一株鵝源鴨疫里默氏桿菌的分離鑒定

李春來 王利麗 劉勃興 史秋梅

摘要 為對河北省張家口赤城縣某肉鵝養(yǎng)殖場的雛鵝死亡病原進(jìn)行檢測，剖檢雛鵝進(jìn)行初步診斷后采用常規(guī)方法分離細(xì)菌病原，并對分 離菌進(jìn)行鑒定試驗(yàn)以及藥物敏感性試驗(yàn)。結(jié)果表明，分離菌經(jīng)鑒定為鴨疫里默氏桿菌，對雛鵝具有較強(qiáng)致病性，分離菌對慶大霉素、卡那霉素和大觀霉素等 8 種抗生素表現(xiàn)耐藥，僅對阿莫西林表現(xiàn)敏感。

關(guān)鍵詞 鵝;鴨疫里默氏桿菌;分離鑒定

鴨疫里默氏桿菌病是由鴨疫里默氏桿菌 （riemerella anatipestifer，RA）引起的接觸性傳染病，是制約世界各國鴨、鵝、火 雞等家禽的健康養(yǎng)殖的重要疾病[1，2]。家禽感染鴨疫里默氏桿菌后，臨床表現(xiàn)為纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎等纖維素性炎癥。雛 鵝感染疫里默氏桿菌發(fā)病率極高，病死率在 10%～40%，最高可達(dá) 90%[3]。近年來，在我國有關(guān)鵝源鴨疫里默氏桿菌分離鑒定的報(bào)道 日益增多，并對我國鵝的健康養(yǎng)殖造成影響。

2019 年 6 月，河北省赤城縣某家鵝養(yǎng)殖場雛鵝大量死亡，1 周 內(nèi)發(fā)病率為 20%（1，000/5，000），病死率高達(dá) 90%（900/1，000），筆 者對該肉鵝養(yǎng)殖雛鵝死亡病因進(jìn)行檢測以及藥物敏感性試驗(yàn)，以 期為該地區(qū)鵝鴨疫里默氏桿菌病的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 病料來源

河北省赤城縣某鵝養(yǎng)殖場送檢發(fā)病雛鵝。

1.2 試驗(yàn)動物

15 日齡雛鵝，購自赤城縣某養(yǎng)鵝場，試驗(yàn)前試驗(yàn)室飼養(yǎng) 1 周。

1.3 方法

1）雛鵝發(fā)病及剖檢 詢問并記錄養(yǎng)殖戶雛鵝發(fā)病情況，剖檢送檢的病死雛鵝。

2）細(xì)菌的分離純化 無菌采集病死雛鵝肝臟，用高壓滅菌后的 棉拭子采集肝臟內(nèi)部細(xì)菌，涂布于鮮血瓊脂平板，參考文獻(xiàn)中的方法將平板放置于燭缸中進(jìn)行培養(yǎng)[4]。挑取優(yōu)勢菌株在小牛血清體積 分?jǐn)?shù)為 0.05 的 TSB 培養(yǎng)基進(jìn)行純化培養(yǎng)，并對分離菌進(jìn)行革蘭氏 染色，鏡檢。

3）分離菌的生化鑒定 參照生化反應(yīng)管說明書對分離菌進(jìn)行生化鑒定，并參照說明書統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果。

4）分離菌的 16S rDNA 序列分析 提取分離菌 DNA 作為模板， 16S rDNA 通 用 引 物 （序 列 為 16S-F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，16S-R：GGTTACCTTGTTACGACTT）進(jìn) 行 PCR，隨 后進(jìn)行產(chǎn)物測序，用 Lasergene 軟件上的 Megalign 功能建立進(jìn)化 樹和同源性分析。

5）分離菌的致病性試驗(yàn) 參考文獻(xiàn)中的方法制備菌液濃度為 1× 108cfu/mL 的分離菌菌液[5]。試驗(yàn)分為試驗(yàn)組和對照組，每組 5 只雛鵝。試驗(yàn)組雛鵝肌肉注射 0.5mL 調(diào)整濃度后的菌液。對照組每 只雛鵝注射 0.5mL 無菌的 PBS，觀察雛鵝狀態(tài)，并將病死雛鵝進(jìn)行 剖檢，分離病死雛鵝內(nèi)臟細(xì)菌并鑒定。

6）分離菌的藥物敏感性試驗(yàn) 按照美國臨床和試驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會 （CLSI）的 K-B 紙片擴(kuò)散法操作標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分離菌的藥物敏感性試驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 雛鵝臨床癥狀及病理變化

該養(yǎng)殖場共飼養(yǎng)雛鵝 5，000 只，發(fā)病雛鵝 1，000 只，發(fā)病率為 20%，病死率 90%。發(fā)病雛鵝精神倦怠，不食，排黃綠色稀糞，運(yùn)動 失調(diào)。對病死雛鵝進(jìn)行剖檢，發(fā)現(xiàn)其心包膜以及肝臟表面有明顯纖 維素性滲出物。

2.2 菌落與細(xì)菌形態(tài)

在鮮血瓊脂平板上，菌落呈露珠狀，表面光滑，濕潤。半透明， 直徑約為 1mm。分離菌為革蘭氏染色陰性小桿菌，大部分單個散落存在。

2.3 分離菌的生化鑒定

試驗(yàn)結(jié)果顯示，分離菌不發(fā)酵葡萄糖、果糖、蔗糖，VP 試驗(yàn)、硫化 氫產(chǎn)生、尿素分解、硝酸鹽還原、甲基紅試驗(yàn)、枸櫞酸鹽利用和靛基質(zhì)試驗(yàn)均為陰性。將試驗(yàn)結(jié)果與《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》（第八版）中鴨 疫里默氏桿菌的生化特性比較，符合鴨疫里默氏桿菌的生化特性。

2.4 分離菌 16S rDNA 序列分析

結(jié)果顯示，分離菌與 NCBI 中的鴨疫里默氏桿菌參考菌處于同 一分支，與大腸桿菌、沙門氏菌、銅綠假單胞菌與巴氏桿菌的不處 于同一分支。同源性分析結(jié)果顯示分離菌與 NCBI 中的鴨疫里默氏桿菌參考菌同源性在 99%以上。上述結(jié)果表明分離菌為鴨疫里默氏桿菌。

2.5 致病性試驗(yàn)

分離菌感染雛鵝后，雛鵝出現(xiàn)精神萎靡，站立障礙、不食、腹瀉等癥狀，96h 后全部死亡。觀察對照組雛鵝連續(xù) 2 周，未出現(xiàn)病征 以及死亡。剖檢病死雛鵝，其心包膜與肝臟表面有明顯纖維素性滲 出。從人工感染后病死雛鵝肝臟、心臟等臟器同樣分離出鴨疫里默氏桿菌，對照組未分離出該菌。表明分離到的鴨疫里默氏桿菌對雛 鵝具有一定的致病性。

2.6 藥物敏感性試驗(yàn)

試驗(yàn)結(jié)果顯示，分離菌僅對阿莫西林表現(xiàn)敏感，對青霉素、氨 芐西林和新霉素等 7 種抗生素表現(xiàn)中敏，對慶大霉素、卡那霉素和大觀霉素等 8 種抗生素表現(xiàn)耐藥。表明分離菌具有多重耐藥性。

3 討論

鴨疫里默氏桿菌病是在雛鵝養(yǎng)殖過程中的常見疾病之一，并 且在雛鵝養(yǎng)殖過程中有較高的發(fā)病率及死亡率[6]。近年來，從雛鵝 上分離到鴨疫里默氏桿菌的報(bào)道日益增多，江蘇、四川、山東、上海 等省市均有鵝感染鴨疫里默氏桿菌的報(bào)道[3，5，7-10]，并且分離菌株具 有較高的致病性。本次研究從河北省赤城縣的某肉鵝場病死鵝體 內(nèi)分離到 1 株鴨疫里默氏桿菌，并采用肌肉注射的方式感染雛鵝， 該方法是目前臨床研究中較常見的鴨疫里默氏桿菌的感染方式， 結(jié)果顯示分離菌株可致雛鵝死亡，表明分離菌株具有一定的致病性，因此，在鵝養(yǎng)殖過程中，鴨疫里默氏桿菌病的防治應(yīng)得到重視。目前細(xì)菌病主要通過抗生素類藥物進(jìn)行治療[11]。試驗(yàn)的 6 類 16 種 藥物中（其中諾氟沙星、氧氟沙星為農(nóng)業(yè)部公告的禁用獸藥，僅用 于研究），分離菌僅對阿莫西林表現(xiàn)敏感，對慶大霉素、卡那霉素等 8 種藥物表現(xiàn)為耐藥，具有多重耐藥性，并且對同一類的不同藥物 敏感性差異較大，這可能與該場在送檢前應(yīng)用抗生素類藥物治療有關(guān)。將藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果反饋該養(yǎng)殖場，該場應(yīng)用阿莫西林治療病鵝，2d 后，雛鵝發(fā)病情況得到控制。姜安安等[7]、楊永勝等[8]、趙 寶華等[10]的研究表明，從安徽、四川、揚(yáng)州分離 RA 菌株對 β - 內(nèi)酰 胺類藥物敏感性最高，而且本次研究與趙寶華等[10]的藥物敏感性 試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)阿莫西林的抑菌效果最佳，但該現(xiàn)象是否普遍存在需 進(jìn)一步研究。本次分離到的 RA 與其他報(bào)道菌株相比，耐藥性更強(qiáng)， 這可能與地方用藥以及治療情況不同有關(guān)。

本次研究從河北省赤城縣某發(fā)病鵝場的雛鵝分離到 1 株鴨疫里默氏桿菌，并對分離菌進(jìn)行致病性試驗(yàn)和藥物敏感性試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn) 分離菌對雛鵝具有一定的致病性和多重耐藥性。

參考文獻(xiàn)：

[1] Glunder G， Hinz K H. Isolation of Moraxella anatipestifer from embryonated goose eggs[J]. Avian Pathol. 1989， 18（2）：351-355.

[2] Rubbenstroth D， Ryll M， Behr K P， et al. Pat，hogenesis of Riemerella anatipestifer in turkeys after experimental mono-infection via respiratory routes or dual infection together with the avian metapneu movirus[J]. Avian Pathol， 2009， 38（6）：497-507.

[3] 王永坤，錢鐘，秦淑美，等.鵝漿膜炎的防治研究[J].中國禽業(yè)導(dǎo)刊，2005（4）：22-24.

[4] 云水麗，楊勇，王小波，等.11 型鴨疫里默氏桿菌分離鑒定及致病性研究[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2009，31（8）：605-609.

[5] 劉小龍，盧榮輝，程龍飛，等.鵝源血清 11 型鴨疫里默氏桿菌分離株生物學(xué)特性分析[J].中國家禽，2017，39（1）：47-49.

[6] P. SEGERS， W. MANNHEIM， M. VANCANNEYT， et al. Riemerella anatipestifer gen. nov.， comb. nov.， the causative agent of septicemia anserum exsudativa， and its phylogenetic affiliation within the flavobacterium-cytophaga rRNA homology group [J]. International Journal of Systematic Bacteriology， 1993， 43（4）：768-776.

[7] 姜安安，王小蘭，王少輝，等.血清 15 型鵝源鴨疫里默氏桿菌的分離鑒定及交叉免疫保護(hù)研究[J].中國動物傳染病學(xué)報(bào)，2015，23（3）：17-23.

[8] 楊永勝，陳研，薛亞飛，等.4 株鵝源鴨疫里默氏桿菌部分生物學(xué)特性分析[J].中國動物傳染病學(xué)報(bào)，2020，28（5）：62-66.

[9] 廖勤豐.鵝漿膜炎病原調(diào)查及其免疫、微量凝集試驗(yàn)方法的研究[D].西南大學(xué)，2007.

[10] 趙寶華，徐步，范建華.鵝源鴨疫里默氏桿菌的分離和鑒定[J].中國畜牧獸醫(yī)，2010，37（8）：189-192.

[11] Johnson J K， Perencevich E N， Lincalis D P， et al. Dog bite trans mission of antibiotic-resistant bacteria to a human [J]. Infect Control Hosp Epidemiol， 2006， 27（7）：762-763.