層膜。

圖1 (a) L-DPPC分子結(jié)構(gòu)式； (b) D-DPPC結(jié)構(gòu)式；(c) VB2分子結(jié)構(gòu)式

1.2 表面壓力面積-等溫線(等溫線)

等溫線研究是在Langmuir膜天平中進(jìn)行測量的。 該天平配備了一個(gè)324 mm×75 mm特氟龍樣品槽(KSV， 芬蘭)、 兩個(gè)滑障(Delrin)用來提供對稱的薄膜壓縮和平衡。 采用Wilhelmy吊片法(鉑片)對薄膜壓縮過程中的表面壓力和平均分子面積進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測。 使用微量進(jìn)樣器將60 μL的溶液均勻鋪展在界面上， 等待10 min使有機(jī)溶劑完全揮發(fā)。 滑障的平均壓縮速率為10 mm·min-1。 所有的等溫線經(jīng)過多次重復(fù)。 通過對每個(gè)單獨(dú)的和混合的DPPC單層膜進(jìn)行多次Langmuir膜平衡和BAM顯微鏡實(shí)驗(yàn)， 并確保每條等溫線都在誤差范圍內(nèi)， 確定其可重復(fù)性。 所有實(shí)驗(yàn)均在常溫常壓下進(jìn)行。

1.3 二次諧波-線二色譜法

二次諧波-線二色譜(SHG-LD)研究界面單層膜手性的實(shí)驗(yàn)描述已經(jīng)在以往的研究報(bào)導(dǎo)過[8]。 本研究所用的SHG-LD儀器簡要描述如下， 脈沖寬度為80 fs、 重復(fù)頻率為82 MHz的寬帶可調(diào)諧鎖模飛秒鈦寶石激光器(Tsunami 3960C， SpectraPhysics)產(chǎn)生中心波長為800 nm的基頻光作為入射光， 入射光通過偏振器和半波片， 最后通過光學(xué)透鏡(f=100 mm)聚焦在空氣/水界面上， 入射光強(qiáng)度為600 mW·cm-2。 界面上產(chǎn)生的二次諧波(SH)信號光通過短通濾波片過濾， 由單色儀(WDG10， 北京精工成機(jī)電設(shè)備有限公司)收集， 然后經(jīng)過前置放大器(SR445A， Stanford research system)、 單光子計(jì)數(shù)器(SR400， Stanford research system)及光電倍增管(R585， Hamamatsu)檢測。 通過自動(dòng)旋轉(zhuǎn)半波片， 在不同的入射偏振角下進(jìn)行S偏振檢測， 得到偏振曲線， 由此偏振曲線確定體系的DCE值。 樣品池直徑為7 cm， 通過檢查H2O界面手性信號， 確定其DCE=0， 表明實(shí)驗(yàn)中手性檢測不存在系統(tǒng)誤差。 使用微量進(jìn)樣器將濃度為0.5 mmol·L-1的L-DPPC， D-DPPC和race-DPPC的溶液以體積分別為25， 28和30 μL鋪展在界面上， 形成Langmuir單層膜。

1.4 布魯斯特角顯微鏡

布魯斯特角顯微鏡(BAM)是基于KSV Langmuir膜天平由本實(shí)驗(yàn)室自行搭建的。 該裝置使用He-Ne激光(HNL210LB， Thorlabs)作為入射光源。 該光源波長為632.8 nm， 輸出功率為21 mW的平行光， 以53.1°的角度入射到氣液界面， 經(jīng)過半波片和格蘭棱鏡衰減和起偏后入射到氣液界面。 反射光通過無窮遠(yuǎn)校正的20×Nikon物鏡和半消色差透鏡(f=200 mm)進(jìn)入到CCD(Retiga R6TM， Teledyne Photometrics)， 收集BAM成像信息。 研究中全幅圖像的視野大小為648 μm×400 μm， 使用ImageJ軟件對BAM捕獲的圖像進(jìn)行處理。 圖像僅進(jìn)行裁剪以及圖片增強(qiáng)， 未對圖像進(jìn)行其他處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 π-A等溫線

如圖2所示， 在VB2分子的影響下， L-DPPC單層膜起始單分子面積右移了約10 ?2。 分析認(rèn)為VB2分子趨向于與L-DPPC?；g相互作用， 使DPPC分子親水基團(tuán)與水的接觸面積變大[9]。 從純水界面上的L-DPPC和D-DPPC π-A等溫線中可以觀察到當(dāng)單分子面積減小到約86 ?2時(shí)， 液態(tài)擴(kuò)展相(liquid expand phase， LE相)開始向凝聚相(liquid condensed phase， LC相)轉(zhuǎn)變。 表1為DPPC單層膜的不同相變點(diǎn)(πt1表示LE/LC共存相的初始膜壓和終止膜壓)， 從圖2和表1中可以看出LE/LC相都處于3～10 mN·m-1的膜壓范圍。 純水界面外消旋單層膜的LE/LC共相階段的平均分子面積位置和膜壓區(qū)域發(fā)生變化， 說明在相同的膜壓下外消旋單層膜上分子的空間排列和取向發(fā)生了變化[10]， 而VB2水溶液上race-DPPC單層膜的LE/LC共存相的平臺區(qū)域消失。 兩種亞相下L-DPPC和D-DPPC單層膜LE-LC階段的膜壓幾乎不發(fā)生變化。 然而， 僅通過模壓并不能推斷在3～10 mN·m-1內(nèi)， VB2對L-DPPC和D-DPPC的分子間排列沒有影響， 因?yàn)榭赡艽嬖谥榛湲悩?gòu)化的二級相變[11]。 此外， 水溶性VB2結(jié)構(gòu)中存在大量的親水基團(tuán)， 其表面活性非常低， VB2不可能通過滲透作用取代H2O分子， 更不可能可能替代高表面活性的DPPC分子， 因此VB2與DPPC分子發(fā)生相互作用的區(qū)域主要在脂質(zhì)分子的親水頭基。

圖2 在超純水和VB2水溶液界面上擴(kuò)散的L-DPPC， D-DPPC和race-DPPC單層膜的π-A等溫線

表1 L-DPPC， D-DPPC， race-DPPC的相變點(diǎn)和LC相的極限單分子面積

VB2溶液界面DPPC單層膜的LC相線段都向左移動(dòng)， 從表1中L-DPPC分別在純水與VB2表面上AC差值(≈9)來看， VB2的這種誘導(dǎo)似乎沒有手性選擇性。 因此， 在LC相時(shí)純水界面上race-DPPC單層膜內(nèi)自發(fā)的非單一手性(heterochiral interaction，EL-D)相互作用和VB2分子的誘導(dǎo)都使可壓縮面積減小， 這種自發(fā)的非單一手性相互作用大于單一手性(homochiral interaction，EL，L，ED，D)相互作用， 即L-D>L-L≈D-D。 VB2也影響了單層膜內(nèi)DPPC分子之間橫向的單一手性相互作用和非單一手性相互作用， 其強(qiáng)弱關(guān)系為L-D≈L-L≈D-D。 從表1中的崩潰膜壓(collapse pressure)πc來看， VB2分子的存在導(dǎo)致了L-DPPC和D-DPPC單層膜的崩潰膜壓升高， 說明VB2比水更有利于DPPC頭基的自由能最小化[12]， 使DPPC頭基的空間結(jié)構(gòu)體積變小。 相反， VB2誘導(dǎo)race-DPPC的塌縮膜壓降低， 破壞了這種較強(qiáng)的非單一手性相互作用， 導(dǎo)致崩潰壓降低。

式中， π為單分子層的表面壓力，A為單分子面積。

如圖3所示， 在單層膜處于LE/LC相時(shí)， 表面張力處于5～15 mN·m-1， 由于VB2的存在， L-DPPC彈性模量升高， L-DPPC的單層膜的分子排列得更緊密， L-DPPC烷基鏈相對界面法線的取向變得有序。 當(dāng)膜壓為15～35 mN·m-1時(shí), VB2仍然使L-DPPC烷基鏈變得更有序， 誘導(dǎo)D-DPPC和race-DPPC烷基鏈變得更無序。 為了進(jìn)一步理解這種相互作用的微觀細(xì)節(jié)， 利用SHG-LD方法研究DPPC分子在界面上的手性變化。

圖3 在超純水和VB2水溶液界面上L-DPPC， D-DPP和Crace-DPPC單層膜的表面張力分別為5， 15， 25和35 mN·m-1時(shí)的彈性模量

2.2 SHG-LD光譜

不同手性的DPPC分子單分子膜在VB2溶液界面相互作用不同， 因此有必要從分子水平研究界面L-DPPC， D-DPPC和race-DPPC分子的手性變化。 采用SHG-LD方法來檢測膜壓為13 mN·m-1時(shí)， L-DPPC， D-DPPC和race-DPPC的手性， 圖4為膜壓13 nN·m-1時(shí)L-DPPC， D-DPPC和race-DPPC的SH強(qiáng)度隨入射偏振化曲線。 從圖4(a, c)可以看出， 在純水界面上， L-DPPC和D-DPPC的SH信號強(qiáng)度相近(～60 counts)。 而在VB2水溶液亞相, D-DPPC與SH信號強(qiáng)度相近(～40 counts)， L-DPPC信號強(qiáng)度有所提升(～55 counts)， 表明此時(shí)分子取向更加有序； D-DPPC信號強(qiáng)度有所下降(～40 counts)； 表明此時(shí)分子取向變得較為無序。 從圖4(e, f)中可見， race-DPPC在兩種亞相上的SH信號強(qiáng)度大致相等(～73 counts)， 說明VB2對race-的DPPC微疇在界面上的分子結(jié)構(gòu)沒有影響。 如表2所示， L-DPPC和D-DPPC在純水界面的DCE值表明， 這兩種DPPC分子的自組裝微疇具有微弱的手性[15]； 當(dāng)亞相為VB2水溶液， D-DPPC的DCE增大， 表明D-DPPC單層膜內(nèi)的宏觀微疇也具有一定的手性結(jié)構(gòu)。 為了形象說明VB2對DPPC Langmuir 膜的影響， 對此體系進(jìn)行了布魯斯特顯微鏡測量。

圖4 單層膜處于13 mN·m-1， (a)， (b)為L-DPPC在純水和VB2水溶液表面的SH強(qiáng)度和DCE值; (c)， (d)為D-DPPC在純水和VB2水溶液表面的SH強(qiáng)度和DCE值; (e)， (f)為race-DPPC在純水和VB2水溶液表面的SH強(qiáng)度和DCE值

表2 單層膜處于13 mN·m-1， L-DPPC， D-DPPC和race-DPPC單層膜的DCE值

2.3 BAM觀察橫向微疇

如圖5(a)和(c)所示， 純水界面上的L-DPPC和D-DPPC單層膜上都經(jīng)歷了成核和生長過程。 當(dāng)膜壓升高至13 mN·m-1， 微疇會(huì)長出伸展臂以逆時(shí)針或者順時(shí)針方式彎曲， L-DPPC和D-DPPC形成直徑大小為15～30 μm的左旋和右旋的螺旋三葉草形狀的手性微疇， 與文獻(xiàn)報(bào)道一致[16]。 這種三葉草形成的條件與有機(jī)溶液中初始的DPPC的分子手性有關(guān)[16]。 此外， 壓縮速率和溫度均對最后形成微疇的大小有影響， 但是不會(huì)改變L-DPPC和D-DPPC相反的宏觀手性[17-18]。 從物理角度分析， 微疇的形狀是微疇之間靜電排斥和線張力之間競爭作用的結(jié)果， 脂質(zhì)分子垂直偶極距之間的靜電排斥使疇變長， 而線張力將疇拉成緊湊的形狀[19]。

如圖5(d)所示， 在VB2水溶液界面上D-DPPC微疇在13 mN·m-1處長成直徑大小約為40 μm的大三葉草結(jié)構(gòu)， 類似的這種左旋和右旋三葉草微疇對應(yīng)的DCE分別為正值和負(fù)值， 與本研究的SHG-LD的結(jié)果相符合。 與純水亞相相比， 微疇與微疇之間的距離增大， 微疇的面積增大了1～2倍。 VB2分子誘導(dǎo)微疇變大的原因， 可能來源于VB2在弱酸性條件下質(zhì)子化。 質(zhì)子化后的VB2與DPPC的磷脂頭基發(fā)生靜電相互作用， 使得微疇之間相互吸引。

圖5 單層膜處于13 mN·m-1， (a)， (b)分別為在純水和VB2水溶液表面上的L-DPPC微疇； (c)， (d)分別為在純水和VB2水溶液表面上的D-DPPC微疇； (e)， (f)分別為在純水和VB2水溶液表面上的race-DPPC微疇， 每張圖像大小為150 μm×50 μm

如圖5(b)所示， VB2水溶液上的L-DPPC的BAM圖像除了三葉草微疇外， 還出現(xiàn)了四葉草微疇， 其枝臂曲率的方向沒有統(tǒng)一的指向， 而且其微疇枝臂上的手性狀態(tài)也不一致。 L-DPPC和D-DPPC單層膜在VB2水溶液界面上出現(xiàn)了鏡像的心臟型微疇， 這種不同于三葉草形狀微疇的出現(xiàn)可能是由DPPC不同水解位點(diǎn)產(chǎn)生的兩個(gè)對映體產(chǎn)物的分離。 此外， 還觀察到DPPC分子在界面上不同位置碰撞成核生長的速率也不盡相同。 導(dǎo)致圖5(b)和(d)中夾雜著其他心臟型結(jié)構(gòu)的微疇。 另外， 在圖5(b)中也發(fā)現(xiàn)了四葉草微疇結(jié)構(gòu)， 可能因L-DPPC的水解產(chǎn)物聚集而形成。 圖5(e)展示了VB2和race-DPPC的相互作用。 從圖中可見， race-DPPC單層膜的微疇的密度較大， 最后長成直徑為10 μm大小的圓形微疇， 非單一手性相互作用使微疇的密度增大， 疇與疇之間的斥力較大， 在純水界面上的race-DPPC的微疇圓形有被拉長的趨勢。 SHG-LD也表明其DCE不等于零[圖4(f)]。 這是一個(gè)有趣的新現(xiàn)象。 其原因可能有兩種， 一是微疇內(nèi)對映體過剩， 存在著手性相分離； 二是DPPC的水解產(chǎn)物聚集引起的。 這種現(xiàn)象從圖5(f)可以看得更清楚。 VB2溶液的界面race-DPPC微疇密度降低， 脂質(zhì)分子聚集體中垂直偶極矩的斥力相互作用使圓形的微疇周圍出現(xiàn)了枝臂， 存在著手性相分離， 導(dǎo)致了非零值的DCE。 由二次諧波光譜測量的DCE的絕對值的大小反映了微疇結(jié)構(gòu)的不對稱度， 表明了微疇內(nèi)對映體的相對剩余量。 微疇中某一種對映結(jié)構(gòu)的相對剩余量越多， 就會(huì)在宏觀上表現(xiàn)出相應(yīng)的宏觀手性。

圖6(a)—(f)為VB2水溶液上L-DPPC結(jié)構(gòu)隨膜壓變化的BAM圖。 從此圖能夠?qū)崟r(shí)觀察到了在VB2水溶液上的L-DPPC的成核生長過程。 因此可以推斷L-DPPC在VB2溶液界面自組裝過程。 首先DPPC界面上成核生長至心臟型微疇， 然后心臟型微疇之間相互識別， 心臟型的尖端邊緣的分子密度很大， 心臟尖端與尖端之間進(jìn)行組裝， 形成了S型的微疇結(jié)構(gòu)， 最后這些S型的微疇結(jié)構(gòu)， 組裝成了左旋的三葉草。

圖6 L-DPPC單層膜處于13～15 mN·m-1處在VB2水溶液界面三葉草生長過程(a—f)的BAM圖片， 每張圖像大小為150 μm×50 μm

3 結(jié) 論

通過二次諧波-線二色(SHG-LD)光譜、 布魯斯特角顯微鏡(BAM)及膜壓曲線研究了維生素B2(VB2)與二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)氣液界面Langmuir膜的相互作用。

(1) 膜壓曲線表明， VB2可與DPPC分子發(fā)生明顯的相互作用。 VB2可以提高L-DPPC單層膜的穩(wěn)定性。

(2) SHG-LD測量表明， VB2對于L/D-DPPC手性的形成具有促進(jìn)作用， 并且誘導(dǎo)race-DPPC也形成手性結(jié)構(gòu)。

(3) BAM研究表明， VB2可使 D-DPPC三葉草形狀的大小增長1～2倍， 且不改變分枝數(shù)。 VB2可誘導(dǎo)race-DPPC發(fā)生手性相分離。