吲哚菁綠造影在穿支皮瓣術(shù)后血管危象監(jiān)測中的實(shí)驗(yàn)研究

完顏超杰 吳中明 張峰瑞 李歡 楊子檜 王珺 韓雪嬌 楊向明 雷德林 楊新杰 魏建華

游離皮瓣移植是創(chuàng)面缺損修復(fù)的重要手段，在口腔頜面外科應(yīng)用日益廣泛。近年來，穿支皮瓣因其設(shè)計(jì)靈活，微創(chuàng)美觀，最大程度恢復(fù)功能等優(yōu)點(diǎn)，顯著提高了缺損修復(fù)的治療效果［1］。隨著顯微外科發(fā)展，皮瓣移植成功率已高達(dá)95%，但血管危象發(fā)生率仍接近10%～30%［2］。血管危象是游離皮瓣失敗的主要原因，如在8～12 h內(nèi)不能及時發(fā)現(xiàn)和搶救，皮瓣將出現(xiàn)不可逆壞死［3］。穿支皮瓣血管比常規(guī)主力皮瓣血管口徑更為細(xì)小，術(shù)后更易發(fā)生動靜脈危象［4］。早期皮瓣危象的搶救成功率很高，因此有效監(jiān)測及早發(fā)現(xiàn)和診斷血管危象尤為重要［4］。目前臨床上主要通過觀察皮瓣顏色、溫度、毛細(xì)血管充盈試驗(yàn)、針刺試驗(yàn)等方法診斷血管危象，但缺乏客觀統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，對觀察者有較高要求［5］。因此亟需一種客觀、即時、無創(chuàng)而簡便實(shí)用的方法進(jìn)行術(shù)后監(jiān)測［6］。吲哚菁綠造影（indocyanine green angiography，ICGA）不僅能在術(shù)中評估皮瓣血流灌注情況，而且術(shù)后有助于發(fā)現(xiàn)動靜脈危象［7］。本研究擬構(gòu)建大鼠髂腰穿支皮瓣危象模型，探討ICGA識別皮瓣術(shù)后血管危象的規(guī)律，為臨床皮瓣監(jiān)測提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

成年健康雄性SD大鼠（第四軍醫(yī)大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心）42只，體重（300±10）g。實(shí)驗(yàn)操作符合第四軍醫(yī)大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)倫理要求。

1.2 主要試劑與設(shè)備

注射用吲哚菁綠（indocyanine green，ICG）（25 mg／支，丹東醫(yī)創(chuàng)藥業(yè)有限責(zé)任公司）；手術(shù)熒光影像系統(tǒng)Real-IGSFLI-10B系列（南京諾源醫(yī)療器械有限公司）；SXF-IC手術(shù)顯微鏡（上海醫(yī)光儀器有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 髂腰穿支皮瓣制備 SD大鼠由1%戊巴比妥鈉（0.4 mL／100 g）經(jīng)腹腔注射麻醉，右側(cè)背部脫毛，俯臥位，固定于手術(shù)臺。將FLI-10B的探頭移動對焦至髂腰穿支區(qū)，股靜脈給予0.05 mL濃度為2.5mg／mL ICG溶液，注射的同時開始FLI-10B探測并錄像。顯影過程中，將顯影最早、最亮、搏動最強(qiáng)的點(diǎn)定義為動脈穿支血管所在的位置。標(biāo)記出髂腰穿支點(diǎn)，設(shè)計(jì)大小為5 cm×4 cm的髂腰穿支皮瓣。待ICG代謝消失熒光強(qiáng)度恢復(fù)基線水平后，自皮瓣遠(yuǎn)端全層切開至淺筋膜，自淺筋膜深面向皮瓣近端剝離，顯露并剝離髂腰血管。離斷周圍所有組織，僅保留髂腰穿支血管（圖1）。

圖1 髂腰穿支皮瓣的制備Fig 1 Preparation of iliolumbar perforator flap

1.3.2 血管危象模型建立與分組 前期實(shí)驗(yàn)表明動脈危象時長不同，ICGA圖像表現(xiàn)一致；靜脈危象時長不同，ICGA圖像表現(xiàn)各不相同；靜脈危象超過4 h，皮瓣熒光顯像不再變化。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果將實(shí)驗(yàn)分為以下7組。對照組：保髂腰穿支血管，不作任何處理；動脈危象組（危象時長15 min）：8倍顯微鏡下分離髂腰動靜脈，結(jié)扎髂腰動脈，保留靜脈通暢；靜脈危象組：結(jié)扎髂腰靜脈，保留動脈通暢；根據(jù)危象時長分為5組，依次為15min，0.5、1、2、4 h（n＝6）。將皮瓣原位間斷縫合，動態(tài)觀測皮瓣變化。

1.3.3 皮瓣大體觀察和術(shù)后ICGA檢測 血管危象模型建立成功后，記錄各組皮瓣大體變化。再次行ICGA，注射后在第30、60、90、180、300 s抓拍圖像并定量分析熒光信號。以髂腰穿支點(diǎn)為中心選取1 cm×1 cm的感興趣區(qū)域（regions of interest，ROI），在周圍組織選取等大的ROI，Image J軟件計(jì)算出ROI的平均熒光強(qiáng)度值（mean fluorescence intensity，MFI），分別代表皮瓣和周圍組織的血流灌注量；線圖分析每組皮瓣和周圍組織MFI隨時間的動態(tài)變化；SPSS軟件計(jì)算注射后30 s皮瓣的相對灌注值（relative perfusion value，RPV），RPV＝MFI（皮瓣 ROI）／MFI（周圍組織 ROI）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 皮瓣大體觀察

對照組皮瓣顏色紅潤，組織彈性及張力適中，毛細(xì)血管充盈正常，和周圍組織一致；動脈危象組皮瓣蒼白灰暗，皮溫降低，皮瓣張力減低，毛細(xì)血管反應(yīng)稍遲鈍；靜脈危象組在0～1 h，皮瓣顏色逐漸加深，皮溫降低，皮瓣腫脹，毛細(xì)血管反應(yīng)稍加快；靜脈危象1～2 h，皮瓣表面逐漸出現(xiàn)散在的瘀點(diǎn)；靜脈危象4 h組斑點(diǎn)逐漸融合成片狀青紫瘀斑，直至皮瓣變黑壞死（圖2）。

圖2 皮瓣大體觀察Fig 2 Gross observation of the skin flaps

2.2 ICGA檢測結(jié)果

靜脈注射ICG后，在30 s時各組周圍組織MFI達(dá)到最大，為（193.4±17.8）AU，之后逐漸變小。在 30～300 s，熒光衰減較為迅速，300 s時 MFI為（62.9±11.0）AU；300 s后熒光衰減緩慢。約15 min時，ICG代謝消失，周圍組織MFI恢復(fù)至術(shù)前基線水平，為（36.1±6.2）AU。

對照組在注射后5～8 s后，皮瓣內(nèi)髂腰動脈開始顯影，可以清晰觀察到動脈期、毛細(xì)血管期、靜脈期。動脈期時間非常短暫，約2～3 s，血管纖細(xì)，呈 “樹枝狀”影，供應(yīng)皮瓣中央?yún)^(qū)域；之后迅速經(jīng)過毛細(xì)血管交換進(jìn)入靜脈期，靜脈期維持時間較長，靜脈血管稍粗大（圖3）。皮瓣和周圍組織MFI在30 s達(dá)到峰值后逐漸變小，并且在不同時間點(diǎn)基本保持同步變化（圖5）。

圖3 對照組血液灌注分期Fig 3 Blood perfusion staging of the control group

動脈危象組皮瓣無灌注分期，在觀察期各時間點(diǎn)均呈現(xiàn)“暗區(qū)”，MFI為（34.9±5.8）AU，與基線水平無明顯差異（P＞0.05）；在注射后 30 s時，RPV為（18.1%±1.2%），與靜脈危象 2、4 h組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）（圖 4～6）。

靜脈危象各組無灌注分期，皮瓣和周圍組織MFI變化不同步。靜脈危象15 min皮瓣MFI在30～300 s

始終大于周圍組織，而危象0.5、1、2 h組皮瓣MFI在觀察初期小于周圍組織，繼而大于周圍組織；靜脈危象2 h皮瓣內(nèi)熒光“混沌”，血管形態(tài)難以辨認(rèn)。靜脈危象4 h組皮瓣始終呈現(xiàn)“暗區(qū)”，MFI在各時間點(diǎn)始終處于基線水平。在注射后30 s時，靜脈危象15 min組皮瓣 RPV為（112.8%±3.8%），大于對照組RPV（95.9%±1.0%）；隨著靜脈危象程度加深，皮瓣RPV逐漸變小，均小于對照組（P＜0.05）（圖 4～6）。

圖4 各組皮瓣熒光動態(tài)變化Fig 4 Dynamic changes of fluorescence in the flaps of the groups

圖5 皮瓣和周圍組織平均熒光強(qiáng)度定量分析Fig 5 Quantitative analysis of MFI of the flaps and surrounding tissues

圖6 注射ICG 30 s時皮瓣相對灌注分析Fig 6 Relative perfusion analysis of flaps at 30 s after injection of ICG

3 討 論

游離皮瓣已成為口腔頜面部組織缺損修復(fù)重建的主要手段。雖然游離皮瓣移植成功率已達(dá)95%以上，但發(fā)生皮瓣壞死仍是災(zāi)難性事件［8］。血管危象作為皮瓣術(shù)后最常見的并發(fā)癥，其可能導(dǎo)致二次手術(shù)、皮瓣壞死等后果，不僅增加患者身心痛苦及延長住院時間，延誤后期放療，甚至危及生命［9］。皮瓣手術(shù)成功不僅取決于顯微外科吻合技術(shù)，還與術(shù)后監(jiān)測密切相關(guān)。早期發(fā)現(xiàn)皮瓣危象與皮瓣挽救成功率直接相關(guān)［10－11］。術(shù)后24～48 h內(nèi)是監(jiān)測關(guān)鍵時期，血管危象多發(fā)生于此期間，且此類患者的皮瓣挽救成功率高于危象48 h后的患者。有研究報道，出現(xiàn)血運(yùn)障礙后6 h內(nèi)，皮瓣挽救成功率較高；隨時間延長，血管內(nèi)膜受損，組織瓣微循環(huán)將發(fā)生不可逆改變，超過6 h血管危象挽救成功率低至14.3%。馬小睦等［12］回顧分析指出大部分血管危象可在發(fā)現(xiàn)后3 h內(nèi)經(jīng)手術(shù)探查解除。因此，早期識別并準(zhǔn)確處理血管危象，是進(jìn)一步提高游離皮瓣移植成功率的關(guān)鍵。目前皮瓣術(shù)后血運(yùn)監(jiān)測主要有臨床監(jiān)測法、激光多普勒血流儀、近紅外光譜儀、植入式多普勒超聲、組織氧分壓測定和微量滲析等方法［13］。臨床觀察法簡單易行，但有賴于醫(yī)師個人經(jīng)驗(yàn)。目前尚沒有一種方法能達(dá)到理想的評估標(biāo)準(zhǔn)：實(shí)時、準(zhǔn)確、無創(chuàng)、可定量、反應(yīng)快捷，簡單方便［2］。以ICG為示蹤劑的近紅外熒光成像系統(tǒng)接近滿足這些標(biāo)準(zhǔn)［14］。對于發(fā)生過皮瓣危象探查術(shù)后的皮瓣，尤其是靜脈危象探查術(shù)后的皮瓣，其因淤血原因往往顏色較深，臨床評估往往不可靠，而ICGA評估血運(yùn)不受組織形態(tài)色澤等因素干擾。ICG靜脈注射后，快速與血紅蛋白結(jié)合，被限制在血管內(nèi)而無法短時間滲入組織間隙，被激發(fā)后發(fā)出波長700～900 nm熒光，具有更好的組織穿透性，在可見光下比其他染料更清晰顯示血液循環(huán)情況，通過測定研究區(qū)域熒光強(qiáng)度客觀準(zhǔn)確反映組織灌注量。本文的實(shí)驗(yàn)方法也適用于手術(shù)探查后的皮瓣監(jiān)測。本實(shí)驗(yàn)首次將FLI-10B用于穿支皮瓣血管危象監(jiān)測的動物研究。以往研究多集中在ICGA結(jié)合動態(tài)指標(biāo)如動脈流入指數(shù)、靜脈回流指數(shù)、熒光達(dá)峰時間等參數(shù)監(jiān)測術(shù)后游離皮瓣［12］。Hitier等［13］研究發(fā)現(xiàn)，ICGA比臨床觀察法更早發(fā)現(xiàn)皮瓣術(shù)后微循環(huán)障礙（皮瓣危象患者熒光曲線斜率和振幅異常），證實(shí)其在預(yù)測血管危象的可行性和安全性。ICGA結(jié)合FLOW 800分析系統(tǒng)［14］、針刺實(shí)驗(yàn)［15］可提高其檢測血管病變的靈敏度和特異度，在預(yù)測皮瓣壞死有著潛在價值。但運(yùn)用動態(tài)指標(biāo)需多次注射，無法持續(xù)監(jiān)測血流灌注情況。并且不是所有堵塞類型都能被檢測出來［12］。Mucke等［16］研究發(fā)現(xiàn) ICGA僅可檢測到堵塞程度≥85%的靜脈回流不暢，≤75%時無顯著性差異?？傮w來說，動態(tài)指標(biāo)還不夠靈敏，并且在不同患者和不同皮瓣間無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。

本實(shí)驗(yàn)對測量指標(biāo)加以改進(jìn)，使用靜態(tài)指標(biāo)如平均熒光強(qiáng)度和相對灌注值在不同時間點(diǎn)比較皮瓣和周圍組織熒光強(qiáng)度隨時間的變化，更能體現(xiàn)自身對照原則。并且單次注射，避免多次注射殘留造影劑對實(shí)驗(yàn)造成影響。本研究結(jié)果表明，根據(jù)定性或定量指標(biāo)并結(jié)合其他監(jiān)測手段可推斷血管危象的類型和大致時間（圖7）。對照組皮瓣灌注有明顯灌注分期，并且皮瓣MFI變化與周圍組織保持同步變化，30 s時RPV接近100%，說明正常皮瓣血液灌注量和周圍組織相當(dāng)，皮瓣內(nèi)微循環(huán)正常。若皮瓣MFI在觀察期始終處于基線水平，并且30 s RPV較?。?0%左右）則是動脈發(fā)生堵塞或者是靜脈危象時間過長導(dǎo)致皮瓣不可逆改變，血供中斷致造影劑無法流經(jīng)皮瓣。動脈危象一般發(fā)生在術(shù)后24 h內(nèi)，比靜脈危象發(fā)生時間早，而動脈危象表現(xiàn)不典型多無顏色改變，行ICGA有助于及早檢出動脈危象。若圖像顯示皮瓣在觀察期有熒光亮區(qū)，且MFI不下降則提示靜脈危象，靜脈回流不暢所致；靜脈危象發(fā)生率遠(yuǎn)高于動脈危象，靜脈危象常常是術(shù)后皮瓣壞死的主要原因［17］。通過前期預(yù)實(shí)驗(yàn)，當(dāng)大鼠髂腰穿支靜脈阻斷4 h，所有皮瓣大體觀均已發(fā)黑壞死，當(dāng)阻塞解除后，血液無復(fù)流，皮瓣無好轉(zhuǎn)，已發(fā)生不可逆壞死。靜脈危象超過4 h，皮瓣已無搶救成功的可能性。并且臨床上大部分靜脈危象主要靜脈引流不暢逐漸形成，很少出現(xiàn)完全阻塞情況，可能造成此實(shí)驗(yàn)大鼠皮瓣靜脈危象搶救窗口期時間較短。所以認(rèn)為靜脈阻斷4 h是關(guān)鍵時間節(jié)點(diǎn)，對大鼠皮瓣影響較大，大部分皮瓣無法生存。在0～4 h內(nèi)，通過設(shè)置不同的阻斷時長，表示不同的靜脈危象程度。當(dāng)靜脈危象程度較淺（15min）時，動脈流入正常，30 s RPV高于100%，ICG流入該區(qū)域無法及時通過靜脈排空，皮瓣內(nèi)ICG代謝減緩，熒光強(qiáng)度高于周圍組織。隨著程度加深，皮瓣熒光峰值比周圍組織低并且峰值變鈍，30 s RPV逐漸減小，提示靜脈回流障礙使毛細(xì)血管床阻力增加，動脈壓增大，血液灌注減少所致，皮瓣內(nèi)熒光強(qiáng)度低于周圍組織。當(dāng)皮瓣靜脈危象至終末階段（2～4 h），靜脈危象時間過長導(dǎo)致皮瓣動脈不可逆損傷，皮瓣整體發(fā)生缺血，30 s RPV表現(xiàn)和動脈危象組一致，此時皮瓣熒光圖像“混沌”，無法顯示血管形態(tài)，血管通透性增大，ICG滲透到組織間隙混淆了血管亮度。

圖7 血管危象熒光顯像判定決策圖Fig 7 Suggested algorithm for decision making assisted by ICGA in regard to vascular crisis

本研究為動物實(shí)驗(yàn)，存在一定的局限性。此研究采用結(jié)扎血管的方式模擬血管危象，但臨床上栓塞多逐漸形成，很少出現(xiàn)短時間完全堵塞的情況，大多為吻合質(zhì)量不佳、組織或者積液壓迫、血管扭曲彎折等問題。如何更好的模擬臨床情況，還需要對模型進(jìn)一步改善。目前本實(shí)驗(yàn)是選取代表性時間點(diǎn)觀察，如何持續(xù)動態(tài)監(jiān)測，第一時間發(fā)現(xiàn)血管危象還需進(jìn)一步研究。大鼠與人的皮瓣生理不同，下一步本課題研究將在體借助Real-IGSFLI-10B研究ICGA在術(shù)后穿支皮瓣監(jiān)測中的可行性，在臨床上給予驗(yàn)證。

4 結(jié) 論

此實(shí)驗(yàn)可表明ICGA可用于穿支皮瓣術(shù)后血運(yùn)監(jiān)測，根據(jù)熒光顯像模式和動態(tài)定量分析可鑒別血管危象類型和判斷危象發(fā)生時間，從而及時采取挽救措施，提高皮瓣挽救成功率。