基于表面增強拉曼技術的致病菌及其耐藥性檢測研究進展

伏秋月， 方向林， 趙 毅， 邱 訓， 王 鵬， 李紹新*

1. 廣東醫(yī)科大學生物醫(yī)學工程學院生物醫(yī)學光子學實驗室， 廣東 東莞 523808

2. 廣東省分子診斷重點實驗室， 廣東 東莞 523808

引 言

細菌耐藥已經成為臨床抗感染治療中一個非常棘手的問題， 全球每年因細菌感染造成的死亡高達670萬人， 消耗的治療費用在數(shù)百億美元以上[1]。 隨著抗菌藥物的大量使用， 這使得致病菌及其耐藥性的快速檢測變得迫切需要， 及時選擇合適的抗生素治療， 從而改善患者的預后， 同時避免不適當?shù)闹委煟?以及不必要的廣譜抗生素的使用[2]。 基于傳統(tǒng)培養(yǎng)方法的檢測是臨床檢測中細菌以及耐藥性鑒定的金標準。 傳統(tǒng)的致病菌檢測方法是將分離培養(yǎng)后的可疑菌落做涂片染色實驗(革蘭染色)、 生化反應實驗、 溶血實驗、 協(xié)同溶血實驗、 動物實驗及典型運動等鑒定方法， 例如利用顯色培養(yǎng)基檢測大腸桿菌。 這些方法費時費力， 而且一般一次實驗只能檢測單一細菌， 不能滿足臨床需要[3]。

為了克服傳統(tǒng)檢測方法的局限性， 人們對其進行了改進。 目前臨床檢驗最廣泛使用的方法有紙片擴散法、 梯度擴散法、 肉湯稀釋法或商用半自動系統(tǒng)。 雖然這些方法既經濟又準確， 但是細菌培養(yǎng)和藥敏試驗至少要24小時才能得出結果， 不能滿足臨床快速檢測的需求[4]。 近年來， 隨著分子生物學、 微生物生理學等學科的飛速發(fā)展， 一些新型的藥敏檢測技術不斷涌現(xiàn)， 如聚合酶鏈反應， 分子雜交技術、 流式細胞熒光法[5]、 質譜、 表面等離子體共振、 拉曼光譜、 激光鑷子、 和阻抗方法等， 這些方法各有優(yōu)缺點， 有的不能檢測多重耐藥菌， 有的需要昂貴的試劑， 有的樣品預處理復雜耗時等[6]。 雖然總體上這些方法加快了檢測速度， 一般能在幾個小時內得到結果， 但在穩(wěn)定性及可操作性上還需繼續(xù)研究。

在以上新型檢測方法中， 拉曼光譜技術顯示出了快速鑒定致病菌及其耐藥性的巨大潛力。 拉曼光譜是基于拉曼散射效應的分子振動光譜[7]， 它能夠提供關于分子結構和構型的“指紋”信息。 其譜峰窄， 分辨率高， 可以靈敏顯示致病菌間的細微差別[8]。 普通拉曼散射的拉曼散射信號弱、 效率低， 難以有效測量生物材料的拉曼光譜[9]， 往往需要高光譜受激拉曼[10-11]進行檢測或者借助標記手段來檢測， 例如重水標記[12]。 普通拉曼檢測方法提供了微生物細胞的可重復拉曼光譜。 這種光譜再現(xiàn)性對于在不同實驗室使用拉曼光譜進行微生物鑒定非常重要。 當樣品與某些金屬如銀、 金等粗糙表面接觸時， 其拉曼散射信號會急劇增強， 最高可達10個數(shù)量級以上[13]， 這種現(xiàn)象稱為表面增強拉曼散射相應的光譜稱為表面增強拉曼光譜(surface enhanced Raman scattering, SERS)。 SERS檢測致病菌所需樣品量少， 可以實現(xiàn)無標記、 非接觸、 它不需要任何有毒的免疫化學染色[10]。 免標記檢測直接反應病原菌本身的信息， 免去了繁瑣耗時的標記程序， SERS可以提供更精細更豐富的致病菌生化特征和對抗生素的生化反應[14]。 但是， 利用SERS技術檢測致病菌還存在不足。 第一， 由于SERS“熱點”難以控制， SERS信號重復性欠佳。 第二， 致病菌體積小、 在溶液中處于運動狀態(tài)、 難以聚焦測量。 第三， SERS光譜維度高且致病菌間光譜輪廓高度相似， 普通的數(shù)據(jù)分析方法不易區(qū)分。 針對上述SERS檢測中面臨的一系列困難， 各研究團隊從SERS基底的設計、 致病菌的捕獲技術以及數(shù)據(jù)分析方法三個方面提出了各種解決辦法。

1 SERS基底的設計

SERS基底的材料和結構對于致病菌檢測至關重要， 不同的合成方法、 形貌和表面結構直接影響分析結果。 SERS基底的材料主要有銀和金。 銀的增強效果優(yōu)于金， 但是銀在空氣中極易氧化。 SERS基底的結構直接影響基底的整體性能[15]。 SERS基底結構主要分為粒子型和平面陣列型。 平面陣列型SERS基底一般采用周期性點陣結構， 其SERS“熱點”分布均勻， SERS光譜重復性較好且方便直接測量。 粒子型種類繁多， 主要有球形、 桿狀以及復合粒子。 銀納米粒子制備過程中粒子大小不一， 均勻性不佳， 在空氣中極易氧化， 而金納米粒子尺寸均一， 穩(wěn)定性優(yōu)于銀納米粒子。 因此， 采用先制備金納米粒子再包裹一層銀的方法制備的Au@AgNPs復合粒子， 粒子大小可控、 形狀均勻、 穩(wěn)定性極佳[16]。 粒子型SERS基底制備簡便， 對其加以修飾可方便其附著在細菌表面。

Liu等[17]用電化學鍍銀的方法產生平均長度為60 nm的銀納米粒子陣列。 對甲氧西林敏感的金黃色葡萄球菌和野生型大腸桿菌以及臨床分離株的抗生素敏感性試驗(antibiotic susceptibility testing, AST)和最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration, MIC)快速檢測， 其SERS光譜中的特定生物標記物的強度在兩小時內明顯下降。 表明其在補充現(xiàn)有耗時的方法以及幫助緩解臨床細菌耐藥方面具有很高的潛力。 Yuan等[18]研發(fā)了一種基于大小可調的Au@Ag納米粒子包覆貽貝殼的復合SERS陣列基底[圖1(a)—(d)]快速鑒別大腸埃希菌、 金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌。 貽貝殼中CaCO3的高含量導致了分析物的超高疏水性， 交叉的納米板和納米通道提供了豐富的SERS熱點。 對羅丹明的SERS檢出限可低至10-9mol·L-1。 這種新穎的Au@Ag自組裝貽貝殼基底在基于SERS的生物傳感器中作為低成本、 耐用和可復制的基底中具有相當大的應用前景。

圖1 (a)—(d)Au@AgNPs的高倍透射電鏡圖， Ag殼層厚度分別為1， 3， 5和7 nm[18]； (e) Au@AgNR的透射電鏡圖[16]； (f) B-g-PAMDAC的透射電鏡圖[20]

Wei等[19]以銀納米粒子為基底， 利用SERS檢測5種食源性致病菌， 在10 min內實現(xiàn)了大腸桿菌O157∶H7、 鼠傷寒沙門菌、 福氏志賀菌、 布魯菌S2株以及金黃色葡萄球菌的快速鑒別， 且金屬基底增強穩(wěn)定性高， 重復性較好。 Bi等[16]開發(fā)了一個具有SERS活性的Au@Ag核殼納米棒[圖1(e)]用于超敏感細菌檢測和抗生素敏感性試驗(AST)。 納米棒和細菌之間的等離子體效應提高了SERS檢測限。 大腸桿菌的檢測范圍為107～102CFU·mL-1。 通過分析細菌拉曼強度變化可以獲得快速的抗生素耐藥性檢測(<3.5 h)， 該方法可以實現(xiàn)致病菌及耐藥性的快速檢測。 Zhang等[20]合成了氧化石墨烯(GO)和4-巰基苯基硼酸(4-MPBA)修飾的Au@AgNPs[圖1(f)]。 細菌聚集在其周圍導致大量的“熱點”并產生強烈的拉曼信號。 即使在低細菌濃度為103CFU·mL-1時， 也具有較高的靈敏度、 準確性和穩(wěn)定性。

2 致病菌捕獲技術

在溶液中直接檢測致病菌， 可以實時觀測藥物分子與致病菌的作用過程， 有利于進一步理解細菌與藥物的相互作用， 是實現(xiàn)快速AST檢測的有效途徑。 但是， 致病菌在溶液中處于布朗運動狀態(tài)， 不易對其直接測量。 目前， 人們采用了各種捕獲并固定致病菌的方法： 核酸適配體、 免疫磁性分離、 微流控、 靜電吸引等。

2.1 核酸適體結合

適體是一組單鏈DNA或RNA分子， 可以通過范德華力、 氫鍵、 疏水和靜電相互作用結合到靶向細菌的表面。 適體的體積小， 易于合成和標記， 缺乏免疫原性， 以及靶標結合親和力和特異性高。 一種細菌可以結合多種適體， SERS信號在原位被放大， 可實現(xiàn)高靈敏度的檢測。 研究人員已經通過基于SERS的適體和拉曼標記成功檢測出金黃色葡萄球菌和鼠傷寒沙門氏菌。 Zhang[21]、 Pang等[22]合成了適體-Fe3O4@Au磁性納米粒子(圖2)作為特異性細菌富集和SERS活化底物， 萬古霉素-SERS標簽用于致病菌的靈敏定量。 在50 min內可以達到3個細胞/毫升的檢測限。 然而， 這些策略需要繁瑣的修改過程或依賴于拉曼標記。 Gao等[23]依靠適體在細菌表面原位合成了細菌適體@AgNPs， 細菌SERS信號被其特異性識別的適體顯著增強。 該方法無須標記， 檢測限低至1.5 CFU·mL-1。

圖2 細菌適體-AgNPs原位形成示意圖[23]

2.2 免疫磁性分離

免疫磁性分離技術采用初級抗體修飾的磁性納米結構來濃縮細菌， 其將夾心型測定與磁分離相結合。 磁性納米材料的表面積與體積比具有較高的捕獲效率。 采用鏈霉素-親和素級聯(lián)放大系統(tǒng)大大提高了致病菌的檢測限， 致病菌與磁性納米粒子采用抗原抗體特異性結合所需樣品量少、 檢測時間短。 使用大腸桿菌抗體結合磁性金納米粒子(Fe3O4@Au)對大腸桿菌進行選擇性分離和富集[24]以及計數(shù)， 該方法快速、 靈敏， 總分析時間少于70 min。 Kearns等[25]使用凝集素功能化的磁性納米顆粒捕獲細菌[圖3(a)]， 然后使用菌株特異性抗體功能化SERS活性納米顆粒特異性檢測細菌[圖3(b)和(c)]。 成功分離并檢測出三種致病菌： 大腸桿菌、 鼠傷寒沙門氏菌和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌[圖3(d)]， 每種菌株的最低檢測濃度僅為101CFU·mL-1。 Yuan等[26]利用抗菌肽功能化的磁性納米粒子以及4-巰基苯硼酸標記的Au@Ag-GO納米復合材料成功分離大腸桿菌、 金黃色葡萄球菌和綠膿桿菌[圖3(e)—(f)]。 此外腺苷酸修飾的Fe3O4納米粒子具有高抗菌活性， 可以同時分離、 識別和殺死細菌。

圖3 (a)凝集素(Con A)功能化的鍍銀磁性納米顆粒(Ag@MNPs)與細菌結合， 磁體的存在下從樣品基質中分離細菌; (b)抗體和SERS標簽添加； (c)將3個AgNP綴合物與3種細菌病原體和Con A(結合所有三種細菌)一起加入， 利用532 nm激光進行分析[25]； (d)腺苷酸修飾的與樣品基質(包括細菌、 血細胞或其他干擾物)一起培養(yǎng)； (e)Fe3O4NPs @細菌復合物與樣品基質磁性分離； (f)4-巰基苯硼酸修飾的Au@Ag-GO與Fe3O4NPs @細菌復合物一起培養(yǎng)以形成夾層結構[26]

2.3 微流控-SERS檢測系統(tǒng)

微流控是在微米尺度下對微量的流體進行精準操控的一種技術， 多種微流控芯片可實現(xiàn)致病菌分離。 電泳可以通過施加電場使微通道中的分子和粒子產生偏移從而達到富集或分離的目的。 多電極微流控芯片施加電流時， 不同的電極組合方式會產生不同的電場分布， 實現(xiàn)致病菌分離。 該技術具有低成本、 便攜性、 易控制、 低劑量、 響應時間短、 精度和靈敏度高等優(yōu)異的特征。 Chang等[27]開發(fā)了一種集成膜過濾和SERS 檢測的微流體裝置[圖4(a)]， 用于細菌富集、 代謝物提取和原位SERS測量。 封閉的微環(huán)境可以保證代謝物在SERS底物上穩(wěn)定、 均勻的吸附。 通過比較抗生素處理前后細菌分泌的代謝物的特征拉曼信號變化可以在2 h內準確確定最低抑菌濃度， 并且不會受到細菌聚集和不均勻分布問題的影響。 Madiyar等[28]報告了通過在微流控芯片的底部嵌入垂直排列的碳納米纖維制成的納米電極陣列[圖4(b)和(c)]， 用于有效地捕獲和濃縮大腸桿菌。 然而， 這些器件存在限制了吞吐量和分離效率， 電極污染， 以及無法處理樣品碎片等不足。 Honson等[29]發(fā)明了一種非接觸的介電泳-SERS器件[圖4(d)]， 電極通過絕緣屏障與樣品通道隔離， 防止電極污染， 該器件集成了阻抗分析可以分離和捕捉細菌， 并且識別碎片。 該裝置已成功地從3 μm聚苯乙烯微球中分離出了分枝桿菌， 準確率為100%。

圖4 (a)微流控系統(tǒng)及器件原理圖[27]； (b) 在4倍放大下拍攝的光學顯微鏡圖像， 顯示微流體通道和中心的活性正方形[28]； (c)四個具有多項式邊界的電極對稱排列以及電勢場分布和電泳力的曲線圖[30]； (d)介電泳-SERS裝置的示意圖[29]

2.4 靜電結合檢測

革蘭陽性菌表面的肽聚糖和革蘭陰性菌表面的脂多糖都帶負電荷， 負電荷脂多糖是幾種革蘭氏陰性細菌的主要內毒素和外膜成分， 帶負電荷的細菌表面物質成為致病菌SERS檢測的生物標志物。 因此， 帶正電荷的納米粒子和帶負電荷的細菌結合后， 納米粒子在致病菌表面形成大量的SERS “熱點”， 這種檢測方法大大增加了致病菌及其耐藥性的檢測限。 Fang等[31]發(fā)現(xiàn)帶正電荷的銀納米粒子通過靜電聚集在細菌壁表面， 增強的SERS信號優(yōu)于標準基底負電荷銀納米粒子。 Chen等[32]使用帶正電的銀納米粒子鑒定耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(圖5)。 為了進一步證明其在臨床樣本鑒定中的適用性， 檢測52株金黃色葡萄球菌和215株耐甲氧西林金黃色葡萄球菌， 該方法成功檢測出耐甲氧西林金黃色葡萄球菌。 Tadesse[33]使用十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)合成了帶正電的金納米棒并表征了水中革蘭氏陰性大腸桿菌和粘質沙雷氏菌以及革蘭氏陽性金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的SERS特征。 金納米棒和細菌之間的等離子體和靜電相互作用使SERS均勻增強。 具有較高表面電荷密度的細菌表現(xiàn)出明顯較高的SERS信號。 Qiu等[34]制備的巰基-聚乙二醇-NH2功能化的Au@Ag納米棒柱狀陣列可以有效地捕獲帶負電的致病菌。 實現(xiàn)了三種代表性食源性革蘭氏陽性菌， 即木糖葡萄球菌、 單核細胞增生李斯特菌和屎腸球菌的高靈敏度檢測。

圖5 (a)金黃色葡萄球菌與AgNPs-(左)、 AgNPs+(右)混合的SEM圖像(b)AgNPs-或AgNPs+的金黃色葡萄球菌的SERS光譜[32]

3 數(shù)據(jù)分析方法

拉曼信號由細菌的多種成分產生， 且光譜維度高、 光譜復雜[35]； 不同種類細菌的基本成分非常相似， 導致相似的SERS信號。 因此， 需要高效的數(shù)據(jù)分析方法來處理致病菌的拉曼光譜。 經典的數(shù)據(jù)分析方法為多變量統(tǒng)計分析如： 主成分分析、 聚類分析、 判別分析等。 機器學習方法有支持向量機、 深度學習等等。 在這些方法中， 深度學習技術表現(xiàn)出了優(yōu)于傳統(tǒng)方法的光譜分類和識別能力。

3.1 多變量統(tǒng)計分析方法

多變量統(tǒng)計分析方法是一種傳統(tǒng)的分析高維數(shù)據(jù)的方法， 一般通過特定的算法提取原始數(shù)據(jù)中的有效信息降低數(shù)據(jù)維度， 從而有利于后續(xù)數(shù)據(jù)分析。 主成分分析(principal component analysis, PCA)是最常用的多變量分析方法。 主成分分析通過正交變換將原始變量轉換成一系列不相關的變量， 轉換后的一系列變量稱為主成分。 由于少量頭部主成分包含了絕大部分原始數(shù)據(jù)的有效信息， 一般在分析時只截取前幾個主成分， 從而降低數(shù)據(jù)維度。 Hadjigorgiou等[36]使用SERS對肺炎克雷伯氏菌、 變形桿菌和大腸桿菌進行AST， 使用PCA結合線性判別分析和留一交叉驗證區(qū)分耐藥菌、 中間菌和敏感菌， 分類正確率達94%。 Premasiri等[37]用SERS研究了兩株細菌， 通過偏最小二乘判別分析區(qū)分耐藥菌和敏感菌。 判別的敏感性>95%， 特異性>99%。 Ayala等[38]利用SERS結合PCA和判別分析用于區(qū)分不同的種類的致病菌。 Lin等[39]建立了一種基于SERS和層次聚類分析的大腸桿菌、 鮑曼不動桿菌和銅綠假單胞菌耐藥性快速檢測方法。 對123株臨床分離菌(42株大腸桿菌、 41株鮑曼不動桿菌和40株銅綠假單胞菌)進行了檢測。 與微量肉湯稀釋法相比， 檢測靈敏度和特異性分別為90.9%和91.1%。 篩查易于進行， 可在1.5 h內完成。

3.2 機器學習數(shù)據(jù)分析方法

機器學習通過大規(guī)模的學習訓練數(shù)據(jù)集， 從而提取數(shù)據(jù)的有效特征， 建立預測模型實現(xiàn)高靈敏度判別分析。 傳統(tǒng)的機器學習方法有支持向量機、 決策樹、 K近鄰分類算法等。 Cheong等[15]采用多元統(tǒng)計學方法PCA和支持向量機來快速鑒定喹諾酮類耐藥肺炎克雷伯菌(ATCC70063， ST11和ST15)。 該方法具有高重現(xiàn)性(相對標準偏差為7.4%)和靈敏的檢測限(100 pmol·L-1， R6G)， 相關系數(shù)為0.98。 Walter等[40]比較了支持向量機和線性判別分析區(qū)分兩種不同激發(fā)波長(532和244 nm)的致病菌SERS光譜的能力。 分別實現(xiàn)了大約92%和90%的識別率。 Ciloglu等[41]使用SERS結合機器學習技術快速鑒定耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和嗜肺軍團菌。 K近鄰分析方法在支持向量機、 決策樹和樸素貝葉斯等傳統(tǒng)分類器中具有97.8%的分類準確率。 SERS和機器學習為抗生素耐藥菌的鑒別提供了一個可靠的工具。

深度學習是最先進的機器學習算法， 它從大規(guī)模的原始數(shù)據(jù)集中學習特征并直接構建預測模型。 深度學習算法有很多， 包括卷積神經網(wǎng)絡， 完全連接的網(wǎng)絡， 殘差神經網(wǎng)絡等。 其在挖掘數(shù)據(jù)的局部特征和提取全局訓練特征方面具有良好的性能[42]， 數(shù)據(jù)分類識別的能力遠超傳統(tǒng)多變量統(tǒng)計分析算法[43]。 Ho等[44]通過訓練一個卷積神經網(wǎng)絡準確識別30種常見的細菌病原體, 即使在低信噪比譜上， 也能達到超過82%的準確率并且抗生素治療識別準確率高達97.0%±0.3%。 對50名患者的臨床分離株進行了驗證， 僅使用來自每個患者分離物的10個細菌譜， 實現(xiàn)了99.7%的抗生素治療識別準確率。 Thrift等[45]利用卷積神經網(wǎng)絡聯(lián)合SERS技術在抗生素暴露后10 min內將大腸桿菌和銅綠假單胞菌對抗生素的反應與未處理的細菌分離， 準確率大于99%。 這種無需對細菌進行培養(yǎng)的方法顯著提高了分類精度， 可在30 min內選擇有效的抗生素治療， 這極大地減少了用常規(guī)生長試驗驗證表型AST所需的時間。

4 總結和展望

表面增強拉曼光譜是一種分子檢測技術， 它能夠無損害、 快速、 高靈敏度地提供致病菌與藥物相互作用的信息[46]。 通過人們的不斷努力, 基于SERS的致病菌及其耐藥性檢測的準確性已大幅提高， 檢測時間也縮短為兩小時以內， 但是要實現(xiàn)該方法在臨床上的全面應用尚有許多工作需要完善。 首先, SERS基底的重復性有待提高。 其次， 需要探索操作簡單、 特異性高的致病菌捕獲方式。 希望未來的研究能提高SERS檢測致病菌的易用性， 縮短從樣本收集到檢出結果的周轉時間， 構建一個高靈敏低成本的測試平臺， 并建立和完善細菌的標準SERS圖譜數(shù)據(jù)庫。 使 SERS細菌鑒別技術走出實驗室， 有效應對并緩解臨床細菌耐藥。