Ghd7和DTH8協(xié)同調(diào)控水稻抽穗期和部分農(nóng)藝性狀

肖冬冬，宗伍輩，孫康莉，李加俊，劉耀光，郭晶心

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,廣東 廣州 510642)

抽穗期是水稻重要的農(nóng)藝性狀，決定水稻品種對栽培季節(jié)和地域的適應(yīng)性，與產(chǎn)量密切相關(guān)。水稻抽穗期受光照和溫度等外部因素調(diào)控，同時(shí)也受內(nèi)在信號(hào)如苗齡和激素的作用[1]。水稻抽穗期主要由3個(gè)因素決定：基本營養(yǎng)生長性、感光性和感溫性。水稻是典型的短日植物，短日促進(jìn)抽穗，長日延遲抽穗[2]。

在長日植物擬南芥中，光周期對開花的主要調(diào)控途徑是GI-CO-FT[3]。GI是生物鐘構(gòu)成基因，CO是核心轉(zhuǎn)錄因子，長日信號(hào)經(jīng)由GI等促進(jìn)CO在黃昏特異積累，激活成花素基因FT的轉(zhuǎn)錄。FT蛋白由葉片轉(zhuǎn)運(yùn)到莖頂端分生組織促進(jìn)成花轉(zhuǎn)換[4]。

水稻中成花素基因是Hd3a和RFT1，是擬南芥FT的同源基因[5-7]。Ehd1是水稻特有的1個(gè)抽穗基因，編碼含341個(gè)氨基酸的B型反應(yīng)調(diào)節(jié)子，激活Hd3a和RFT1的表達(dá)，促進(jìn)抽穗[8-9]。有研究表明，水稻中存在長日抑制途徑(Hd1/Ghd7/DTH8)-Ehd1-Hd3a/RFT1和短日促進(jìn)途徑Hd1-Hd3a/RFT1，協(xié)同調(diào)控抽穗期和感光性[10]。

在Ehd1、Hd3a/RFT1的上游，存在眾多調(diào)控基因。其中，水稻感光性的核心基因有Hd1、Ghd7、DTH8、OsPRR37。Hd1是克隆的第1個(gè)水稻抽穗期基因，是擬南芥CO的同源基因，蛋白含有B-box和CCT結(jié)構(gòu)域。在一定的遺傳背景中，Hd1具有雙重作用，長日抑制、短日促進(jìn)抽穗，但Hd1的轉(zhuǎn)錄水平在長、短日下并沒有明顯差異[11-13]。Ghd7為單子葉植物特有，編碼含有CCT結(jié)構(gòu)域的蛋白，長日下特異表達(dá)，一因多效，對水稻株高、抽穗和穗粒數(shù)有顯著促進(jìn)作用[14]。DTH8編碼CCAAT-Box-Binding轉(zhuǎn)錄因子中NF-YB(也稱為HAP3)亞基，長日下依賴Ghd7促進(jìn)株高、抽穗和穗粒數(shù)[15-17]。OsPRR37編碼 PSEUDO-RESPONSE REGULATOR 7的類似蛋白，也含有CCT結(jié)構(gòu)域，長日下抑制抽穗提高產(chǎn)量[18-21]。

研究表明，Hd1、Ghd7、DTH8和OsPRR37之間存在復(fù)雜的遺傳和分子互作[10,22-23]。無論日長如何，Hd1(在ghd7/dth8/OsPRR37背景中)促進(jìn)抽穗，Ghd7(在hd1/dth8/OsPRR37背景中)抑制抽穗。長日下Hd1、Ghd7和DTH8存在雙基因和三基因的互作，形成不同的蛋白抑制復(fù)合體，從而部分抑制(雙基因組合)或完全沉默(三基因組合)Ehd1-Hd3a/RFT1開花通路，使水稻不同程度地延遲抽穗或不抽穗。短日下，Ghd7的表達(dá)水平很低，Hd1原本促進(jìn)Hd3a/RFT1表達(dá)的作用與抑制復(fù)合體的作用存在競爭，不同程度地促進(jìn)抽穗。其中，無論日長如何，Ghd7和DTH8組合抑制抽穗作用更強(qiáng)。

以往對Ghd7和DTH8的研究是基于其他核心基因有功能的遺傳背景，為在不同的遺傳背景中，特別是在hd1和prr37無功能的(hd1/prr37)背景中，深入了解Ghd7和DTH8調(diào)控水稻抽穗和農(nóng)藝性狀的遺傳互作關(guān)系，本研究鑒定了1個(gè)hd1/prr37背景下Ghd7和DTH8的雙基因分離群體，發(fā)現(xiàn)Ghd7和DTH8單基因均能抑制抽穗且不受日長影響。DTH8單基因僅微弱抑制抽穗，卻能顯著增加二級枝梗數(shù)和主穗粒數(shù)。在長、短日下，Ghd7和DTH8雙基因組合更強(qiáng)烈抑制Ehd1-Hd3a/RFT1的表達(dá)，延遲抽穗，并且能夠明顯增加水稻株高、一級枝梗數(shù)、主穗粒數(shù)等農(nóng)藝性狀，具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 供試材料

華南農(nóng)業(yè)大學(xué)陳志強(qiáng)教授團(tuán)隊(duì)培育了恢復(fù)系‘航恢1179’、不育系‘寧A’及雜交稻‘寧優(yōu)1179’(粵審稻2014044)[24-25]，本研究從‘寧優(yōu)1179’后代中篩選培育了1個(gè)F6群體(hd1/prr37背景，Ghd7和DTH8雙基因分離)(簡寫為GgDd)，并從中鑒定得到4種基因型純合材料ggdd、ggDD、GGdd、GGDD。材料種植于廣東省廣州市天河區(qū)華南農(nóng)業(yè)大學(xué)教學(xué)科研基地，按水稻常規(guī)方法栽培管理。在廣州自然短日和自然長日條件下種植雙基因分離群體。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 分子標(biāo)記鑒定 采用王慧娜等[26]的方法提取水稻葉片基因組DNA。利用親本基因組中Hd1、Ghd7、DTH8和OsPRR37的序列差異設(shè)計(jì)分子標(biāo)記引物(表1)，通過PCR和聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行檢測，鑒定F2～F6個(gè)體基因型。

表1 分子標(biāo)記引物序列Table 1 The primer sequences of molecular markers

1.2.2 表型調(diào)查 廣州 (23.13°N，113.27°E)自然長日 (Natural long day，NLD：4 月下旬到 7 月中旬，包含了1 h曙暮光和日出到日落的時(shí)間，總計(jì)大于13.5 h)和自然短日 (Natural short day，NSD：8 月中旬到10月，包含了1 h曙暮光和日出到日落的時(shí)間，總計(jì)小于13.5 h)，以單株為單位每天調(diào)查抽穗期，本研究以該株主穗抽出1 cm作為始穗的標(biāo)準(zhǔn)，以種子萌動(dòng)到始穗的天數(shù)作為抽穗期。水稻材料成熟后，考察記錄株高、穗長、一級枝梗數(shù)、二級枝梗數(shù)、主穗粒數(shù)、千粒質(zhì)量、分蘗數(shù)等農(nóng)藝性狀。

1.2.3 遺傳效應(yīng)的計(jì)算 以雙基因無功能型植株ggdd為參照，計(jì)算Ghd7、DTH8和兩者組合的凈遺傳效應(yīng)(e)[10]。單基因的凈遺傳效應(yīng)計(jì)算公式：e(ggDD) =D(ggDD) -D(ggdd)、e(GGdd) =D(GGdd) -D(ggdd)，雙基因的凈遺傳效應(yīng)計(jì)算公式：e(GGDD) =D(GGDD) -D(ggdd) -e(ggDD) -e(GGdd)；式中，D代表平均抽穗期。

1.2.4 感光指數(shù)的計(jì)算 以雙基因無功能型植株ggdd為參照，計(jì)算不同功能型組合感光指數(shù)(Photoperiod sensitivity index，PSI)[10]，用 mPSIb和mPSIc分別計(jì)算同一生長季節(jié)和不同生長季節(jié)的感光指數(shù)。以DTH8為例，mPSIb(ggDD) = (DALD-DNSD)/DNSD，mPSIc(ggDD) = (DNLD-DNSD)/DNSD，同樣計(jì)算其他基因型組合的感光指數(shù)；式中，ALD代表人工長日，NLD代表自然長日，NSD代表自然短日。

1.2.5 qRT-PCR 表達(dá)檢測 在自然短日和人工長日 (Artificial long day，ALD：自然長日同期種植材料，并在黃昏人工加光，使光照時(shí)間維持在14.0～14.5 h)下種植4基因型純合材料ggdd、ggDD、GGdd、GGDD，苗齡60 d，早上8:00取樣，取每個(gè)單株的倒一至倒三葉上半段，共取3次生物學(xué)重復(fù)。采用Trizol法提取植物總RNA，經(jīng)DNaseI處理后用Oligo d(T)反轉(zhuǎn)成cDNA，用目標(biāo)基因特異引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，以Actin作為內(nèi)參基因(表2)，通過計(jì)算2-△Ct值來確定目標(biāo)基因在4種純合型材料中的相對表達(dá)量[10]。

表2 qRT-PCR 引物序列Table 2 The sequences of qRT-PCR primers

1.2.6 對農(nóng)藝性狀貢獻(xiàn)度的計(jì)算 以雙基因無功能型植株ggdd為參照，計(jì)算不同功能型組合對農(nóng)藝性狀的貢獻(xiàn)度 (Contribution degree，CD)。以DTH8為例，CDDTH8/% = (ATggDD- ATggdd)/ATggdd，式中，AT表示各農(nóng)藝性狀(Agronomic trait)的平均值，同樣方法計(jì)算其他基因型組合的貢獻(xiàn)度。

2 結(jié)果與分析

2.1 在 hd1/prr37背景中，Ghd7和 DTH8雙基因分離群體的構(gòu)建和抽穗表型

已有研究表明，Ghd7和DTH8組合抑制抽穗作用更強(qiáng)[22]。為了深入揭示Ghd7和DTH8調(diào)控水稻抽穗和農(nóng)藝性狀的遺傳互作關(guān)系，本研究構(gòu)建了1個(gè)Ghd7和DTH8雙基因分離的重組自交群體(hd1/prr37背景，詳見“1.1”)?！畬嶢’攜帶功能型Hd1、DTH8和無功能型ghd7、prr37，‘航恢1179’攜帶無功能型hd1、dth8和功能型Ghd7、PRR37。本研究利用分子標(biāo)記，在‘寧A’和‘航恢1179’的F2代中選擇hd1/prr37純合無功能、Ghd7和DTH8為雜合的植株 (基因型為Ghd7ghd7DTH8dth8，GgDd)，自交留種并持續(xù)選擇到F5，從F5中選擇GgDd基因型單株自交留種，此F6群體用于下一步研究(圖1)。

圖1 ‘寧 A’(NA)與‘航恢 1179’(HH) 4 個(gè)抽穗基因的結(jié)構(gòu)和分子標(biāo)記Fig. 1 Structures and molecular markers of four heading date genes in ‘Ning A’ (NA) and ‘Hanghui 1179’ (HH)

我們在廣州自然短日和自然長日條件下分別種植了116株和188株F6群體，觀察植株的抽穗期并進(jìn)行了分子標(biāo)記檢測。對植株的基因型進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，群體中Ghd7和DTH8獨(dú)立分配，分離符合孟德爾雙基因分離遺傳定律 9∶3∶3∶1，χ2(9∶3∶3∶1)＜χ20.05,df=3=7.82，無顯著差異 (表3)。

表3 F6 群體基因型的卡方檢驗(yàn)Table 3 The chi-square test of plant genotypes from F6 population

在自然長日下，Ghd7和DTH8雙基因分離群體的抽穗期在 82～118 d 之間呈較連續(xù)分布，110 d為抽穗高峰；ggdd和ggD_(_代表DD純合或Dd雜合)基因型植株早抽穗，G_dd型抽穗稍晚，同時(shí)攜帶功能型G_D_的植株抽穗最晚(圖2a)。在自然短日下，分離群體的抽穗期分布在 66～97 d 之間，90 d為抽穗高峰；Ggdd、G_dd和ggDD基因型的植株抽穗明顯早于G_D_植株(圖2b)。在Ghd7和DTH8雙基因分離的群體中，長、短日下二者組合植株抽穗最晚。我們從F6中篩選出4種基因型純合的植株自交留種，后續(xù)用這些純合體研究Ghd7和DTH8的遺傳互作和調(diào)控機(jī)制。

圖2 自然長日 (a)、自然短日 (b)下 Ghd7、DTH8雙基因分離群體抽穗分布Fig. 2 The distribution of heading date in Ghd7，DTH8 segregating population under natural long day (a)natural short day (b) conditions

2.2 Ghd7和 DTH8 4 種基因型組合材料的抽穗期、感光性、遺傳效應(yīng)及其對下游基因的調(diào)控

我們在廣州自然短日、同期人工長日以及自然長日下種植了4種純合型植株ggdd、ggDD、GGdd和GGDD。觀察材料的抽穗期，計(jì)算基因的凈遺傳效應(yīng)和感光指數(shù)。

我們對比分析了Ghd7和DTH8單基因以及組合對抽穗的效應(yīng)。在自然長日、人工長日和自然短日3種日長下，ggDD型植株分別比ggdd型晚抽穗6、5和6 d，表明DTH8有較弱的抑制抽穗的作用。GGdd型植株比ggdd型抽穗晚，Ghd7在3種日長條件下分別抑制抽穗17、10和13 d。GGDD型植株在各種日長條件下抽穗均為最晚，比ggdd型分別晚 31、24 和 29 d (圖3、圖4)。我們通過計(jì)算凈遺傳效應(yīng)(e)來分析Ghd7與DTH8組合對抽穗期的影響，結(jié)果表明，Ghd7和DTH8組合抑制抽穗的作用，在扣除了Ghd7和DTH8單基因的效應(yīng)后，還有8～10 d；這說明二者組合后的效應(yīng)不是簡單的加性關(guān)系。DTH8對抽穗的影響較小，和Ghd7組合在一起后二者產(chǎn)生了更高階的互作，表現(xiàn)出更強(qiáng)的抑制作用(表4)。感光指數(shù)用來衡量和比較材料的抽穗期對日長的敏感程度，數(shù)值越大，感光性越強(qiáng)[10]。4種基因型材料ggdd、ggDD、GGdd和GGDD，在同一生長季節(jié)人工長日和自然短日的抽穗期，測得的感光指數(shù)(mPSIb)分別是0.08、0.06、0.03和0；在不同生長季節(jié)自然長日和自然短日的抽穗期，測得的感光指數(shù)(mPSIc)分別是0.19、0.17、0.20和0.15。由于本研究中材料在自然短日和人工長日下的抽穗期是在同一生長階段觀察到的，同一生長季節(jié)感光指數(shù)更準(zhǔn)確。結(jié)果表明在hd1/prr37背景中，單基因Ghd7、DTH8以及二者組合株系的感光性弱。

圖3 4種純合型株系在自然長日(a)和自然短日(b)下的表型Fig. 3 Phenotypes of four isogenic lines under natural long day (a) and natural short day (b) conditions

圖4 4種純合型株系在不同日長條件下的抽穗期Fig. 4 Heading dates of four isogenic lines under different day-length conditions

表4 不同日長條件下Ghd7、DTH8對抽穗的凈遺傳效應(yīng)(e)1)Table 4 Net genetic effect (e) on heading date of Ghd7 and DTH8 under different day-length conditions

為了研究Ghd7和DTH8不同組合對下游基因的調(diào)控，我們利用qRT-PCR檢測4種純合基因型材料的葉片(自然短日和人工長日下，苗齡60 d，早上8:00取樣)中Ehd1、Hd3a、RFT1的表達(dá)。我們結(jié)合遺傳效應(yīng)來分析表達(dá)數(shù)據(jù)，GGDD型植株比ggDD型抽穗晚，Ghd7在長、短日都下調(diào)Ehd1、Hd3a和RFT1的表達(dá)，抑制抽穗；Ghd7和DTH8的組合在長、短日下更明顯地抑制Ehd1、Hd3a和RFT1的表達(dá)，對抽穗的抑制作用更強(qiáng)；DTH8在長、短日下微弱抑制抽穗，但對下游基因的調(diào)控卻沒有表現(xiàn)出相應(yīng)的規(guī)律 (圖5a～5f)。

圖5 4 種純合型株系人工長日 (a～c)、自然短日 (d～f)下Ehd1、Hd3a和 RFT1的表達(dá)Fig. 5 Expression of Ehd1,Hd3a and RFT1 in the four isogenic lines under artificial long day (a-c) and natural short day(d-f) conditions

2.3 Ghd7和 DTH8 4 種基因型組合材料的農(nóng)藝性狀

已有的研究表明Ghd7和DTH8是多效性基因，調(diào)控抽穗期、分蘗數(shù)、千粒質(zhì)量等[14,16]。我們系統(tǒng)考察了自然短日和自然長日下Ghd7與DTH8的4種組合材料的農(nóng)藝性狀，包括株高、穗長、一級枝梗數(shù)、二級枝梗數(shù)、主穗粒數(shù)，千粒質(zhì)量和分蘗數(shù)。以ggdd基因型為參照，對農(nóng)藝性狀進(jìn)行單因素方差分析；總體上，無論日長如何，Ghd7、DTH8以及雙基因組合都能不同程度地促進(jìn)株高、穗長、一級枝梗數(shù)、二級枝梗數(shù)、主穗粒數(shù)和千粒質(zhì)量，但對分蘗數(shù)沒有顯著影響(表5)。

表5 4種純合型株系自然長日、自然短日下的農(nóng)藝性狀1)Table 5 Agronomic traits of four isogenic lines under natural long day and natural short day conditions

以ggdd為參照，我們計(jì)算了Ghd7、DTH8及組合對農(nóng)藝性狀的貢獻(xiàn)度(圖6a、6b)。ggDD材料相比ggdd，在自然長日下，DTH8對二級枝梗數(shù)和主穗粒數(shù)的促進(jìn)作用最強(qiáng)，貢獻(xiàn)度分別為59.11%和40.93%；在自然短日下，DTH8對二級枝梗數(shù)的促進(jìn)作用最強(qiáng)，貢獻(xiàn)度為24.61%。雖然DTH8對抽穗的作用較弱，但其單基因長、短日下均能顯著地促進(jìn)二級枝梗數(shù)。GGdd材料相比ggdd，在自然長日下，Ghd7對二級枝梗數(shù)和主穗粒數(shù)的促進(jìn)作用最強(qiáng)，貢獻(xiàn)度分別為84.19%和63.98%；在自然短日下，Ghd7對主穗粒數(shù)的促進(jìn)作用最強(qiáng)，貢獻(xiàn)度為21.56%。DTH8和Ghd7單基因?qū)r(nóng)藝性狀的作用在長日下明顯高于短日下。在長、短日下，Ghd7和DTH8組合對抽穗期的調(diào)控存在更高階的互作，對株高、一級枝梗數(shù)、主穗粒數(shù)也有明顯的增強(qiáng)效應(yīng)，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中有重要的應(yīng)用價(jià)值。

圖6 自然長日 (a)和自然短日 (b)下 Ghd7、DTH8及組合對抽穗期和農(nóng)藝性狀的貢獻(xiàn)度Fig. 6 Contribution degree of Ghd7,DTH8 and their combination on heading date and agronomic traits under natural long day (a) and natural short day(b) conditions

3 討論與結(jié)論

本研究培育了hd1/prr37背景下Ghd7、DTH8雙基因分離的群體，深入揭示了無論日長如何Ghd7和DTH8單基因均能抑制抽穗，Ghd7抑制抽穗更強(qiáng)。Ghd7和DTH8之間存在遺傳互作，二者更顯著抑制Ehd1-Hd3a/RFT1通路，延遲抽穗。二者的關(guān)系在Hd1/OsPRR37背景下同樣如此[10,27-28]，表明它們的互作非常穩(wěn)定，不受遺傳背景和日長的影響。酵母雙雜交以及pull-down驗(yàn)證了Ghd7和DTH8存在分子互作，通過BiFC證明了互作發(fā)生在細(xì)胞核[29]。研究還發(fā)現(xiàn)，DTH8可以與NF-YC2形成異源二聚體，3個(gè)CCT亞家族的Ghd7、PRR37、Hd1分別可以與DTH8/OsNF-YC2形成三元復(fù)合物，進(jìn)而能夠結(jié)合特定的DNA序列[30]。因此，在充分的遺傳研究的基礎(chǔ)上，可以更為深入地研究Ghd7/DTH8復(fù)合體作用的分子機(jī)制，包括復(fù)合物的其他組分，如直接結(jié)合的DNA序列和調(diào)控的下游基因等。

在一定范圍內(nèi)，水稻抽穗期和產(chǎn)量呈現(xiàn)顯著正相關(guān)，抽穗期越長，積累的生物量越多，產(chǎn)量越高[21,31]。有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)DTH8單基因微弱抑制抽穗，卻能顯著增加二級枝梗數(shù)和主穗粒數(shù)。在長、短日下Ghd7和DTH8的組合使抽穗期延長，能最大限度地利用光熱資源，積累和轉(zhuǎn)運(yùn)更多的光合產(chǎn)物，明顯增加水稻株高、一級枝梗數(shù)、主穗粒數(shù)等農(nóng)藝性狀。盡管長日下Ghd7和DTH8雙基因純合抽穗期較長，但對雜交稻來說，雙基因?yàn)殡s合狀態(tài)，抽穗相對純合型早一些，并且利用了二者對農(nóng)藝性狀的協(xié)同促進(jìn)作用，因此具有重要的應(yīng)用價(jià)值。這同時(shí)表明抽穗期基因以及不同組合調(diào)控了水稻整體的生長發(fā)育，但它們是直接在穗部發(fā)揮作用，還是通過調(diào)控成花素間接調(diào)控農(nóng)藝性狀及產(chǎn)量，相關(guān)的機(jī)制值得深入研究。