桑蓓斯鳳仙莖尖脫毒穩(wěn)定增殖與瓶外生根技術(shù)優(yōu)化

宋嘉瑋，劉 輝，張 黎

（寧夏大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川 750021）

桑蓓斯（Impatiens hybrids cv.sunpatience）鳳仙花科、鳳仙花屬草本花卉，是鳳仙雜交新品種，花大色艷，顏色多，株型緊湊，長(zhǎng)勢(shì)旺盛，可爆花成球。耐雨，耐35℃以上高溫，生命力強(qiáng)，花瓣厚[1-2]。桑蓓斯鳳仙以扦插繁殖為主，由于其生長(zhǎng)極易形成花芽，導(dǎo)致插穗采取困難。采用組培技術(shù)可以獲得高品質(zhì)的組培苗同時(shí)縮短繁殖周期[3]，建立成熟的組培繁育體系可獲得生長(zhǎng)健壯的組培壯苗。本試驗(yàn)建立了桑蓓斯鳳仙組培苗穩(wěn)定增殖體系，為桑蓓斯鳳仙工廠化育苗及其相關(guān)研究奠定一定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以銀川市花木公司種植的桑蓓斯鳳仙橘紅、粉紅2個(gè)品種為試驗(yàn)材料。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1外植體采集部位選擇 采取桑蓓斯鳳仙橘紅、粉紅2個(gè)品種頂芽與側(cè)芽（取≥1 cm、1～2 cm、2～3 cm、3～4 cm）各50個(gè)。在解剖鏡下剝離莖尖，比較不同品種、不同部位芽的葉芽率。

1.2.2莖尖剝離大小對(duì)成活率的影響 試驗(yàn)以橘紅、粉紅2個(gè)桑蓓斯鳳仙品種的莖尖為外植體，設(shè)莖尖剝離大小為0.1～0.2 mm、0.2～0.3 mm、0.3～0.4 mm、0.4～0.5 mm共4個(gè)處理，每個(gè)處理接種15瓶，每瓶接種1個(gè)外植體，重復(fù)3次。每15 d觀察成活率及生長(zhǎng)情況，比較莖尖剝離大小與成活率的相關(guān)性，確定適宜用微莖尖剝離的大小。

1.2.3桑蓓斯鳳仙莖尖脫毒滅菌時(shí)間篩選 試驗(yàn)以橘紅、粉紅2個(gè)桑蓓斯鳳仙品種的葉芽為材料，選取桑蓓斯鳳仙嫩芽2 cm左右，去掉外邊葉片后，在自來(lái)水下沖洗3～4次，無(wú)菌水沖洗1～2次。用濾紙吸干后，在超凈工作臺(tái)上用75%乙醇處理30 s，用無(wú)菌水沖洗2～3次后，用0.1%升汞溶液滅菌（8、9、10、11 min），無(wú)菌水沖洗5～6次，置于消毒燒杯中備用。無(wú)菌操作將莖尖接種于MS培養(yǎng)基上，每個(gè)處理接種15瓶，每瓶1個(gè)外植體，重復(fù)3次。15 d后記錄1次外植體的啟動(dòng)率、污染率與死亡率。

1.2.4桑蓓斯鳳仙微莖尖培養(yǎng) 試驗(yàn)以橘紅、粉紅2個(gè)桑蓓斯鳳仙品種剝離的莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)為材料，接種在MS+6-BA0.5 mg/L的培養(yǎng)基中，每15 d記錄1次生長(zhǎng)情況。

1.2.5桑蓓斯鳳仙繼代增殖及培養(yǎng)基篩選 試驗(yàn)以MS為基本培養(yǎng)基，以無(wú)菌苗為試驗(yàn)材料，剪取1 cm左右的帶芽莖段，接種于添加不同質(zhì)量濃度6-BA和NAA的培養(yǎng)基上（表1），共9個(gè)處理，培養(yǎng)30 d，統(tǒng)計(jì)不定芽增殖情況及生根情況，篩選出適宜的激素質(zhì)量濃度。

表1 不同激素處理組合設(shè)計(jì)

1.2.6桑蓓斯鳳仙瓶苗扦插生根 將2個(gè)桑蓓斯鳳仙組培脫毒繼代苗洗去根部培養(yǎng)基，剪成1～3 cm帶芽的莖段，移栽至草炭基質(zhì)中，加蓋薄膜、無(wú)紡布保濕并遮陰，15 d后統(tǒng)計(jì)生根存活情況。

1.3 試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理與分析

使用excel 2010和SPSS 19.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 桑蓓斯鳳仙外植體采集部位、大小與葉芽率的關(guān)系

2.1.1桑蓓斯鳳仙外植體采集部位 由表2可知，桑蓓斯鳳仙外植體采集部位不同，葉芽率也有所不同。橘紅色品種與粉紅色品種桑蓓斯鳳仙頂芽花芽發(fā)生率大于葉芽，而側(cè)芽葉芽發(fā)生率大于花芽率，品種間無(wú)顯著差異。

表2 外植體采集部位與葉芽數(shù)量的關(guān)系

2.1.2桑蓓斯鳳仙側(cè)芽大小與葉芽率的關(guān)系 由表3可以得出，側(cè)芽的葉芽率與側(cè)芽大小呈負(fù)相關(guān)；側(cè)芽的花芽率與側(cè)芽大小呈正相關(guān)，2個(gè)品種桑蓓斯鳳仙間差異不顯著。在采集時(shí)應(yīng)選取1～2 cm大小側(cè)芽進(jìn)行莖尖離體培養(yǎng)，0～1 cm側(cè)芽葉芽率雖高于1～2 cm側(cè)芽，但芽體幼嫩操作時(shí)易受到損傷。

表3 桑蓓斯側(cè)芽大小與葉芽率

2.2 莖尖剝離大小對(duì)成活率的影響

由表4可知，隨著剝離的莖尖增大，成活率呈先增長(zhǎng)后減弱的趨勢(shì)，污染率與剝離莖尖大小無(wú)關(guān)，褐化率隨莖尖增大而減小。莖尖剝離過(guò)小易發(fā)生褐化，0.1～0.2 mm大小的莖尖褐化率達(dá)26.7%。0.3～0.4 mm大小的莖尖成活個(gè)數(shù)最多，成活率達(dá)73%，在莖尖剝離大小中效果最好。

表4 桑蓓斯莖尖剝離大小對(duì)成活率的影響

2.3 桑蓓斯鳳仙莖尖脫毒滅菌時(shí)間篩選

由表5可知，存活率隨滅菌時(shí)間增長(zhǎng)呈先上升后下降趨勢(shì)；褐化率則隨時(shí)間增長(zhǎng)而增加；污染率呈先降低后上升趨勢(shì)。橘紅色品種在滅菌8 min時(shí)成活率為53.3%，9 min時(shí)達(dá)到最高值73.3%，之后隨滅菌時(shí)間增長(zhǎng)而降低；粉紅色品種桑蓓斯鳳仙在滅菌8 min時(shí)成活率達(dá)50%，9 min時(shí)達(dá)80%，之后也隨滅菌時(shí)間增長(zhǎng)而降低。桑蓓斯鳳仙外植體滅菌時(shí)間最佳為9 min，小于9 min滅菌效果欠佳，而大于9 min隨滅菌時(shí)間的增長(zhǎng)褐化率也有所增長(zhǎng)。

表5 桑蓓斯鳳仙莖尖脫毒滅菌時(shí)間篩選

2.4 桑蓓斯鳳仙微莖尖培養(yǎng)及繼代增殖培養(yǎng)基篩選

2.4.12個(gè)品種桑蓓斯鳳仙微莖尖培養(yǎng)比較由圖1、圖2可知，2個(gè)品種桑蓓斯鳳仙剝離成活后生長(zhǎng)緩慢，45 d后愈傷組織形成，分化出根系。隨著根系的生長(zhǎng)，株高、葉片數(shù)也逐漸增加。45 d后2個(gè)品種桑蓓斯鳳仙生長(zhǎng)加快，其中根系生長(zhǎng)尤為明顯。橘紅色品種生長(zhǎng)略大于粉紅色品種。

圖1 粉紅色品種桑蓓斯鳳仙微莖尖培養(yǎng)比較

圖2 橘紅色品種桑蓓斯鳳仙微莖尖培養(yǎng)比較

由表6可知，粉紅色品種在芽數(shù)、株高、節(jié)間長(zhǎng)、葉片數(shù)方面優(yōu)于橘紅色品種，2個(gè)品種節(jié)數(shù)相同；粉紅色品種株型略大于橘紅色品種。在增殖方面，粉紅色增殖芽數(shù)大于橘紅色，但2個(gè)品種增殖系數(shù)相同。

表6 2個(gè)品種桑蓓斯鳳仙繼代增殖比較

2.4.22個(gè)品種桑蓓斯鳳仙繼代增殖培養(yǎng)基篩選由表7可知，當(dāng)6-BA0.5 mg/L、NAA0.1 mg/L時(shí)，2個(gè)品種桑蓓斯鳳仙芽數(shù)、株高、節(jié)間長(zhǎng)優(yōu)于其他質(zhì)量濃度達(dá)到顯著水平。隨著6-BA質(zhì)量濃度增長(zhǎng)，三項(xiàng)指標(biāo)均呈先增長(zhǎng)后下降趨勢(shì)，芽數(shù)及株高在6-BA0.5 mg/L時(shí)與其他處理存在顯著差異，達(dá)到最大值；節(jié)間長(zhǎng)在6-BA0.3 mg/L時(shí)達(dá)到最大值。因此，6-BA0.5 mg/L對(duì)橘紅色桑蓓斯鳳仙生長(zhǎng)促進(jìn)效果最明顯。當(dāng)NAA質(zhì)量濃度從0.1 mg/L增加至0.2 mg/L時(shí)，對(duì)芽數(shù)、株高、節(jié)間長(zhǎng)均有明顯抑制作用。

表7 不同處理對(duì)2個(gè)品種桑蓓斯鳳仙繼代增殖的影響

2.5 桑蓓斯鳳仙組培苗瓶外生根技術(shù)優(yōu)化

桑蓓斯鳳仙組培苗瓶外生根成活率及性狀比較見(jiàn)表8。取生長(zhǎng)健壯的2個(gè)品種桑蓓斯鳳仙瓶苗各20瓶，橘紅色插穗140株、粉紅色插穗160株，洗去根部培養(yǎng)基剪成1～3 cm帶芽的莖段，移栽至草炭基質(zhì)中保濕遮陰，15 d后全部存活，生根率達(dá)100%，存活率達(dá)100%。2個(gè)品種間根系數(shù)量長(zhǎng)度粗細(xì)相似，粉紅色品種根系略優(yōu)于橘紅色品種。

表8 2個(gè)品種桑蓓斯鳳仙瓶外生根成活率比較

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

本試驗(yàn)通過(guò)桑蓓斯鳳仙莖尖離體培養(yǎng)及繼代增殖培養(yǎng)，篩選出適合其的莖尖剝離大小及繼代增殖最適培養(yǎng)基。劉靜等[4]以鳳仙的帶芽莖段、莖尖、幼葉為外植體培養(yǎng)，結(jié)果表明，誘導(dǎo)芽的最適培養(yǎng)基為MS+0.5 mg/LBA+0.01 mg/LIAA+0.01 mg/LGA3，芽的增殖培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/LBA+0.01 mg/LIAA+0.01 mg/LGA3；增殖系數(shù)為6～8倍。根誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基為MS+0.1～0.5 mg/LBA+0.005 mg/LIAA。趙貞[5]研究表明，以無(wú)菌苗的幼嫩葉片作為愈傷組織誘導(dǎo)的外植體，愈傷組織誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基為MS+0.5 mg/L6-BA+1.0 mg/L2，4-D+0.2 mg/LNAA，其誘導(dǎo)率達(dá)100%；鳳仙花愈傷組織分化出根的最佳培養(yǎng)基為MS+0.2 mg/LKT+0.05 mg/LNAA+0.2 mg/L6-BA；分化出芽的最佳培養(yǎng)基為MS+0.3 mg/L6-BA+0.2 mg/LNAA。佟鳳芹[6]等以鳳仙莖段為外植體研究表明，在附加BA1.0 mg/L、NAA0.2 mg/L、3%蔗糖的MS固體培養(yǎng)基上可誘導(dǎo)莖段外植體直接產(chǎn)生大量不定芽，在含BA 1.0 mg/L、NAA 0.2 mg/L、3%蔗糖的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng)，可大量增殖。

3.2 結(jié)論

1）桑蓓斯鳳仙側(cè)芽的葉芽率大于頂芽，1～2 cm大小的側(cè)芽葉芽率最高；消毒9 min，莖尖剝離0.3～0.4 mm，成活率最高達(dá)73%。

2）繼代培養(yǎng)最適培養(yǎng)基為MS+6-BA0.5/mg/L+NAA0.1 mg/L，增殖系數(shù)達(dá)3.6。

3）桑蓓斯鳳仙組培苗瓶外生根，生根率達(dá)100%。