狂犬病的流行特點及其動物疫苗研究進展

李蕾 陳明望 陳飛 郭錦釗 鄭嘉瑩 李天宇

摘要 狂犬病又稱恐水癥，是由狂犬病病毒引起的一種烈性人畜共患病，該病感染范圍廣泛，人和各種溫血哺乳動物均易感染。如果臨床上出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，幾乎 100%死亡，而最為有效預防狂犬病方法首選接種狂犬病疫苗。為了有效控制狂犬病的發(fā)生和傳播，本文將對當前狂犬病 的流行特點及其動物狂犬病疫苗研究進展等方面做一綜述，為該病的有效防控提供參考。

關鍵詞 狂犬病;流行病學;動物疫苗

由狂犬病病毒（rabies virus，RABV）引起的一種急性傳染病稱 為狂犬病，以恐水、狂躁不安、怕風、神經(jīng)性抽搐為主要臨床特征。 據(jù)世衛(wèi)組織最新數(shù)據(jù)表明，全球每年約有 5.9 萬人死亡于狂犬病， 其中 95%的病例來自非洲、亞洲等發(fā)展中國家。我國也將該病列為 二類動物疫病[1]。研究表明中國狂犬病的傳染源有可能來自野生動 物，自上世紀 90 年代以來，我國已有 100 多人死于與野生動物相 關的狂犬病，該病毒已傳染給其他野生動物和家畜[2]，這給我國實現(xiàn)“2030 年全球消除犬傳染人狂犬病計劃”帶來具有的挑戰(zhàn)。因 此，人類狂犬病的消除主要取決于對動物狂犬病的控制。而了解動 物狂犬病的流行特點及其疫苗研究進展，對狂犬病的科學防控具有一定的參考意義。

1 病原學特點及理化性質(zhì)

RABV 屬于彈狀病毒科，狂犬病病毒屬，病毒粒子的外形呈彈 狀，直徑約 75nm，外層有囊膜包裹的 RNA 病毒[3]。RABV 主要由 5 種結構蛋白組成，包括鑲嵌在內(nèi)的基因組 RNA 核蛋白（N）、轉(zhuǎn)錄大 蛋白（L）、基質(zhì)蛋白（M）磷蛋白（P）以及糖蛋白（G）[4]。

RABV 對紫外線、光照、高溫、干燥較為敏感，RABV 在高溫中 加熱一段時間就會死亡。該病毒還對肥皂水、強酸或弱酸、強堿、甲 醛、去污劑、碘等試劑敏感[5-6]。在低溫環(huán)境下，5-6 周后，RABV 的毒 性喪失，但 RABV 感染組織后，將其 -20℃保存于含有 50%甘油 中，可存活數(shù)年且仍具有感染性。

2 狂犬病的流行特點

2.1 全球狂犬病分布和流行趨勢

亞洲和非洲是狂犬病的高發(fā)區(qū)域，其中由狂犬病導致死亡人 數(shù)最多國家是印度[7]，其傳染源主要是犬，印度的流浪犬數(shù)量較多， 管理難度大，每年大約有 2 萬人死于犬咬傷所致的狂犬病。非洲地 區(qū)，由于經(jīng)濟相對落后，醫(yī)療設備及藥品物資匱乏，并且當?shù)厝藗?只對瘧疾、艾滋病較為重視，而對狂犬病的關注較少，從而導致的狂犬病發(fā)病率不斷上升，病例數(shù)高達 1.5 萬例。在亞洲其他地區(qū)，野 生動物也可引起狂犬病的傳播，尤其是狐貍和狼。

美洲地區(qū)對狂犬病預防及其重視，雖然人感染狂犬病的病例 逐年下降，但動物間的狂犬病流行情況卻十分嚴峻，有研究表明， 近年來從蝙蝠中檢測到狂犬病病毒的載量不斷上升，情況不容樂 觀[8]。

近幾年，歐洲地區(qū)的狂犬病發(fā)病率則呈下降趨勢，其中，人感 染狂犬病的病例中大部分野生動物相關，研究發(fā)現(xiàn)患病動物中 60%以上是野生動物，其中紅狐的發(fā)病率較高[9，10]。

2.2 我國狂犬病流行趨勢和病例分布

我國是受狂犬病危害較為嚴重的國家之一，根據(jù)國家疾病預 防控制局數(shù)據(jù)統(tǒng)計，如圖 1 所示，我國狂犬病發(fā)病數(shù)和死亡人數(shù)呈 下降趨勢，其中我國狂犬病的病死人數(shù)由 2010 年的 2014 例下降 到 2020 年的 188 例，其主要原因是我國加強對暴露后預防 （post-exposure prophylaxis，PEP） 管理和公眾對 PEP 的認識[11]。 這十年間，人感染狂犬病的病例數(shù)雖然下降，而感染范圍卻在國內(nèi) 不斷擴大，在過去無狂犬病病例和低發(fā)病率的省份，如寧夏回族自治區(qū)、青海、甘肅、北京、吉林和西藏等地也相繼出現(xiàn)了新增病例[12]， 如圖 3 所示。

據(jù)不完全統(tǒng)計，我國大約有 8，000 萬只狗[13]，犬的疫苗接種從 農(nóng)村到城市各不相同，免疫覆蓋率也參差不齊[14]，有研究稱，我國 95%以上的狂犬病病例具有犬咬傷史[15]。自上世紀 90 年代以來，野生動物如雪貂、獾已在江西、浙江和安徽等省份造成至少 87 人死 亡，其原因是中國東南部的雪貂、獾攜帶來源于狗的 RABV，并在雪 貂、獾等群體中水平傳播[16，17] 。而我國黑龍江、新疆等北部地區(qū)的狂 犬病病例則是由狐貍和貉造成病毒傳播的。同時野生動物將狂犬病毒傳染給其他經(jīng)濟動物，造成巨大經(jīng)濟損失[18]，在受感染的經(jīng)濟 動物中，如牛和駱駝，有可能出現(xiàn)狂犬病癥狀，將會給獸醫(yī)和養(yǎng)殖戶帶來潛在的狂犬病風險[19]。此外，研究發(fā)現(xiàn)，我國從狐貍和貉中 分離的 RABV 與來自蒙古或其他鄰國的接觸的動物分離株的同源 性相似，表明 RABV 可能存在跨境傳播的風險[20]。因此，定期監(jiān)測 中國與周邊國家之間的狂犬病跨境傳播對野生動物感染狂犬病的控制具有重要意義。

3 病毒檢測方法

3.1 病毒分離和培養(yǎng)

采集患病動物死后的新鮮腦組織，將組織液注射到乳鼠體內(nèi) 或接種細胞組織中進行培養(yǎng)并擴增，利用免疫熒光技術對病毒顆 粒進行檢測。該方法適用于對疑似感染的病死動物進行確診[21]。

3.2 熒光抗體技術

熒光抗體技術（FAT）指腦組織切片用丙酮固定液將其固定后， 利用抗原抗體相結合特異性，經(jīng)熒光抗體染色后，通過熒光顯微鏡 觀察腦組織切片樣品是否含有病毒顆?；蛘卟《景w從而進行 判斷。該方法因操作步驟簡單、方便且成本低，被世界動物衛(wèi)生組 織（OIE）所推薦，也是實驗室中常用的檢測方法之一[22]。

3.3 直接熒光抗體技術

直接熒光抗體技術（DFA）是狂犬病實驗室診斷的“金標準”，該技術被世界動物衛(wèi)生組織（OIE）所認證[23]。該方法是將疑似患病動 物的腦組織切片進行固定后，與異硫氰酸熒光素（FITC）標記的RABV 單克隆抗體發(fā)生特異性結合，通過熒光顯微鏡可直接觀察病 毒顆粒進行判斷。該方法快速、特異性好且靈敏，是實驗室確診狂 犬病的首選方法。

3.4 快速免疫組化技術

快速免疫組化技術（dRIT）主要用于狂犬病的定性檢測。該方法主要采集疑似患病動物的腦組織樣品，與特異性 RABV 單克隆抗 體發(fā)生特異性的結合后，經(jīng)過染色后，可直接在光學顯微鏡下觀察 是否存在病毒顆粒，從而判斷是否感染狂犬病[24]。該方法的特異性 和靈敏性與 DFA 相當，并且所用的儀器沒有 DFA 所用的熒光顯微 鏡昂貴，被大多數(shù)國家推廣使用。

3.5 酶聯(lián)免疫吸附試驗

酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）利用抗原抗體特異性結合原理，將RABV 特異性單克隆抗體加入到平板上，加入待檢樣品與其發(fā)生特 異性結合后，再加入的辣根過氧化物酶（Horseradish Peroxidase，HRP）標記物與 RABV 單克隆抗體進行特異性結合產(chǎn)生顯色反應， 通過觀察顯色反應程度判斷病原陰陽性。該方法雖然操作簡單方 便、檢測速度快，但敏感性較差，有假陽性或假陰性的情況[25]。

3.6 核酸檢測技術

核酸檢測 RABV 通常采用 RT-PCR 技術，根據(jù) RABV 的保守序 列，利用軟件設計特異性的引物，以待檢樣品為模板，擴增出目的 基因片段，根據(jù)擴增結果進行判斷。快速靈敏的特點適用于大批量 樣品初篩，但結果時常會受非特異性序列變異、樣品采集時間、樣 品類型、實驗環(huán)境及實驗人員等因素影響，容易造成假陽性或假陰 性，因此 PCR 技術的操作需經(jīng)過嚴格培訓，保證操作的規(guī)范性，避 免污染造成結果誤差。

4 動物狂犬病疫苗的研究現(xiàn)狀

動物狂犬病疫苗經(jīng)過多年的研究，從神經(jīng)組織疫苗到現(xiàn)在的 基因重組疫苗發(fā)生了質(zhì)的飛躍，疫苗免疫原性增強的同時，免疫副 作用也不斷減少，目前成為產(chǎn)品的的狂犬病疫苗株通常有 CTN-1、aG、PM、SAD、ERA 和 Flury 等[26]。

4.1 神經(jīng)組織疫苗

神經(jīng)組織疫苗是利用石炭酸或石炭酸和乙醚的混合物將感染狂犬病毒的羊腦組織進行滅活后制成的，巴斯德在 1988 年，對 50多只犬進行免疫試驗，具有較好的保護率。但由于免疫后引起嚴重 的不良反應，目前該疫苗已經(jīng)停止生產(chǎn)。

4.2 雞胚疫苗

雞胚疫苗是利用雞胚接種 RABV 后，經(jīng)多次傳代，RABV 毒力削弱，使其失去致病性[27]。該方法常用的毒株有 Flury 和 Kelev。雖 然該疫苗毒力已經(jīng)減弱，但是仍然存在一定的感染風險，因此在臨 床上并不推廣使用。

4.3 細胞培養(yǎng)疫苗

細胞培養(yǎng)疫苗是指將狂犬病病毒接種到 BHK-21、MDCK 和 Vero 細胞中進行傳代培養(yǎng)[28]，將收集到的病毒液可制備成滅活疫 苗或弱毒疫苗。滅活疫苗通常用 β - 丙內(nèi)酯進行滅活，將狂犬病病毒的核酸破壞，不具有毒性，并且還保留了病毒的免疫原性，刺激 機體產(chǎn)生抗體。弱毒疫苗主要選用 Flury 株和 ERA 株，前者用于犬 類動物免疫;后者用于草食性動物免疫。

4.4 基因工程疫苗

基因工程苗是利用基因重組技術或反向遺傳技術，將含有 RABV 的抗原性基因插入到目標載體而制備的疫苗，包括滅活疫 苗、弱毒疫苗、核酸疫苗和亞單位疫苗等。研究人員將表達 RABV的抗原性蛋白 G 的重組 RABV 滅活疫苗對小鼠進行注射免疫，試驗結果顯示小鼠產(chǎn)生較高的抗體水平[29];此外，研究表明，還可通過 免疫激活因子提高疫苗免疫原性，研究人員將 B 細胞激活因子 （BAFF）插入到狂犬病病毒 （RABV） 顆粒的膜上后免疫小鼠，結果顯 示，小鼠體內(nèi)迅速產(chǎn)生較高的特異性抗體[30]。

4.5 口服疫苗

口服疫苗可分為弱毒口服疫苗和基因工程重組口服疫苗[31]。20 世紀 70 年代，美國開展對野生動物狐貍進行投喂狂犬病口服 弱毒疫苗的免疫效果監(jiān)測試驗，結果表明，ERA 株通過口服免疫， 能刺激機體產(chǎn)生較高的抗體[32]。重組基因工程口服疫苗是利用基 因重組技術，將 RABV 免疫原性基因插入到表達載體中進行表達， 將得到重組載體制成疫苗直接投放至野外環(huán)境中，以口服的方式 免疫野生動物，結果表明具備較好的免疫原性，其中常用的表達載 體包括痘病毒、腺病毒或植物病毒等[33]。此外，佐劑也有助于增強 病毒疫苗的免疫反應，相關研究表明，青蒿素衍生物青蒿琥酯能增強小鼠狂犬病毒滅活的免疫原性，青蒿琥酯將來可用作狂犬病疫 苗接種的新候選佐劑，增強狂犬病疫苗免疫原性[34]。

5 小結

至今為止，全球仍有大約 150 個國家和地區(qū)流行狂犬病。我國 由犬咬傷發(fā)生狂犬病的病例有所減少，但由于蝙蝠、狐貍等野生動 物體內(nèi)依然攜帶 RABV，野生動物咬傷引起的狂犬病例數(shù)正在增 加，這對我國實現(xiàn)“2030 年全面消除人間狂犬病”計劃帶來嚴峻挑 戰(zhàn)。因此，我們不僅僅要加強人們暴露后的疫苗接種，對于動物而 言，尤其是野生動物，應加強動物狂犬病疫苗的免疫，因野生動物 免疫難度大，開發(fā)新型廉價、安全和有效的口服疫苗迫在眉睫。因此，對狂犬病進行流行病學的調(diào)查、診斷及免疫接種是控制和預防狂犬病流行的有效綜合防控措施。

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