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    外源酚酸對生防細菌拮抗尖孢鐮刀菌西瓜專化型的影響

    2022-05-04 10:25:52孫小涵黃凱悅田彥梅
    農(nóng)業(yè)科學研究 2022年1期
    關鍵詞:肉桂酸鄰苯二甲酸苯甲酸

    孫小涵,馬 鈺,黃凱悅,田彥梅,顧 欣

    (寧夏大學 農(nóng)學院,寧夏 銀川 750021)

    西瓜連作可導致土壤物理、化學和生物性質(zhì)發(fā)生變化,生產(chǎn)性能降低,還會引起土壤真菌化,尤其引起病原真菌數(shù)量增加,致使西瓜開花坐果后易發(fā)生枯萎病,造成西瓜產(chǎn)量、品質(zhì)下降,甚至絕收,產(chǎn)生嚴重的連作障礙[1],而且枯萎病發(fā)病率有隨連作年限增長而增加的趨勢[2]。西瓜枯萎病的主要致病菌為尖孢鐮刀菌西瓜?;停‵usarium oxysporumf.sp.niveum,F(xiàn)ON),尤以溫室栽培和大棚種植環(huán)境易發(fā)病。

    連作可導致作物根系分泌物在土壤中積累,分泌物達到一定濃度后會對植株產(chǎn)生毒害作用,這是引起連作障礙的主要因素之一[3—4]。其中,酚酸類物質(zhì)作為重要的化感物質(zhì),一方面會降低土壤中某些養(yǎng)分的含量[5],影響土壤中多種酶的活性[6];另一方面會改變土壤微生物區(qū)系[7]。有研究表明,土壤酚酸的種類、濃度及無機養(yǎng)分與土壤微生物類群分布存在一定關系[8]。土壤中酚酸的累積可直接影響土壤的理化性質(zhì),從而使土壤微生物多樣性、群落結(jié)構(gòu)、生物量和活性發(fā)生改變,某些種類的微生物在數(shù)量及活性上顯著增加或趨于增長,同時另一些微生物則呈下降趨勢[9—10]。西瓜根系分泌物及其中的酚酸物質(zhì)對FON產(chǎn)孢、萌發(fā)及生長往往具有“低濃度促進,高濃度抑制”的作用規(guī)律,而水稻根系分泌物及其中的酚酸物質(zhì)則抑制FON產(chǎn)孢及萌發(fā)[11]。有研究表明,連作土壤中并存著多種酚酸類物質(zhì),且酚酸類物質(zhì)之間存在互作效應[12]。如不同濃度水平的水楊酸分別對對羥基苯甲酸表現(xiàn)增效和拮抗作用。因此,連作環(huán)境中由酚酸物質(zhì)導致的化感作用是多種酚酸物質(zhì)共同作用的結(jié)果[13]。

    將生防微生物引入綜合防控系統(tǒng)是重要且有效的方法之一[14]。目前,已獲得若干拮抗FON的菌株,并經(jīng)室內(nèi)試驗證明其對病原菌具有不同程度的拮抗作用[15—16],部分菌株在田間的試驗也表現(xiàn)出較好的防效[17]。然而,筆者在應用菌劑中遇到了二個問題,一是某些生防菌株在室內(nèi)對峙培養(yǎng)試驗中具有較高抑菌率,而田間防效卻不盡如人意;二是相同生防菌劑在不同土壤環(huán)境中使用,防效具有差異。土壤微生物的生存及活性極易受環(huán)境因子的影響[18]。連作土壤中的酚酸類物質(zhì)與植株健康生長和土壤病原菌數(shù)量變化存在一定關系,但其對病原菌的拮抗菌及其功能的影響至今未見報道。本試驗在添加不同濃度鄰苯二甲酸、對羥基苯甲酸、阿魏酸、肉桂酸和混合酚酸的條件下,比較FON和生防細菌菌落生長的情況,并通過對峙培養(yǎng),研究不同外源酚酸對生防細菌拮抗FON性能的影響,以期為生防菌劑的應用研究提供依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 試驗材料

    1.1.1供試病原菌 西瓜專化型尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporumf.sp.niveum,F(xiàn)ON)菌株由寧夏大學農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境教研室提供。

    1.1.2供試拮抗菌 供試拮抗菌為商品菌劑,購自當?shù)剞r(nóng)資市場。含單一細菌-解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens),有效活菌數(shù)500×108CFU/mL。

    1.1.3培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基用于病原菌的培養(yǎng)和對峙試驗。

    1.1.4試劑 供試鄰苯二甲酸由國藥集團化學試劑有限公司提供,對羥基苯甲酸和肉桂酸由北京索萊寶科技有限公司提供,阿魏酸由北京博奧拓達科技有限公司提供。

    1.2 試驗方法

    1.2.1病原菌活化與菌碟制備 在直徑為9.0 cm的PDA平板中央點接少量FON斜面培養(yǎng)物,28℃、相對濕度60%,倒置培養(yǎng)5~6 d,待菌落基本長滿平皿,于距平皿中心2.0 cm處用無菌打孔器打取直徑0.5 cm、菌絲生長狀態(tài)一致的菌碟備用。

    1.2.2拮抗細菌對FON菌落生長的影響 以無菌水制備菌劑10倍、50倍和100倍稀釋液,室溫下?lián)u床振蕩混勻30 min,制成菌懸液。在PDA平板中央放置1個FON菌碟,以菌碟為中心距其邊緣2.0 cm處以十字對稱方式放置4個無菌牛津杯,每個杯中注入同一稀釋倍數(shù)菌懸液120μL,28℃恒溫培養(yǎng)24 h。此時菌懸液中大部分水分已蒸發(fā),取走牛津杯,持續(xù)培養(yǎng)并于48、72和96 h時觀察菌落生長情況,使用游標卡尺測量FON菌落直徑并記錄數(shù)據(jù)。在牛津杯內(nèi)注入120μL無菌水作為空白對照。每處理設5次重復。抑菌率計算公式:抑菌率(%)=(對照菌落直徑-處理后菌落直徑)/對照菌落直徑×100。

    1.2.3不同酚酸對FON菌落生長的影響 用無菌水制備質(zhì)量濃度為10、30和50 mg/L的鄰苯二甲酸、對羥基苯甲酸、阿魏酸、肉桂酸和混合酚酸試劑,混合酚酸試劑中鄰苯二甲酸、對羥基苯甲酸、阿魏酸和肉桂酸的質(zhì)量分數(shù)各占1/4。取酚酸試劑0.1 mL置于PDA培養(yǎng)基表面,用無菌三角棒均勻涂抹,靜置2~3 min,待其滲入培養(yǎng)基,制成酚酸平板。于酚酸平板中央放置1個FON菌碟,28℃恒溫條件下倒置培養(yǎng),分別于48、72和96 h時觀察菌落生長情況,測量FON菌落直徑并記錄數(shù)據(jù)。以培養(yǎng)基表面加0.1 mL無菌水代替酚酸試劑為空白對照(CK1)。每處理設5次重復。

    1.2.4不同酚酸對拮抗細菌菌落生長的影響 在酚酸平板中央?yún)^(qū)放置2個無菌牛津杯,二者相距4.0 cm,每個杯中注入同種菌劑的100倍稀釋液120μL,28℃恒溫培養(yǎng),至24 h取走牛津杯,分別于48、72和96 h時觀察菌落生長情況,測量菌落直徑并記錄數(shù)據(jù)。以培養(yǎng)基上加0.1 mL無菌水代替酚酸試劑為空白對照(CK2)。每處理設5次重復。

    1.2.5不同酚酸對生防細菌拮抗FON的影響 用30 mg/L的5種酚酸試劑制備相應的酚酸平板,方法同1.2.3。于酚酸平板中央放置1個FON菌碟,以菌碟為中心距其2.0 cm處以十字對稱方式分別放置4個無菌牛津杯,每個杯中注入同一稀釋倍數(shù)的菌懸液120μL,28℃恒溫培養(yǎng),至24 h取走牛津杯,分別于48、72和96 h時觀察菌落生長情況,測量FON菌落直徑并記錄數(shù)據(jù),以無菌水代替酚酸和菌劑為絕對對照,計算抑菌率。以培養(yǎng)基表面加0.1 mL無菌水代替酚酸試劑為空白對照(CK3)。每處理設5次重復。

    1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

    本試驗數(shù)據(jù)采用microsoft excel 2010處理及制作圖表;方差分析采用SPSS;利用LSD法在P<0.05水平上進行差異顯著性檢驗。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 拮抗細菌對FON菌落生長的影響

    由圖1可知,供試菌劑對FON具有拮抗作用,抑菌率隨著菌劑稀釋倍數(shù)的增大而降低。培養(yǎng)48、72和96 h時,與10倍稀釋液的抑菌率比較,菌劑50倍稀釋液的抑菌率分別降低3.62%、2.98%和1.02%,100倍稀釋液的抑菌率分別降低6.72%、3.64%和1.28%。這說明菌劑對病原菌的抑制率隨稀釋倍數(shù)增加而減小,稀釋10倍處理的抑菌率顯著高于稀釋100倍處理;隨著培養(yǎng)時間的增長,各稀釋倍數(shù)處理間抑菌率的差異呈降低趨勢。

    圖1 不同稀釋倍數(shù)的拮抗菌劑對FON的抑菌率

    2.2 不同酚酸對FON菌落生長的影響

    由表1可知,在試驗的質(zhì)量濃度范圍內(nèi),不同酚酸處理均對FON菌落生長具有促進作用,且該作用隨酚酸質(zhì)量濃度增加而增強。隨著培養(yǎng)時間的增長,不同酚酸對FON菌落直徑的促進作用發(fā)生了變化。50 mg/L不同酚酸處理對FON菌落生長的促進作用如下:培養(yǎng)48 h時由強到弱依次為鄰苯二甲酸、對羥基苯甲酸、混合酚酸、阿魏酸、肉桂酸,菌落直徑較CK分別增加了3.74%、3.54%、2.77%、2.36%和2.21%;培養(yǎng)72 h時強弱依次為混合酚酸、阿魏酸、肉桂酸、對羥基苯甲酸、鄰苯二甲酸;培養(yǎng)96 h時強弱依次為肉桂酸、混合酚酸、對羥基苯甲酸、鄰苯二甲酸、阿魏酸。培養(yǎng)48 h,同一酚酸組中50 mg/L處理對菌落直徑的促進作用顯著高于10 mg/L處理,鄰苯二甲酸、對羥基苯甲酸、混合酚酸、阿魏酸和肉桂酸的增幅分別為2.95%、2.18%、1.88%、1.79%和0.81%。隨著培養(yǎng)時間的增長,該差異逐漸縮小,至96 h時差異無顯著性。

    表1 不同酚酸對FON菌落直徑的影響

    2.3 不同酚酸對生防細菌菌落生長的影響

    拮抗菌株是生防菌劑的核心成分,作為微生物活體,其生長受到不同酚酸的影響。如表2所示,不同酚酸對生防細菌菌落的生長具有顯著抑制作用,抑制強度因酚酸種類而不同,并隨著酚酸質(zhì)量濃度增加而增強。50 mg/L不同外源酚酸對生防細菌菌落生長的抑制作用如下:培養(yǎng)48 h時由強到弱依次為鄰苯二甲酸、混合酚酸、阿魏酸、對羥基苯甲酸、肉桂酸,菌落直徑較CK分別減少了18.82%、18.68%、17.24%、16.71%和15.13%;培養(yǎng)72和96 h時強弱依次為混合酚酸、鄰苯二甲酸、對羥基苯甲酸、肉桂酸、阿魏酸。培養(yǎng)初期,50 mg/L鄰苯二甲酸、肉桂酸和混合酚酸對生防細菌菌落直徑的抑制作用顯著高于10 mg/L相應酚酸處理,培養(yǎng)時間至72、96 h差異幅度縮減至無顯著性。50 mg/L混合酚酸處理的菌落直徑均為各組最低水平,48、72和96 h菌落直徑與CK相比降幅為18.68%、14.64%和14.64%。

    表2 不同酚酸對生防細菌菌落直徑的影響

    2.4 不同酚酸對生防細菌拮抗FON的影響

    由圖2可知,在外源酚酸環(huán)境中,生防細菌仍對FON表現(xiàn)出拮抗性,抑菌率隨著菌劑稀釋倍數(shù)的增加而降低。添加不同酚酸顯著降低菌劑對FON的抑菌率,48 h時與CK比較,不同酚酸處理下菌劑的10、50和100倍稀釋液的抑菌率分別下降16.94%~21.23%、18.27%~25.32%和23.79%~28.19%。30 mg/L酚酸處理下,肉桂酸對菌劑100倍稀釋液拮抗性的影響最大,抑菌率僅為19.23%,較CK降低了28.19%;混合酚酸對菌劑10倍稀釋液拮抗性的影響最小,抑菌率為23.85%,較CK降低了16.94%(圖2-a)。如圖2-b和2-c所示,隨著培養(yǎng)時間的增長,各處理的抑菌率進一步提高,但相同時間內(nèi)的增幅逐漸減小,抑菌率與CK的差距縮小。至96 h時,除CK和阿魏酸,各菌劑不同稀釋倍數(shù)處理間的抑菌率差異不顯著。CK3組10倍稀釋液的抑菌率始終顯著高于50和100倍稀釋液。阿魏酸組10倍稀釋液的抑菌率始終顯著高于100倍稀釋液。

    圖2 不同酚酸處理下不同稀釋倍數(shù)菌劑對FON的抑制率

    3 結(jié)論與討論

    3.1 不同酚酸對FON菌落生長的影響不同

    土壤中的酚酸類物質(zhì)多源于植物的根系代謝分泌和植株殘體分解,其中多種酚酸處于一定濃度范圍可促進FON的菌絲生長及產(chǎn)孢[11],同時考慮到耕作層土壤中單一酚酸濃度多處于較低水平,故本試驗采用的酚酸質(zhì)量濃度為10~50 mg/L。郝文雅等[11]研究酚酸類物質(zhì)對FON的影響,認為阿魏酸、對羥基苯甲酸、鄰苯二甲酸對FON孢子萌發(fā)、產(chǎn)孢具有促進作用,且阿魏酸的促進作用較為突出。本試驗結(jié)果表明,10~50 mg/L的鄰苯二甲酸、對羥基苯甲酸、阿魏酸、肉桂酸及4種酚酸的混合物對FON菌落的生長均具有促進作用。培養(yǎng)初期50 mg/L酚酸處理的菌落直徑顯著大于低質(zhì)量濃度處理,且阿魏酸對FON菌落的促生長作用顯著低于其他酚酸。隨著培養(yǎng)時間的增長,酚酸類物質(zhì)作為有機營養(yǎng)物可被微生物所消耗[19],培養(yǎng)至96 h時,該試驗環(huán)境中部分酚酸可能已被降解,各處理的FON菌落直徑無顯著差異。

    3.2 不同酚酸對拮抗菌菌落生長的影響不同

    試驗采用細菌型生防菌劑。由于細菌的最適pH值范圍一般為弱堿性,故外源添加酚酸造成環(huán)境pH值降低,不利于細菌的生長。試驗結(jié)果表明,鄰苯二甲酸、對羥基苯甲酸、阿魏酸、肉桂酸及4種酚酸的混合物對生防細菌生長均具有抑制作用,至72、96 h時已無顯著差異。培養(yǎng)至96 h,阿魏酸對生防細菌生長的抑制作用最低。值得注意的是,較高質(zhì)量濃度的混合酚酸對生防細菌菌落生長的抑制作用處于最高水平(除鄰苯二甲酸對菌劑10倍稀釋液處理外),這說明混合酚酸較相同質(zhì)量濃度的單一酚酸對生防細菌生長的抑制作用更強。土壤中共存多種酚酸類物質(zhì),且連作土壤的酚酸含量高于非連作土壤[20],因此連作土壤中酚酸的積累必然影響生防細菌的生物活性。

    3.3 不同酚酸對菌劑拮抗FON能力的影響不同

    生防菌劑中拮抗菌的數(shù)量與稀釋倍數(shù)成反比,因此無論環(huán)境中是否有酚酸,抑菌率均隨著稀釋倍數(shù)的增加而減小。外源添加一定質(zhì)量濃度的酚酸類物質(zhì),對FON和生防細菌菌落的生長分別具有顯著促進作用和抑制作用,導致生防菌劑對FON的抑菌率顯著降低。在培養(yǎng)初期(48 h),環(huán)境中的酚酸含量較高,抑菌率顯著下降,最高降幅達28.19%。隨著培養(yǎng)時間的增長,可能由于環(huán)境中的酚酸逐漸被菌體消耗,質(zhì)量濃度下降,其對抑菌率的影響也逐漸減小,直到與CK無顯著性差異。至培養(yǎng)后期(96 h),阿魏酸對FON的促生長作用及其對生防菌生長的抑制作用均為最弱,故不同稀釋倍數(shù)菌劑的抑菌率差異較大,與CK相似。一般而言,有機酸分子量越大,越不易被降解。阿魏酸是試驗中分子量最大的酚酸,可能由此導致其對微生物的作用較弱。值得關注的是,混合酚酸對生防細菌生長的抑制作用最強,但在生防細菌與FON對峙培養(yǎng)的初期,雖然顯著降低了生防細菌的抑菌率,但對其影響的強度卻不及其他酚酸處理??赡苁怯捎诓煌铀嶂g的互作效應不同[13],以及微生物對各種酚酸的敏感度和代謝差異導致了該結(jié)果。

    鄰苯二甲酸、對羥基苯甲酸、阿魏酸、肉桂酸及4種酚酸的混合物對FON的生長具有促進作用,對其生防細菌的生物活性具有抑制作用,從而導致酚酸環(huán)境中生防細菌對FON的拮抗性下降,且菌劑稀釋倍數(shù)越大,受酚酸影響越嚴重,下降幅度越大。混合酚酸對生防細菌的抑制作用較相同質(zhì)量濃度的單一酚酸更強。因此,在酚酸積累的環(huán)境如連作土壤或基質(zhì)中施用細菌型生防菌劑,應適當降低菌劑的稀釋倍數(shù),有利于生防菌株對病原菌的拮抗性保持在較高水平。

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