葉酸受體α監(jiān)測循環(huán)腫瘤細(xì)胞診斷非小細(xì)胞肺癌的效能研究

劉天成 馬志紅 田萍 劉礦 劉紅松 臧金

肺癌是我國目前發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，其5年生存率不到15%[1]。有報(bào)道認(rèn)為，肺癌的早期診斷、及時(shí)治療可使患者5年生存率提高到85%[2]。因此，探尋新的肺癌早期診斷方法或標(biāo)志物對提高肺癌的治療效果及疾病轉(zhuǎn)歸具有重要的臨床意義。循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cells，CTCs）是存在于外周血中各類腫瘤細(xì)胞的統(tǒng)稱，系自發(fā)或診療操作從實(shí)體瘤病灶脫落，進(jìn)入外周血循環(huán)的腫瘤細(xì)胞或細(xì)胞簇。通過對CTCs的檢測可動(dòng)態(tài)監(jiān)測原發(fā)腫瘤灶癌細(xì)胞入血情況，能夠提高患者的早期診斷率，并對患者的治療效果及預(yù)后作出客觀評價(jià)。早期的研究表明，采用檢測上皮細(xì)胞黏附分子陽性CTCs（EpCAM+CTCs）的方法診斷非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC），晚期 NSCLC 患者的陽性率僅為 50%[3]，究其原因，CTCs在發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化時(shí)會(huì)發(fā)生上皮細(xì)胞表型丟失，從而造成EpCAM+CTCs的漏檢或假陰性。葉酸受體 α（folate receptor alpha，F(xiàn)Rα）是一種與葉酸結(jié)合的糖基化磷脂酰肌醇錨定糖蛋白，在多種腫瘤的細(xì)胞膜上過度表達(dá)，而在大多數(shù)正常組織中表達(dá)水平極低[4-7]。因此，本研究以FRα為靶點(diǎn)，檢測NSCLC患者外周血中葉酸受體α陽性循環(huán)腫瘤細(xì)胞（FRα+CTCs）水平，探討其診斷NSCLC的效能。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2016年1月至2020年12月湖州市中心醫(yī)院收治的149例 NSCLC患者，其中男83例，女 66 例，年齡 45～74（63.2±8.3）歲；鱗癌 63 例，腺癌86例；TNM分期Ⅰ～Ⅱ期56例，Ⅲ～Ⅳ期93例。所有患者均確診為原發(fā)NSCLC，無其他上皮性腫瘤或傳染病病史，臨床資料完整，均未接受放化療。選擇本院同期肺部良性疾病患者60例為良性對照組，男35例，女 25 例，年齡 46～80（62.8±9.3）歲；其中肺結(jié)核 8 例，肺部炎性假瘤12例，支氣管擴(kuò)張癥15例，慢性阻塞性肺疾病25例。選擇本院同期健康體檢者60名作為陰性對照組，男 37名，女 23名，年齡 40～71（60.8±9.6）歲。3組對象性別、年齡比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者簽署知情同意書。

1.2 方法 取3組對象清晨空腹靜脈血3 ml，使用乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝，30 min內(nèi)進(jìn)行檢測，采用配體靶向聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（ligand target PCR，LT-PCR）方法檢測FRα+CTCs水平。檢測步驟按照格諾思博生物科技有限公司提供的Cytolorare循環(huán)肺癌細(xì)胞試劑盒說明書操作，以FU/3 ml為FRα+CTCs單位。比較3組對象外周血中FRα+CTCs水平，分析NSCLC患者外周血中FRα+CTCs水平與性別、年齡、吸煙史（從不吸煙或平均吸煙少于1次/月定義為不吸煙）、腫瘤組織類型、分化程度、大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期等臨床特征的關(guān)系。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件。非正態(tài)分布的計(jì)量資料以M（P25，P75）表示，兩組間比較采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，多組間比較采用Kruskal-Wallis H秩和檢驗(yàn)。采用ROC曲線評估FRα+CTCs水平鑒別診斷NSCLC組和良性對照組、NSCLC組和陰性對照組的效能，并計(jì)算靈敏度、特異度。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組對象外周血中 FRα+CTCs水平的比較NSCLC組外周血中FRα+CTCs水平為12.31（9.48，16.52）FU/3 ml，良性對照組為 6.23（4.90，8.30）FU/3 ml，陰性對照組為 5.50（4.54，7.82）FU/3 ml，NSCLC 組外周血中FRα+CTCs水平較良性對照組和陰性對照組明顯升高（Z=-7.021、-7.262，均 P＜0.01），而后兩者間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-1.291，P＞0.05）。

2.2 NSCLC患者FRα+CTCs水平與臨床特征的關(guān)系FRα+CTCs水平與NSCLC患者臨床病理特征之間的關(guān)系見表1。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)Rα+CTCs水平僅與NSCLC患者腫瘤臨床分期有關(guān)（P＜0.05），與性別、年齡、吸煙史、腫瘤組織類型、分化程度、大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無關(guān)（均 P＞0.05）。

表1 NSCLC患者FRα+CTCs水平與臨床病理特征的關(guān)系（FU/3ml）

2.3 FRα+CTCs水平用于診斷NSCLC的效能 ROC曲線分析表明，F(xiàn)Rα+CTCs水平是NSCLC的潛在腫瘤標(biāo)志物。FRα+CTCs用于鑒別診斷NSCLC組和良性對照組、NSCLC組和陰性對照組的AUC值分別為0.811（95%CI：0.746～0.875）和 0.820（95%CI：0.758～0.885）。此外，取Youden指數(shù)最大值，最佳截?cái)嘀禐?.370FU/3 ml，F(xiàn)Rα+CTCs診斷NSCLC組和良性對照組的靈敏度為0.758，特異度為0.917；最佳截?cái)嘀禐?.495 FU/3 ml，F(xiàn)Rα+CTCs診斷NSCLC組和陰性對照組的靈敏度為0.752，特異度為0.917。見圖1。

圖1 FRα+CTCs用于診斷NSCLC效能的ROC曲線

3 討論

FRα是糖基化磷脂酰肌醇錨定糖蛋白，在多種癌癥中高表達(dá)，如頭、頸部腫瘤[4]，乳腺癌和卵巢癌[5]以及NSCLC[6]。有研究表明，72%～83%的肺腺癌患者在細(xì)胞膜上過度表達(dá)FRα，但在正常成人組織中表達(dá)有限[7]。因此，采用檢測外周血FRα+CTCs可有效避免EpCAMCTCs的丟失，提高診斷有效率。

本研究發(fā)現(xiàn)，NSCLC組外周血FRα+CTCs水平高于良性對照組和陰性對照組（均P＜0.01），而后兩者間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），這表明外周血FRα+CTCs水平可能是監(jiān)測肺部疾病惡化的潛在腫瘤標(biāo)志物。進(jìn)一步分析NSCLC患者FRα+CTCs水平與臨床病理特征之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)FRα+CTCs水平與NSCLC患者的性別、年齡、吸煙史、腫瘤組織類型、分化程度、大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無關(guān)（均P＞0.05），但與NSCLC的臨床分期有關(guān)（P＜0.05）。Ⅲ～Ⅳ期NSCLC患者FRα+CTCs水平顯著高于Ⅰ～Ⅱ期NSCLC患者，該結(jié)果提示，隨著NSCLC病程的進(jìn)展，外周血中更易檢測到FRα+CTCs，此結(jié)果與Chen等[8]報(bào)道類似。筆者認(rèn)為，這可能與腫瘤細(xì)胞的侵襲性有關(guān)，在腫瘤進(jìn)展的中晚期，有更多的侵襲性、轉(zhuǎn)移性強(qiáng)的CTCs播散到血液中，從而檢測水平更高。

由于缺乏特異性的CTCs檢測標(biāo)志物，目前常用檢測主要基于腫瘤細(xì)胞表面EpCAM的表達(dá)來分離CTCs，并對其進(jìn)行計(jì)數(shù)。然而這一方法可能明顯低估了CTCs的數(shù)量。尹寒露等[9]采用陰性-磁性法分離和富集CTCs，經(jīng)EpCAM免疫熒光染色后，流式細(xì)胞儀鑒定CTCs并計(jì)數(shù)，結(jié)果顯示47例患者的血液樣品中，EpCAM+CTCs的檢出率僅為48.9%[8]。本研究中，ROC曲線分析表明，F(xiàn)Rα+CTCs診斷NSCLC組和良性對照患者的最佳截?cái)嘀禐?.370 FU/3 ml，AUC值為0.811（95%CI：0.746～0.875），靈敏度為 0.758，特異度為0.917；FRα+CTCs鑒別診斷NSCLC組和陰性對照的最佳截?cái)嘀禐?9.495 FU/3 ml，AUC 值為 0.820（95%CI：0.758～0.885），靈敏度為 0.752，特異度為 0.917。該結(jié)果提示，采用檢測FRα+CTCs水平可有效提高NSCLC的診斷率，是其潛在有效的診斷標(biāo)志物。

綜上所述，檢測外周血FRα+CTCs水平是一種簡單、無創(chuàng)可用于NSCLC鑒別診斷的方法，但由于本研究的樣本量較小，應(yīng)進(jìn)一步招募更多的NSCLC患者樣本以證實(shí)本研究結(jié)果，如能采用聯(lián)合EpCAM+CTCs和FRα+CTCs水平檢測，將會(huì)為NSCLC非侵入性診斷提供更多重要的信息。