響應(yīng)面法優(yōu)化超聲乙醇提取南五味子藤莖中木脂素工藝

穆開朗，程昆木，王 錦，陳嘉悅

（安康學(xué)院，a.化學(xué)化工學(xué)院；b.秦巴中藥資源研發(fā)中心，陜西 安康 725000）

木蘭科植物五味子［Schisandra chinensis（Turcz.）Baill.］屬于斂肺澀腸類中藥，因產(chǎn)地不同而分為南五味子和北五味子，具有收斂固滯、益氣生津、補(bǔ)腎寧心等功效［1-4］。五味子因其臨床治療效果突出而廣受市場歡迎。合格的五味子果實(shí)在其一個(gè)生長周期內(nèi)需每年修剪3次藤莖，而這3次修剪后留下的藤莖常被當(dāng)作廢棄物丟棄，造成很大的浪費(fèi)［5-8］。近年來，一些學(xué)者開始將關(guān)注點(diǎn)從五味子的果實(shí)轉(zhuǎn)至五味子的藤莖上來。隨著對五味子藤莖研究的深入，發(fā)現(xiàn)五味子的藤莖中也包含與其果實(shí)相同的主要藥效成分——木脂素類成分［9，10］，在前期研究中發(fā)現(xiàn)五味子藤莖中也富含大量黃酮類、多糖類成分［11］。因此，五味子藤莖的開發(fā)利用具有廣闊的前景。本研究以五味子藤莖中木脂素提取的最佳工藝作為切入點(diǎn)，在4個(gè)單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面Box-Behnken的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，將超聲功率、超聲時(shí)間、超聲溫度、料液比作為試驗(yàn)考查因素，探究超聲-乙醇提取五味子藤莖中木脂素的最佳提取工藝，為大量應(yīng)用五味子藤莖及工業(yè)化高效提取藤莖中木脂素提供科學(xué)理論依據(jù)和工藝路線。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

南五味子藤莖，陜西省安康市平利縣。甲醇、無水乙醇（色譜純），95%乙醇（分析純），天津天力化學(xué)試劑有限公司；五味子乙素標(biāo)準(zhǔn)品，成都植標(biāo)化純生物技術(shù)有限公司；五味子酯甲標(biāo)準(zhǔn)品，江蘇永健醫(yī)藥科技有限公司；三重蒸餾水，實(shí)驗(yàn)室自制。

1.2 儀器與設(shè)備

FW177型中草藥粉碎機(jī)，天津泰斯特儀器有限公司；LC-10ATvp型高效液相色譜儀，日本島津公司；YP5002型電子天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；KQ2200E型超聲波清洗儀，昆山市超聲儀器有限公司；FA2014型精密分析天平，上海良平儀器儀表有限公司；Molbiochem 520型超純制水機(jī)，重慶摩爾水處理設(shè)備有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品的前處理將采集的五味子藤莖清洗干凈，除去表面泥沙，晾干，在烘箱內(nèi)60℃烘干，粉碎，過16目篩后存于干燥器中，備用。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

1）超聲功率對提取率的影響。精密稱取樣品粉末5份，每份3.000 0 g，在超聲時(shí)間30 min，超聲溫度35℃，料液比1∶15（g/mL，下同）的條件下，超聲功率分別設(shè)定為80、120、160、200、240 W提取木脂素并計(jì)算提取率。

2）超聲時(shí)間對提取率的影響。精密稱取樣品粉末5份，每份3.000 0 g，在超聲功率100 W，超聲溫度35℃，料液比1∶15的條件下，超聲時(shí)間分別設(shè)定為30、40、50、60、70 min提取木脂素并計(jì)算提取率。

3）超聲溫度對提取率的影響。精密稱取樣品粉末5份，每份3.000 0 g，在超聲功率100 W，超聲時(shí)間30 min，料液比1∶15的條件下，超聲溫度分別設(shè)定為35、45、55、65、75℃提取木脂素并計(jì)算提取率。

4）料液比對提取率的影響。精密稱取樣品粉末5份，每份3.000 0 g，在超聲功率100 W，超聲時(shí)間30 min，超聲溫度35℃，料液比分別設(shè)定為1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35提取木脂素并計(jì)算提取率。

1.3.3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)利用響應(yīng)面Box-Behnken的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，木脂素提取率作為響應(yīng)值，將超聲功率、超聲時(shí)間、超聲溫度、料液比作為試驗(yàn)考查的影響因素，探究超聲-乙醇提取南五味子藤莖中木脂素的最佳提取工藝，各影響因素與水平見表1。

表1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)因素與水平

1.3.4 數(shù)據(jù)處理采用Design-Expert 10軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理及分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 超聲功率對五味子藤莖中木脂素提取率的影響由圖1可知，當(dāng)超聲功率在80～200 W時(shí)，隨著超聲功率的增加，木脂素的提取率逐漸升高，到200 W時(shí)達(dá)到最大值，此時(shí)木脂素的提取率為0.275%。當(dāng)超聲功率大于200 W時(shí)，隨著超聲功率的增加，木脂素的提取率緩慢下降?？赡苁且?yàn)殡S著超聲功率逐漸增大，機(jī)械剪切力也相應(yīng)地不斷增強(qiáng)，使得細(xì)胞破裂，木脂素類化合物從細(xì)胞內(nèi)流出，但是當(dāng)超聲功率過大時(shí)，內(nèi)部能量過大使得溫度過高，木脂素類化合物的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變導(dǎo)致提取率下降，因此，選擇超聲功率200 W較合適。

圖1 超聲功率對木脂素提取率的影響

2.1.2 超聲時(shí)間對五味子藤莖中木脂素提取率的影響由圖2可知，當(dāng)超聲時(shí)間在30～60 min時(shí)，隨著超聲時(shí)間的增加，木脂素的提取率有明顯的提高，當(dāng)超聲時(shí)間在60 min時(shí)，木脂素的提取率最大達(dá)0.265%。當(dāng)超聲時(shí)間大于60 min后，木脂素的提取率基本保持不變。這是由于隨著超聲時(shí)間的加長，木脂素類化合物逐漸從細(xì)胞內(nèi)流出，溶于乙醇溶液中，直至達(dá)到最大值，因此，選擇超聲時(shí)間60 min較合適。

圖2 超聲時(shí)間對木脂素提取率的影響

2.1.3 超聲溫度對五味子藤莖中木脂素提取率的影響由圖3可知，當(dāng)超聲溫度在35～55℃時(shí)，隨著超聲溫度的增加，木脂素的提取率不斷升高，當(dāng)超聲溫度在55℃時(shí)，木脂素的提取率達(dá)到最大值0.276%。當(dāng)超聲溫度超過55℃后，木脂素的提取率逐漸下降。這是由于超聲溫度的逐漸上升，細(xì)胞內(nèi)聚能升高使得細(xì)胞破裂，木脂素類化合物流出，溶于乙醇溶液中。但是當(dāng)溫度到達(dá)一定值后，木脂素類化合物發(fā)生氧化，使得提取率緩慢降低，因此，選擇超聲溫度55℃較合適。

圖3 超聲溫度對木脂素提取率的影響

2.1.4 料液比對五味子藤莖中木脂素提取率的影響由圖4可知，當(dāng)南五味子藤莖的料液比在1∶15至1∶30時(shí)，木脂素的提取率會(huì)因加入乙醇含量的增加而有所升高。在料液比1∶30時(shí)，木脂素類化合物的提取率達(dá)最高值0.269%，而且當(dāng)南五味子藤莖料液比超過1∶30后，木脂素的提取率就會(huì)趨于穩(wěn)定。這是由于細(xì)胞內(nèi)流出的木脂素類化合物，在乙醇中的溶解度有一定的飽和度，隨著乙醇含量的逐漸上升，木脂素類化合物在乙醇溶液中溶解的也越來越多，直到將木脂素類化合物全部溶解，因此，選擇料液比1∶30較合適。

圖4 料液比對木脂素提取率的影響

2.1.5 單因素試驗(yàn)結(jié)果的驗(yàn)證與分析由單因素試驗(yàn)得到超聲乙醇法提取南五味子藤莖中木脂素的最優(yōu)工藝，即超聲功率200 W，超聲時(shí)間60 min，超聲溫度55℃，料液比1∶30。根據(jù)以上單因素試驗(yàn)的結(jié)果，進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，得出南五味子藤莖木脂素提取率分別為0.259%、0.264%、0.252%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為3.62%，說明用此工藝條件對南五味子藤莖木脂素提取穩(wěn)定可靠。

驗(yàn)證試驗(yàn)并未達(dá)到單因素試驗(yàn)中木脂素提取率的最大值，考慮可能是由于單因素試驗(yàn)未將因素之間的交互作用做分析，再加上單因素試驗(yàn)只能在各因素條件節(jié)點(diǎn)上取值，從而導(dǎo)致優(yōu)化試驗(yàn)存在誤差，試驗(yàn)結(jié)論可靠性不強(qiáng)。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果與方差分析以超聲功率、超聲時(shí)間、超聲溫度和料液比作為主要的影響因素，在這4個(gè)影響因素上分別選擇3種水平，采用南五味子藤莖中木脂素的提取率作為響應(yīng)值，超聲-乙醇提取南五味子藤莖中木脂素的響應(yīng)試驗(yàn)方案與結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

利用Design Expert 10軟件對本次試驗(yàn)數(shù)據(jù)和影響因子進(jìn)行二次回歸模型的擬合，通過二次回歸分析，回歸方程如下：

對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，由表3可知，二次多元回歸模型P＜0.000 1，證明該回歸模型是顯著的；失擬項(xiàng)中F=0.49，P=0.837 8，失擬項(xiàng)不顯著；二次多元模型相關(guān)系數(shù)R2=0.966 6，表明響應(yīng)值變化有96.66%是和這4個(gè)因素有關(guān)。校正確定系數(shù)R2adj=0.982 7，表明試驗(yàn)?zāi)Ｐ偷目煽啃?。D及交互項(xiàng)A D、C D、A2、B2、C2、D2的P均小于0.000 1，表明其對木脂素的綜合提取率有顯著影響。從A、B、C、D的F值順序大小判斷出各因素對木脂素提取率的影響大小順序?yàn)镈＞C＞A＞B。

表3 模型的方差分析

2.2.2 響應(yīng)面交互作用響應(yīng)面圖形是反映響應(yīng)值與各試驗(yàn)因素之間變化的三維圖形，可從中分析出參數(shù)與最佳參數(shù)間的相互作用關(guān)系。當(dāng)響應(yīng)面為山谷型曲面時(shí)，有極小值存在；當(dāng)響應(yīng)面呈山丘狀曲面時(shí)，說明模型存在極大值。測試因素間的交互作用關(guān)系由等高線的形狀反映，若等高線曲線形狀為橢圓形，則兩因素的交互作用顯著；若等高線曲線為圓形，則交互作用不顯著，沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由圖5可知，6組響應(yīng)面均為山丘型，等高線形狀均為橢圓形，說明各因素的相互作用均有最大值存在，且各因素交互作用顯著。其中，圖5b、c、e、f的響應(yīng)面曲線走勢較陡峭，等高線形狀為橢圓形，說明這4組兩兩因素之間的交互作用對木脂素提取率影響顯著。圖5a和d的響應(yīng)面曲線走勢較為平緩，等高線形狀較圓，說明這2組因素之間的交互作用對木脂素提取率影響較小。

圖5 各因素交互作用對木脂素提取率的影響

2.2.3 優(yōu)化與驗(yàn)證試驗(yàn)利用響應(yīng)面分析得到理論最佳工藝，即超聲功率160.19 W，超聲時(shí)間50.18 min，超聲溫度54.77℃，料液比1∶27.07，該條件下木脂素的理論提取率為0.365%。為了保證響應(yīng)面試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)的可靠性，結(jié)合其實(shí)際運(yùn)用條件，將最佳的條件修正為超聲功率160 W，超聲時(shí)間50 min，超聲溫度55℃，料液比1∶27。

選擇修正后的提取條件，在此條件下重復(fù)試驗(yàn)3次，得到木脂素平均提取率為0.371%，與預(yù)測值相差1.64%，說明誤差小，所建立的響應(yīng)面優(yōu)化模型真實(shí)可靠，證明本模型的預(yù)測精度良好，工藝重現(xiàn)性良好。

3 小結(jié)

從五味子中提取木脂素類化合物常用的方法包括有機(jī)溶劑回流提取法、連續(xù)回流提取法和超聲輔助有機(jī)溶劑提取法［12，13］。超聲波提取簡單方便、綠色環(huán)保，而乙醇作為一種常用的有機(jī)溶劑，易獲取且價(jià)格低廉，本試驗(yàn)借鑒從五味子中提取木脂素的方法，同時(shí)考慮到工業(yè)化從五味子藤莖中提取木脂素的可行性，因此，選擇超聲-乙醇法提取五味子藤莖中的木脂素［14-17］。

本試驗(yàn)采用超聲輔助有機(jī)溶劑乙醇法，從南五味子藤莖中分別提取了五味子酯甲和五味子乙素，以五味子藤莖中含有的五味子酯甲和五味子乙素2種木脂素類化合物總量作為考察木脂素含量的主要指標(biāo)，使用反相高效液相色譜法測定其含量，將超聲功率、超聲時(shí)間、超聲溫度和料液比作為影響因素，響應(yīng)數(shù)值為木脂素的提取率。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面Box-Behnken設(shè)計(jì)優(yōu)化試驗(yàn)，將分析得到的優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果通過使用Design-Expert 10軟件對其進(jìn)行處理，得到本次優(yōu)化試驗(yàn)的最佳工藝為超聲功率160 W，超聲時(shí)間50 min，超聲溫度55℃，料液比1∶27，預(yù)測提取率為0.365%，經(jīng)過驗(yàn)證試驗(yàn)實(shí)際值0.371%，與預(yù)測值相差1.64%，說明該模型可以較好地優(yōu)化超聲-乙醇提取南五味子藤莖中木脂素的工藝條件。本研究對應(yīng)用中藥材五味子廢棄部位及工業(yè)化開發(fā)利用五味子藤莖具有重要意義。