Rhopaladins類(lèi)似物對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞增殖、凋亡的影響及其機(jī)制

王彥嬌，曾小華，柯麗娜，朱秀蓮，陳琴華，李斌

1 錦州醫(yī)科大學(xué)國(guó)藥東風(fēng)總醫(yī)院研究生培養(yǎng)基地，湖北十堰442008；2 湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬?lài)?guó)藥東風(fēng)總醫(yī)院婦產(chǎn)科；3 湖北醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)院武當(dāng)特色中藥研究湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，好發(fā)于子宮頸外口柱狀上皮與鱗狀上皮交接處，全球每年宮頸癌新發(fā)病例接近53萬(wàn)例，每年宮頸癌的死亡人數(shù)超過(guò)25 萬(wàn)，而且年輕女性患者所占比例越來(lái)越多，嚴(yán)重影響女性的心理健康和生活狀況［1］。宮頸癌常用的治療方法包括手術(shù)、放療和化療等，雖取得一定的治療效果，但對(duì)于晚期或復(fù)發(fā)宮頸癌治療效果欠佳，研發(fā)新的宮頸癌藥物是目前急需解決的問(wèn)題。近年來(lái)，臨床醫(yī)師常采用海洋藥物來(lái)控制宮頸癌，是研究和治療此病的新思路［2］。Rhopaladins A～D 是從沖繩海洋被膜植物Rhopalaea sp 中分離出的新的雙吲哚生物堿，對(duì)與宮頸癌預(yù)后相關(guān)的癌基因CerbB-2有顯著的抑制作用［3-6］。本課題組前期化學(xué)合成的Rhopaladins 類(lèi)似物（簡(jiǎn)稱(chēng)RPDPB），分子結(jié)構(gòu)與Rhopaladins 類(lèi)似，體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)RPDPB 具有抑制宮頸癌Caski 細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡的作用［7-8］。但前期實(shí)驗(yàn)關(guān)于RPDPB 對(duì)宮頸癌Hela 細(xì)胞的作用及可能的作用機(jī)制少有探討。2020 年8 月—2021 年4 月，我們觀察了RPDPB對(duì)宮頸Hela細(xì)胞增殖、凋亡的影響，并探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株、RPDPB 及主要試劑 Hela 細(xì)胞（宮頸癌細(xì)胞，貨號(hào)CL-0101），購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。RPDPB 由武當(dāng)特色中藥研究湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。MEM 培養(yǎng)基（Procell），F(xiàn)BS（CellMax 賽澳美），二甲基亞砜（Mpbio 公司），0.1%胰酶（Sigma公司），細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8（CCK-8），細(xì)胞凋亡試劑盒（rh Annexin V/FITC Kit，MultiSciences 公司），TRIzol試劑（Invitrogen 公司），PCR 引物（上海生工生物有限公司合成），mRNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Fermentas公司），SYBR Green Realtime PCR Master Mix（Toyobo公司），miScript SYBR Green PCR Kit、miScript ⅡRT Kit（Qiagen 公 司），Wnt1、Wnt2b、beta Catenin 抗 體（Abcam公司），GAPDH抗體和HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗（Antgene公司）。

1.2 Hela 細(xì)胞培養(yǎng) Hela 細(xì)胞培養(yǎng)于10%FBS 和1%青霉素—鏈霉素的MEM 培養(yǎng)基中，置于37 ℃、含5%CO2及飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱中，每周換液2～3次。

1.3 Hela 細(xì)胞分組、RPDPB 的給予方法及細(xì)胞增殖抑制率測(cè)算 采用CCK-8 法。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HeLa 細(xì)胞，按1.5×104個(gè)細(xì)胞/孔，接種于96 孔板，置于37 ℃、含5%CO2培養(yǎng)箱中過(guò)夜。將細(xì)胞分為實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組、空白組，實(shí)驗(yàn)組又分為不同劑量組，不同 劑 量 組 分 別 以3.125、6.25、12.5、25、50、100 μmol/L RPDPB 干預(yù)，對(duì)照組只加DMSO 培養(yǎng)液，空白組加入不含細(xì)胞的MEM 培養(yǎng)液，每組均設(shè)6 個(gè)復(fù)孔。分別于24、48、72 h 后終止培養(yǎng)，各孔均加入110 μL 的CCK-8 試劑混合液，混勻，繼續(xù)培養(yǎng)1 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm 處的吸光度（OD）值。計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，細(xì)胞活力（%）=（實(shí)驗(yàn)組OD值－空白組OD 值）/（對(duì)照組OD 值－空白組OD 值）×100%，細(xì)胞增殖抑制率（%）=1－細(xì)胞活力（%）。48 h IC50值為17.63 μmol/L，相同方法檢測(cè)RPDPB對(duì)肝細(xì)胞（LO2）的毒性，48 hIC50為95.20 μmol/L，故選取后續(xù)實(shí)驗(yàn)藥物濃度為12.5、50、100 μmol/L，藥物作用時(shí)間為48 h。

1.4 Hela 細(xì)胞分組、RPDPB 的給予方法及細(xì)胞凋亡率測(cè)算 采用AnnexinV-FITC/PI 雙染法。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，按1.0×106個(gè)細(xì)胞/mL，接種于6 孔板，置于培養(yǎng)箱中過(guò)夜，待細(xì)胞貼壁后，將細(xì)胞分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組又分為不同劑量組，不同劑量組分別以12.5、25、50 μmol/L RPDPB 混合液刺激，對(duì)照組不予處理，均設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)48 h 后，收集上清和細(xì)胞，PBS洗2次，棄上清，Binding Buffer液重懸細(xì)胞，Annexin V-FITC和PI液染色，室溫避光反應(yīng)5 min，1 h 內(nèi)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)早期凋亡細(xì)胞群：Annexin-V（+），PI（-）；晚期凋亡細(xì)胞群或壞死細(xì)胞群：Annexin-V（+），PI（+）；機(jī)械損傷細(xì)胞群：Annexin-V（-），PI（+）；正常細(xì)胞群：Annexin-V（-），PI（-）。計(jì)算細(xì)胞凋亡率，早期凋亡率（%）=早期凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%，晚期細(xì)胞凋亡率（%）=晚期凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.5 Hela 細(xì)胞分組、RPDPB 的給予方法及人乳頭瘤病毒18 E6（HPV18 E6）、人乳頭瘤病毒18 E7（HPV18 E）7、WNT2B、β-catenin mRNA 和miR-145 RNA 檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)定量PCR 法。實(shí)驗(yàn)分組及各組干預(yù)方法與“1.4”相同。TRIzol法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后再PCR 擴(kuò)增。依據(jù)說(shuō)明書(shū)操作，GAPDH mRNA、WNT2B mRNA、β-catenin mRNA 反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性60 s，95 ℃變性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸45 s，40 個(gè)循環(huán)。 E6、E7 mRNA 反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，55 ℃退火10 s，72 ℃延伸15 s，40 個(gè)循環(huán)。U6 和miR-145 RNA 反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性15 m，94 ℃變性15 s，55 ℃退火30 s，70 ℃延伸30 s，40 個(gè)循環(huán)。數(shù)據(jù)分析采用2-ΔΔCt法，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。GAPDH 引物序 列：F-AATGGGCAGCCGTTAGGAAA，R-GCGCCCAATACGACCAAATC；HPV18 E6 引物序列：FCTGCAATGTTTCAGGACCCA，R-TCATGTATAGTTGTTTGCAGCTCTGT；HPV 18 E7 引物序列：F-GAGGAGGAGGATGAAATAGATGGT，R-CACTTGCAACAAAACGTTACAATATTG；wnt2b 引 物 序 列：FAAACCCTGAAGAGCCCAAGCAATG，R-AGAAAGAGTGAAAGGAGACAGCAGTG；β-catenin引物序列：F-TCTGAGGACAAGCCACAAGATTACAAG，R-TCAGCAGTCTCATTCCAAGCCATTG；U6 引物序列：FGTGCTCGCTTCGGCAGCACATAT；miR-145-5p 引物序列：F-GTCCAGTTTTCCCAGGAATCCCT。

1.6 Hela 細(xì)胞分組、RPDPB 的給予方法及WNT2B、β-catenin 蛋白檢測(cè) 采用Western blot 法。實(shí)驗(yàn)分組及各組干預(yù)方法與“1.4”相同。加入裂解液、蛋白酶抑制劑及磷酸酶抑制劑裂解細(xì)胞，抽提蛋白，BCA 法定量，上樣，SDS-PAGE 凝膠電泳，電泳結(jié)束將蛋白濕轉(zhuǎn)至0.45 μm 的PVDF 膜上，結(jié)束后用5%的脫脂牛奶封閉1 h，一抗4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜3 次，加入二抗室孵育2 h，TBST 洗膜3 次，每次10 min，ECL 法曝光顯色。用Image Pro Plus6.0軟件進(jìn)行灰度值分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS23.0 統(tǒng)計(jì)軟件。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以-x±s表示，比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組不同時(shí)點(diǎn)細(xì)胞增殖抑制率 細(xì)胞增殖抑制率見(jiàn)表1。由表1可知，與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組增殖抑制率增加，且呈時(shí)間和劑量依賴(lài)性（P均＜0.05）。

表1 兩組不同時(shí)點(diǎn)OD值和細(xì)胞增殖抑制率（%）

2.2 各組早期細(xì)胞凋亡率、晚期細(xì)胞凋亡率 早期細(xì)胞凋亡率、晚期細(xì)胞凋亡率見(jiàn)表2。由表2 可知，與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組早期細(xì)胞凋亡率和晚期細(xì)胞凋亡率增加，且呈劑量依賴(lài)性（P均＜0.05）。

表2 兩組早期細(xì)胞凋亡率、晚期細(xì)胞凋亡率（%，±s）

表2 兩組早期細(xì)胞凋亡率、晚期細(xì)胞凋亡率（%，±s）

組別實(shí)驗(yàn)組12.5 μmol/L 25 μmol/L 50 μmol/L對(duì)照組早期細(xì)胞凋亡率9.05±0.24 18.7±0.46 24.2±0.40 4.90±0.18晚期細(xì)胞凋亡率10.90±0.35 20.73±0.31 30.2±0.61 6.76±0.17

2.3 兩 組 細(xì) 胞HPV18 E6 mRNA 、HPV18 E7 mRNA、miR-145 RNA、WNT2B mRNA、β-catenin mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較 細(xì)胞HPV18 E6 mRNA、HPV18 E7 mRNA、miR-145 RNA、WNT2B mRNA、β-catenin mRNA 相對(duì)表達(dá)量見(jiàn)表3。由表3 可知，與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組HPV18 E6 mRNA、HPV18 E7 mRNA 、WNT2B mRNA 、β -catenin mRNA 相對(duì)表達(dá)量降低，miR-145 RNA 相對(duì)表達(dá)量升高，且呈劑量依賴(lài)性（P均＜0.05）。

表3 兩組細(xì)胞HPV18 E6 mRNA、HPV18 E7 mRNA、miR-145 RNA、WNT2B mRNA、β-catenin mRNA相對(duì)表達(dá)量（±s）

表3 兩組細(xì)胞HPV18 E6 mRNA、HPV18 E7 mRNA、miR-145 RNA、WNT2B mRNA、β-catenin mRNA相對(duì)表達(dá)量（±s）

組別實(shí)驗(yàn)組12.5 μmol/L 25 μmol/L 50 μmol/L對(duì)照組HPV18 E6 mRNA 0.79±0.10 0.52±0.04 0.26±0.15 1.04±0.03 HPV18 E7 mRNA 0.78±0.04 0.54±0.10 0.30±0.06 1.23±0.22 miR-145 RNA 1.37±0.08 1.99±0.17 2.73±0.33 1.00±0.09 WNT2B mRNA 0.72±0.08 0.45±0.10 0.24±0.05 1.01±0.16 β-catenin mRNA 0.86±0.05 0.52±0.10 0.31±0.02 1.00±0.01

2.4 兩組細(xì)胞WNT2B、β-catenin 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 細(xì)胞WNT2B、β-catenin 蛋白相對(duì)表達(dá)量見(jiàn)表4。由表4 可知，與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組WNT2B、β-catenin 蛋白相對(duì)表達(dá)量降低，且呈劑量依賴(lài)性（P均＜0.05）。

表4 兩組細(xì)胞WNT2B、β-catenin蛋白相對(duì)表達(dá)量（±s）

表4 兩組細(xì)胞WNT2B、β-catenin蛋白相對(duì)表達(dá)量（±s）

組別實(shí)驗(yàn)組12.5 μmol/L 25 μmol/L 50 μmol/L對(duì)照組WNT2B蛋白0.42±0.01 0.38±0.01 0.29±0.01 0.53±0.02 β-catenin蛋白0.33±0.03 0.20±0.03 0.03±0.01 0.72±0.03

3 討論

宮頸癌是好發(fā)于子宮頸外口柱狀上皮與鱗狀上皮交接處的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，主要以宮頸接觸性出血陽(yáng)性或不規(guī)則陰道流血陽(yáng)性、陰道排液為主，不同年齡段患者陰道流血表現(xiàn)略有差異，早期患者往往無(wú)自覺(jué)癥狀，多在體檢時(shí)發(fā)現(xiàn)。宮頸癌是全世界威脅女性健康最常見(jiàn)的惡性腫瘤，疾病進(jìn)展是制約其療效、影響預(yù)后的重要因素之一。宮頸癌臨床上主要以手術(shù)治療和放療為主，化療為輔。對(duì)于晚期患者和復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的患者來(lái)說(shuō)，主要以全身化療為主，但因?yàn)槎喾N因素影響，目前臨床上患者的化療不太理想。

近年來(lái)，海洋生物堿治療宮頸癌的研究逐漸成為熱點(diǎn)，海洋生物堿具有抗病毒、抗炎及抗腫瘤等作用［9］，其中RPDPB 是通過(guò)化學(xué)合成的海洋生物堿吡咯烷酮類(lèi)衍生物，同樣具有抗腫瘤作用。前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，RPDPB 中部分化合物顯著抑制宮頸癌和肝癌細(xì)胞增殖［10］。體外研究證實(shí)，RPDPB 具有抑制宮頸癌Caski 細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組宮頸癌Hela 細(xì)胞增殖率增加，呈時(shí)間及劑量依懶性，細(xì)胞凋亡率上升，呈劑量依懶性，提示RPDPB可以抑制宮頸癌Hela細(xì)胞增殖，并促進(jìn)其凋亡的作用。

持續(xù)性高危型HPV 感染是導(dǎo)致宮頸癌的必然原因，其中HPV16、18 導(dǎo)致了超過(guò)75%的子宮頸癌病例［11］。MALLA 等［12］和PAL 等［13］發(fā)現(xiàn)，E6 和E7 癌蛋白是驅(qū)動(dòng)宮頸癌進(jìn)展的生物標(biāo)志物，其分別通過(guò)干擾p53 和pRb 來(lái)影響致病進(jìn)程（癌細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、轉(zhuǎn)移和耐藥性，早期癌基因介導(dǎo)的信號(hào)通路）。最新研究［12］發(fā)現(xiàn)，針對(duì)E6 和E7 的靶向治療已被證明在集中去除異常繁殖的惡性細(xì)胞方面非常有效。宮頸癌的靶向治療藥物的研究成為治療宮頸癌的重點(diǎn)。前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，RPDPB 可抑制宮頸癌Caski 細(xì)胞增殖，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，機(jī)制可能與E6/E7 的表達(dá)下降有關(guān)［8-9］。本研究顯示，與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組E6/E7 mRNA相對(duì)表達(dá)量下降，且呈劑量依賴(lài)性，這提示RPDPB 可能通過(guò)抑制E6/E7 表達(dá)，進(jìn)而抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。MICHAEL 等［14］首次發(fā)現(xiàn)，miR-145 在結(jié)直腸腫瘤中表達(dá)上調(diào)。miR-145 是一種腫瘤抑制因子，可以抑制各種癌癥，如前列腺癌、胃癌、子宮內(nèi)膜癌和膀胱癌［15-18］。研究［19］表明，宮頸癌細(xì)胞中miR-145 與E6/E7 表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，HPV E6/E7 低表達(dá)時(shí)miR-145 高表達(dá)，宮頸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)與進(jìn)展明顯受抑［20］。過(guò)表達(dá)的miR-145 可抑制宮頸癌細(xì)胞的活力、遷移和侵襲［21］。而且miR-145 高表達(dá)時(shí)，宮頸癌患者的生存時(shí)間越長(zhǎng)和預(yù)后情況越好［22］。本研究發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組miR-145 RNA 相對(duì)表達(dá)量升高，且呈劑量依賴(lài)性。此與LU 等［19］和SHI 等［20］研究結(jié)果一致，提示RPDPB 可能通過(guò)抑制E6、E7 mRNA 表達(dá)，進(jìn)而上調(diào)miR-145 RNA 表達(dá)，達(dá)到調(diào)控Hela 細(xì)胞生長(zhǎng)的目的。另有研究［18，23-24］發(fā)現(xiàn)，miR-145-Wnt/β-catenin 信號(hào)通路在膀胱癌、大腸癌及乳腺癌的進(jìn)展中均發(fā)揮了重要作用。研究證實(shí)，Wnt2b 是miR-145 的靶基因。在宮頸癌中，當(dāng)miR-145 相對(duì)高表達(dá)時(shí)，導(dǎo)致其下游靶向基因Wnt2b 表達(dá)下降，同時(shí)遏制β-catenin表達(dá)，最終使Wnt/β-catenin 通路失活，抑制宮頸癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡、抑制遷移和侵襲［25］。WANG等［26］發(fā)現(xiàn)，E6/E7 癌蛋白直接或間接與β-catenin 相互作用，激活Wnt/β-catenin 信號(hào)通路，最終促進(jìn)宮頸癌發(fā)生。而且β-catenin 表達(dá)量越高，腫瘤的惡性程度越高，遷移和侵襲能力越強(qiáng)，患者預(yù)后越差［27］。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組WNT2B、β-catenin 蛋白相對(duì)表達(dá)量降低，且呈劑量依賴(lài)性。此結(jié)果與Li等［25］研究結(jié)果相同。

總之，RPDPB可抑制宮頸癌Hela細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，呈時(shí)間和劑量依懶性，最佳抑制時(shí)間為48 h，最佳抑制濃度為17.63 μmol/L，作用機(jī)制可能是其通過(guò)下調(diào)HPVE6/E7 mRNA表達(dá)，導(dǎo)致miR-145 RNA 表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而抑制下游WNT2B/β-catenin 通路中WNT2B、β-catenin mRNA和蛋白表達(dá)。