宮頸疾病患者p16/Ki-67表達(dá)狀況及其與HPV感染的相關(guān)性

崔焱，張瑜英，潘琳

(北京和平里醫(yī)院婦科，北京 100013)

宮頸病變主要分為宮頸癌和宮頸癌前病變，其中低度鱗狀上皮內(nèi)病變(LSIL)通常在宮頸癌前發(fā)生，在宮頸癌防治階段發(fā)揮重要作用[1-2]。目前，針對(duì)LSIL的診斷與分級(jí)仍然受多種主觀因素影響，對(duì)臨床治療造成嚴(yán)重影響[3-4]。因此，尋找一種準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法，以判斷LSIL及預(yù)測(cè)其轉(zhuǎn)歸進(jìn)展成為當(dāng)前研究重點(diǎn)。早期臨床主要依靠液基細(xì)胞學(xué)檢查、HPV-DNA檢查等評(píng)估診斷宮頸病變情況，但其具有操作復(fù)雜、檢查費(fèi)用高等缺點(diǎn)，臨床認(rèn)可度相對(duì)較低[5]。近期有研究[6-7]表明，p16/Ki-67雙染陽(yáng)性與宮頸病變存在密切關(guān)系，可準(zhǔn)確診斷LSIL病變程度，在臨床具有重要價(jià)值。P16屬于抑癌基因，可直接調(diào)控細(xì)胞周期，同時(shí)Ki-67是增殖細(xì)胞標(biāo)記物，兩者聯(lián)合使用可在早期鑒別診斷宮頸病變。本研究旨在探討宮頸疾病患者p16/Ki-67表達(dá)狀況及其與HPV感染的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年12月至2020年5月北京和平里醫(yī)院收治的150例宮頸疾病患者為研究對(duì)象，按照病理類型分為宮頸癌組(n=20)、高度鱗狀上皮內(nèi)病變(HSIL)組(n=35)、低度鱗狀上皮內(nèi)病變(LSIL)組(n=45例)和宮頸炎組(n=50)。宮頸癌組中，年齡36～62歲，平均(45.11±2.01)歲；病程1～3年，平均(1.91±0.52)年。HSIL組中，年齡38～64歲，平均(46.02±2.21)歲；病程1～2.5年，平均(1.50±0.66)年。LSIL組中，年齡37～67歲，平均(45.99±2.08)歲；病程1～4年，平均(1.99±0.74)年。宮頸炎組中，年齡35～66歲，平均(44.98±2.11)歲；病程1～3年，平均(1.87±0.69)年。本研究經(jīng)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者及家屬知情并簽署知情同意書(shū)。四組患者一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)伴有宮頸疾病者；(2)年齡均>18周歲；(3)病歷資料均完整且有隨訪記錄。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)術(shù)前接受放化療或免疫治療；(2)合并免疫系統(tǒng)缺陷疾病；(3)存在急性婦科炎癥者。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞學(xué)p16/Ki-67雙染檢測(cè) 將細(xì)胞薄片固定于95%乙醇中，浸潤(rùn)30 min后流水沖洗1 min；使用DAB顯色試劑盒(福建邁新生物有限公司)在95 ℃下對(duì)細(xì)胞薄片進(jìn)行EDTA 8.0熱修復(fù)；20 min后滴加過(guò)氧化物酶100 μL，室溫孵育10 min；滴加p16/Ki-67抗體(上海信裕生物科技有限公司/博士得生物有限公司)一抗100 μL，室溫孵育60 min，滴加酶標(biāo)二抗100 μL，室溫孵育15 min；滴加DAB顯色劑100 μL，室溫孵育5 min；使用蘇木精襯染細(xì)胞核，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。

1.2.2 p16/Ki-67雙染結(jié)果判斷 在微鏡下觀察，若≥1個(gè)細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)紅色，且該細(xì)胞核呈紅褐色或黃棕色為陽(yáng)性；若≥1個(gè)細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核單獨(dú)顯色或均不顯色為陰性[8]。

1.2.3 隨訪觀察 對(duì)LSIL患者進(jìn)行隨訪，1次/半年，共兩次，若發(fā)現(xiàn)異常則進(jìn)行病理活檢。LSIL癥狀未消退，且持續(xù)出現(xiàn)HSIL病變?yōu)檫M(jìn)展。

1.3 觀察指標(biāo)

(1)不同宮頸組織學(xué)診斷結(jié)果中P16/Ki67雙染陽(yáng)性率；(2)不同宮頸組織學(xué)診斷結(jié)果中HPV感染率；(3)p16/Ki-67陽(yáng)性表達(dá)與HPV感染的關(guān)系；(4)p16/Ki-67雙染檢測(cè)結(jié)果與LSIL進(jìn)展的關(guān)系。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析與處理。計(jì)數(shù)資料以[n(%)]表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)性分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同宮頸組織學(xué)診斷結(jié)果中P16/Ki67雙染陽(yáng)性比較

宮頸癌組、HSIL組、LSIL組和宮頸炎組的P16/Ki67雙染陽(yáng)性率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中宮頸炎組低于宮頸癌組、HSIL組及LSIL組(P<0.05)；LSIL組低于宮頸癌組及HSIL組(P<0.05)；HSIL組與宮頸癌組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 不同宮頸組織學(xué)診斷結(jié)果中P16/Ki67雙染陽(yáng)性比較[n(%)]

2.2 不同宮頸組織學(xué)診斷結(jié)果中HPV感染率比較

宮頸癌組、HSIL組、LSIL組和宮頸炎組的HPV感染率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中宮頸炎組低于宮頸癌組、HSIL組及LSIL組(P<0.05)；LSIL組低于宮頸癌組及HSIL組(P<0.05)；HSIL組與宮頸癌組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 不同宮頸組織學(xué)診斷結(jié)果中HPV感染率比較[n(%)]

2.3 p16/Ki-67陽(yáng)性表達(dá)與HPV感染的關(guān)系

相關(guān)性分析顯示，p16/Ki-67陽(yáng)性表達(dá)與HPV感染、宮頸病變呈正相關(guān)(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 p16/Ki-67陽(yáng)性表達(dá)與HPV感染、宮頸病變的關(guān)系

2.4 p16/Ki-67雙染檢測(cè)結(jié)果與LSIL進(jìn)展的關(guān)系

p16/Ki-67雙染陽(yáng)性患者病變發(fā)生率高于雙染陰性患者(35.7%vs.6.5%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.287，P=0.012)。

3 討論

宮頸癌在女性惡性腫瘤中較為常見(jiàn)，其性生活過(guò)早、多產(chǎn)、HPV感染等均可誘發(fā)[9-10]。臨床顯示，宮頸癌的病變期相對(duì)較長(zhǎng)，且大多數(shù)宮頸癌都是有LSIL演變而來(lái)，嚴(yán)重威脅患者的生命安全[11]。因此，宮頸癌病變前的早期診斷對(duì)宮頸癌的預(yù)防和治療發(fā)揮關(guān)鍵作用。目前，臨床多采用細(xì)胞學(xué)檢測(cè)、HPV-DNA檢測(cè)等傳統(tǒng)方法評(píng)估診斷疾病，但敏感度不足，可重復(fù)性較差，極易發(fā)生漏診或誤診情況，難以大范圍推廣[12-14]。近年來(lái)，腫瘤標(biāo)志物在鑒別診斷腫瘤中發(fā)揮重要作用，主要以p16和Ki-67為代表[15]。P16作為一種調(diào)控基因可有效控制細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期進(jìn)展，而Ki-67作為一種抑癌基因可直接調(diào)控細(xì)胞周期，與p16相輔相成[16-17]。因此，P16/Ki67雙染檢測(cè)可有效評(píng)估宮頸病變并預(yù)測(cè)LSIL轉(zhuǎn)歸進(jìn)展，臨床應(yīng)用較為廣泛。

本研究顯示，宮頸癌、LSIL、HSIL患者的P16/Ki67雙染陽(yáng)性率高于宮頸炎患者(P<0.05)，且隨著病變程度的加重，其P16/Ki67雙染陽(yáng)性率也不斷增加(P<0.05)，原因是p16屬于一種蛋白激酶抑制劑，在對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控方面起著關(guān)鍵作用[18]。有研究表明，p16與HPV-DNA的E7癌蛋白介導(dǎo)的視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白的功能性失活存在緊密的聯(lián)系，因此，P16可準(zhǔn)確評(píng)估致癌性HPV-DNA感染中的過(guò)度表達(dá)情況，并進(jìn)一步維持細(xì)胞周期的穩(wěn)定性[19]。而Ki-67作為一種核抗原在增殖期細(xì)胞中表達(dá)較為強(qiáng)烈，可有效提高細(xì)胞增殖的活性，進(jìn)而對(duì)腫瘤的轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)、發(fā)生等生理過(guò)程進(jìn)行更清晰的反映[20]。相關(guān)研究[21]發(fā)現(xiàn)，p16過(guò)表達(dá)是使細(xì)胞周期出現(xiàn)阻滯的主要誘因，而Ki-67屬于新型腫瘤標(biāo)志物可有效對(duì)HPV轉(zhuǎn)化感染介導(dǎo)的細(xì)胞周期進(jìn)行調(diào)控。通常以同一細(xì)胞中P16/Ki67的雙陽(yáng)性作為判斷HVP感染的標(biāo)志物。而且P16/Ki67雙陽(yáng)性也可作為評(píng)估宮頸癌、LSIL、HSIL、宮頸炎患者是否存在HPV感染情況[22-23]。本研究顯示，宮頸癌、LSIL、HSIL患者的HPV感染率高于宮頸炎患者(P<0.05)，且HPV感染率隨著宮頸病變程度的加重而增加(P<0.05)，同P16/Ki67雙染陽(yáng)性率與宮頸病變程度的關(guān)系具有一致性。

為進(jìn)一步探究p16/Ki-67雙染檢測(cè)結(jié)果與LSIL進(jìn)展的關(guān)系，本研究對(duì)45例LSIL患者定期進(jìn)行隨訪，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，p16/Ki-67雙染陽(yáng)性患者病變進(jìn)展率為35.7%，是p16/Ki-67雙染陰性患者的5.49倍，說(shuō)明p16/Ki-67雙染檢測(cè)對(duì)LSIL的轉(zhuǎn)歸預(yù)測(cè)具有一定的臨床意義，可幫助臨床避免發(fā)生過(guò)度治療的情況，杜絕漏診、誤診的出現(xiàn)[24]。相關(guān)性結(jié)果[25]表明，p16/Ki-67陽(yáng)性表達(dá)與HPV感染呈正相關(guān)，說(shuō)明HPV感染檢測(cè)聯(lián)合p16/Ki-67雙染檢測(cè)可明顯提高診斷的靈敏度和特異度，進(jìn)而提高LSIL、HSIL、早期宮頸癌的診斷率。

綜上所述，p16/Ki-67表達(dá)與HPV感染呈正相關(guān)，臨床應(yīng)用p16/Ki-67雙染檢測(cè)可有效評(píng)估宮頸病變，預(yù)測(cè)LSIL轉(zhuǎn)歸。