環(huán)境內(nèi)分泌干擾物對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥影響的生物信息學(xué)分析

李楠 陳蕾 張琨

環(huán)境內(nèi)分泌干擾物（environmental endocrine disrupting chemicals，EDCs）包括雙酚類(lèi)、鄰苯二甲酸酯類(lèi)、二惡英類(lèi)等，廣泛應(yīng)用于洗滌劑、增塑劑、阻燃劑等生產(chǎn)中。大部分EDCs具有半衰期長(zhǎng)和生物富集等特點(diǎn)，在體內(nèi)改變DNA甲基化水平，并長(zhǎng)期影響生殖和類(lèi)固醇激素相關(guān)基因的表達(dá)水平，進(jìn)而影響女性性腺發(fā)育的激素依賴(lài)途徑。而作為雌激素依賴(lài)性的子宮內(nèi)膜異位癥（endometriosis，EMS）發(fā)病率呈逐年增加趨勢(shì)，持久影響女性生育能力及生活質(zhì)量。已知EMS發(fā)病受遺傳、氧化應(yīng)激、免疫、環(huán)境等多種因素影響，且大量研究提示EDCs可能在病因?qū)W上參與EMS的發(fā)生。但EDCs種類(lèi)繁多，作用機(jī)制復(fù)雜，人類(lèi)EMS和EDCs暴露之間因果關(guān)系的直接研究證據(jù)很難獲得，導(dǎo)致EDCs對(duì)EMS發(fā)生的潛在機(jī)制仍無(wú)定論。隨著生物信息學(xué)的發(fā)展，遺傳多態(tài)性研究備受關(guān)注。筆者采用生物信息學(xué)分析挖掘EDCs暴露在EMS發(fā)生中的潛在作用靶點(diǎn)及相關(guān)通路，旨在尋找EDCs暴露對(duì)EMS的潛在影響，為繼續(xù)探究復(fù)雜環(huán)境中EMS的病因、致病機(jī)制乃至防治提供參考。

1 資料和方法

1.1 基因篩選 在毒物基因組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)（comparative toxicogenomics database，CTD）（http://ctdbase.org/）中檢索雙酚A（bisphenol A，BPA）、四氯二苯并對(duì)二惡英（tetrachlorodibenzo-p-dioxin，TCDD）、鄰苯二甲酸二酯[di-（2-ethylhcxyl）phthalate，DEHP]，在疾病欄找到Endometriosis，確定在EMS發(fā)生中與各EDCs暴露相關(guān)的基因。

1.2 確定共同作用基因 在Venn圖網(wǎng)絡(luò)工具（bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）中輸入CTD數(shù)據(jù)庫(kù)檢索到的上述3種EDCs在EMS中的調(diào)控基因，進(jìn)而確定3者調(diào)控的公共基因。

1.3 基因生物信息學(xué)分析 將上述共同作用基因輸入富集分析數(shù)據(jù)庫(kù)（the Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery，DAVID）（https://david.ncifcrf.gov/），對(duì)其進(jìn)行基因功能注釋?zhuān)╣ene onotology,GO）分析[錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）值＜0.01為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義]和京都基因與基因百科全書(shū)（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）分析（FDR 值＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義）。

1.4 基因蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（protein-protein interaction networks，PPI）構(gòu)建 將共同作用基因上傳到STRING數(shù)據(jù)庫(kù)（http://string-db.org/）進(jìn)行 PPI建設(shè)，并用 Cytoscape3.8.0 軟件（www.cytoscape.org/）將 PPI網(wǎng)絡(luò)可視化，并利用插件Analyze Network計(jì)算連接度最高的6個(gè)基因作為關(guān)鍵基因。

2 結(jié)果

2.1 確定共同作用基因 在CTD數(shù)據(jù)庫(kù)檢索到BPA與EMS相關(guān)的基因158個(gè)，TCDD與EMS相關(guān)的基因155個(gè)，DEPH與EMS相關(guān)的基因 25個(gè)，3者調(diào)控EMS的公共基因共25個(gè)，見(jiàn)圖1。

圖1 環(huán)境內(nèi)分泌干擾物作用的公共基因

2.2 EDCs公共作用基因的GO分析 上述25個(gè)基因中包含一個(gè)非人類(lèi)基因，對(duì)剩下24個(gè)基因進(jìn)行GO分析，這些公共作用基因主要富集于對(duì)遺傳信息的調(diào)控，以及受體和信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)等功能，見(jiàn)圖2。

圖2 環(huán)境內(nèi)分泌干擾物公共作用基因的功能注釋分析

2.3 EDCs公共作用基因的KEGG分析 對(duì)24個(gè)公共基因的作用途徑進(jìn)行KEGG分析，這些公共作用基因主要富集于甲狀腺激素信號(hào)通路、催乳素信號(hào)通路、卵巢類(lèi)固醇合成、MAPK信號(hào)通路和雌激素信號(hào)通路。結(jié)果提示，EDCs確實(shí)發(fā)揮了內(nèi)分泌干擾作用，干擾機(jī)體內(nèi)分泌相關(guān)信號(hào)通路，見(jiàn)圖3。

圖3 環(huán)境內(nèi)分泌干擾物公共作用基因的富集通路分析

2.4 EDCs公共作用基因的PPI分析 最后篩選出原癌基因（fos proto-oncogene,FOS）、糖皮質(zhì)激素受體（nuclear receptor subfamily 3 group C member 1，NR3C1）、表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）、雌激素受體 β（estrogen receptor beta，ESR2）、類(lèi)固醇受體共激活劑（nuclear receptor coactivator 1，NCOA1）、前列腺素內(nèi)過(guò)氧化物合酶2（prostaglandin endoperoxide synthase 2，PTGS2）6 種在該網(wǎng)絡(luò)中連接度最強(qiáng)的基因。

3 討論

EMS是女性月經(jīng)來(lái)潮后所發(fā)生的一種子宮內(nèi)膜異位到其他部位的疾病。有研究發(fā)現(xiàn)，一些成人疾病可能起源于胎兒，即母體壓力、污染物暴露等因素會(huì)影響胎兒基因編碼，導(dǎo)致胎兒器官結(jié)構(gòu)、新陳代謝和表觀遺傳等發(fā)生改變，增加患病風(fēng)險(xiǎn)[1]。EMS是一種雌激素依賴(lài)性疾病，雌激素對(duì)靶細(xì)胞的活性可能通過(guò)雌激素受體來(lái)實(shí)現(xiàn)。FOS被認(rèn)為是雌激素早期反應(yīng)的關(guān)鍵基因。一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OS基因在EMS中顯著差異表達(dá)[2]，其一方面可通過(guò)調(diào)控基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）表達(dá)參與17β-雌二醇促進(jìn)的人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞侵襲，另一方面也可能通過(guò)誘導(dǎo)雌激素發(fā)揮作用，參與EMS的發(fā)生、發(fā)展。通過(guò)對(duì)狒狒EMS模型疾病進(jìn)展中異位子宮內(nèi)膜的基因表達(dá)變化分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OS是在對(duì)照組和6～7個(gè)月疾病模型之間存在差異調(diào)節(jié)的單個(gè)基因，且其參與的EGF信號(hào)通路和ERK/MAPK信號(hào)通路被顯著調(diào)節(jié)[3]。NR3C1基因編碼糖皮質(zhì)激素受體，參與炎癥性疾病的病理生理學(xué)。已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn)EMS患者血清中皮質(zhì)醇水平降低，甚至?xí)绊慐MS患者受孕[4]。但其在EMS發(fā)展過(guò)程中的具體作用還不清楚。EGFR編碼表皮生長(zhǎng)因子受體，在EMS患者的異位病灶、血液、腹腔液中水平明顯增高，促進(jìn)EMS侵襲，轉(zhuǎn)移過(guò)程中的血管生成。未來(lái)靶向VEGF基因治療EMS將會(huì)是重要方向。ESR2基因編碼ERβ，ERβ是EMS癥患者的主要雌激素受體。多項(xiàng)研究均已證實(shí)ESR2基因多態(tài)性會(huì)增加患EMS的風(fēng)險(xiǎn)[5]，且異位子宮內(nèi)膜組織ESR2基因表達(dá)水平則明顯高于正常子宮內(nèi)膜，ESR2 mRNA水平表達(dá)與其甲基化程度相關(guān)[6-7]。NCOA1是一種類(lèi)固醇受體共激活劑，在人類(lèi)和小鼠異位內(nèi)膜病變中有選擇性地高水平表達(dá)，在子宮生物學(xué)和病理生物學(xué)中起著關(guān)鍵作用，沒(méi)有NCOA1小鼠子宮內(nèi)膜無(wú)法表現(xiàn)出完整的蛻膜反應(yīng)。有研究提示，TNF-α-MMP-9-NCOA1異構(gòu)體信號(hào)軸通過(guò)阻止TNF-α介導(dǎo)的人類(lèi)EMS細(xì)胞的凋亡來(lái)促進(jìn)EMS的發(fā)病進(jìn)展[8]。有研究提示NCOA1是雌激素的主要輔激活子后，調(diào)控異位內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1[9]。而基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1是內(nèi)皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和造血祖細(xì)胞的增殖和趨化因子，在組織修復(fù)、血管生成、侵襲和遷移中發(fā)揮重要作用。PTGS2編碼前列腺素內(nèi)過(guò)氧化物合酶2，又名環(huán)氧合酶2，在各種細(xì)胞中可以被炎癥因子，有絲分裂原及生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)，參與炎癥反應(yīng)，細(xì)胞增殖和凋亡。在EMS患者異位病灶和腹腔液中，PTGS2水平異常升高[10]，且PTGS2抑制劑可以促進(jìn)EMS子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡[11]，提示PTGS2將來(lái)有望成為EMS的治療靶點(diǎn)。

總之，上述分析可以預(yù)測(cè)EDCs在EMS中的作用機(jī)制與其內(nèi)分泌干擾性質(zhì)相關(guān)，能夠作用于一些基因干擾內(nèi)分泌信號(hào)通路，影響類(lèi)固醇激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，可能在EMS發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。EMS是女性生殖系統(tǒng)良性疾病，可能會(huì)惡變?yōu)槁殉餐该骷?xì)胞癌和子宮內(nèi)膜癌，如何早期診斷EMS并提前干預(yù)、改善預(yù)后仍然是臨床難題。近年針對(duì)基因水平改變的研究逐漸增多,在婦科腫瘤進(jìn)展中表觀遺傳學(xué)機(jī)制已成為一個(gè)重要影響因素。隨著檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)步，一些表觀遺傳現(xiàn)象如DNA甲基化、微小RNA的表達(dá)和基因沉默、染色質(zhì)重塑等改變?cè)贓MS中被鑒定出來(lái),有望成為EMS新的預(yù)測(cè)生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。而通過(guò)進(jìn)一步挖掘環(huán)境-基因作用對(duì)EMS發(fā)病的影響及未來(lái)對(duì)EMS表觀遺傳學(xué)研究的深入，可能會(huì)找到新的靶點(diǎn)并為EMS的預(yù)防及早期診斷和靶向治療提供新的思路。