妃子笑荔枝LcSAI 啟動(dòng)子的克隆及其生物信息學(xué)分析

董 晨，李金枝，鄭雪文，王 弋，李偉才

（中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院南亞熱帶作物研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部熱帶果樹(shù)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江 524091）

【研究意義】荔枝（Litchi chinensisSonn.）是嶺南名貴水果，有“嶺南果王”之美譽(yù)。荔枝是典型的糖直接積累型果實(shí)，含糖量是優(yōu)質(zhì)荔枝品種的重要指標(biāo)之一。不同荔枝品種積累的主要糖分不同，如妃子笑和黑葉荔枝以積累還原糖為主，無(wú)核荔和糯米糍荔枝則以積累蔗糖為主［1］。不同品種荔枝的糖分構(gòu)成不同，其實(shí)質(zhì)是不同酶系統(tǒng)調(diào)控的結(jié)果，而酶系統(tǒng)及其活性與基因表達(dá)相關(guān)［2］。蔗糖代謝相關(guān)酶活性與蔗糖積累密切相關(guān)，而轉(zhuǎn)化酶是調(diào)節(jié)蔗糖代謝的關(guān)鍵酶之一，轉(zhuǎn)化酶將蔗糖分解為還原糖和果糖，在蔗糖的轉(zhuǎn)運(yùn)、貯藏和分配中起重要作用［3］。根據(jù)最適pH 值，轉(zhuǎn)化酶可分酸性轉(zhuǎn)化酶（AI）和堿性轉(zhuǎn)化酶（NI）；根據(jù)定位，酸性轉(zhuǎn)化酶又分為可溶性酸性轉(zhuǎn)化酶（SAI）和細(xì)胞壁酸性轉(zhuǎn)化酶（CWAI）［4］?？扇苄运嵝赞D(zhuǎn)化酶是一種液泡酶，能調(diào)控液泡的庫(kù)活力，對(duì)外界脅迫、激素和細(xì)胞伸長(zhǎng)等都有一定作用［5-9］；細(xì)胞壁酸性轉(zhuǎn)化酶主要參與韌皮部質(zhì)外體卸載時(shí)蔗糖的分解，以保持庫(kù)-源之間蔗糖的濃度梯度，在調(diào)控植物衰老及果實(shí)發(fā)育中起重要作用［10］。

【前人研究進(jìn)展】酸性轉(zhuǎn)化酶能顯著調(diào)控果實(shí)成熟期的糖組分。如在香蕉果實(shí)成熟過(guò)程中酸性轉(zhuǎn)化酶能顯著調(diào)節(jié)蔗糖與還原糖的比值［11］；菠蘿蜜果實(shí)發(fā)育過(guò)程中，隨著轉(zhuǎn)化酶活性增強(qiáng)，蔗糖含量隨之減少，且不同品種中轉(zhuǎn)化酶活性存在差異［12-13］。在葡萄、荔枝、甘蔗等作物中，轉(zhuǎn)化酶基因表達(dá)量越高，轉(zhuǎn)化酶活性越高，伴隨著蔗糖含量越少且還原糖含量升高，反之亦然［14-15］。研究表明，以積累蔗糖為主的糯米糍等荔枝在果實(shí)成熟過(guò)程中幾乎檢測(cè)不到酸性轉(zhuǎn)化酶活性，而積累還原糖為主的妃子笑等則保持較高的酸性轉(zhuǎn)化酶活性［16］。還原糖積累型果實(shí)酸性轉(zhuǎn)化酶基因的表達(dá)量顯著上調(diào)，而在蔗糖積累型果實(shí)中該基因表達(dá)量很低?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】基因表達(dá)由上游調(diào)控因子調(diào)節(jié)，啟動(dòng)子決定特定基因的表達(dá)。因此，克隆并分析酸性轉(zhuǎn)化酶基因的啟動(dòng)子，對(duì)深入了解荔枝不同糖積累類(lèi)型的調(diào)控機(jī)理具有重要意義。但目前尚未見(jiàn)有關(guān)荔枝酸性轉(zhuǎn)化酶基因LcSAI啟動(dòng)子的相關(guān)報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究通過(guò)克隆荔枝LcSAI啟動(dòng)子，利用生物信息學(xué)分析工具對(duì)LcSAI啟動(dòng)子中可能的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)、順式作用元件、CpG 島等進(jìn)行分析，以期為今后深入研究荔枝生產(chǎn)中的品質(zhì)調(diào)控提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試?yán)笾ζ贩N為妃子笑，2021 年5 月下旬采自中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院南亞熱帶作物研究所荔枝種植園，取成熟妃子笑果肉作為基因組DNA 的提取材料。

DNA 提取試劑盒Easypure Plant Genomic DNA Kit、pEASY-T1 載體和大腸桿菌Trans1-T1 感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)有限公司。所用儀器主要有Eppendorf 離心機(jī)、Germany 超微量分光光度計(jì)、Thermo Fisher Scientific PCR 儀。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA 提取 按照DNA 提取試劑盒說(shuō)明書(shū)的方法提取荔枝基因組DNA。取2 μL 得到的DNA 檢測(cè)質(zhì)量和濃度，樣品符合要求后放于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計(jì) 基于荔枝基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，查找LcSAI基因上游2000bp的片段，設(shè)計(jì)上、下游引物，引物序列LcSAIpFw：5′TCTTCAACCTTGAACCATGACCT3′，LcSAIpRe：5′CCGGCAAGGGAGTGTAGTAT3′，引物委托廣州艾基生物有限公司合成。

1.2.3 LcSAI 啟動(dòng)子克隆 以妃子笑DNA為模板，PCR 擴(kuò)增LcSAI啟動(dòng)子序列。PCR 反應(yīng)體系：2×PCR buffer 25 μL，dNTP（2 mmol/L）10 μL，上下游引物各2μL，DNA模板1μL，KOD 酶1μL，用ddH2O 補(bǔ)足50 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃ 2min，98 ℃ 10 s、68 ℃ 2.5 min、68 ℃7 min，35 個(gè)循環(huán)。經(jīng)0.5%TBE 瓊脂凝膠電泳，獲得特異性目的條帶，進(jìn)行切膠回收，將回收產(chǎn)物連接至pEASY-T1 載體，轉(zhuǎn)入大腸桿菌Trans1-T1 感受態(tài)細(xì)胞，于37 ℃培養(yǎng)箱過(guò)夜培養(yǎng)，隨機(jī)挑取15 個(gè)單菌落進(jìn)行菌落PCR 鑒定，挑取3 個(gè)陽(yáng)性克隆菌液送至廣州艾基生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.2.4LcSAI啟動(dòng)子生物信息學(xué)分析 利用在線(xiàn)軟件BDGP（http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html）預(yù)測(cè)LcSAI啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)及可能的核心啟動(dòng)子區(qū)域；啟動(dòng)子順式作用元件利用在線(xiàn)分析工具PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）預(yù)測(cè)；啟動(dòng)子CpG 島利用在線(xiàn)軟件CpG Island Searcher（http://www.cpgislands.com）預(yù)測(cè)，預(yù)測(cè)時(shí)用1 個(gè)長(zhǎng)度為200 bp 的窗口移過(guò)序列，每次移1 個(gè)堿基對(duì)，計(jì)算Y 值（實(shí)際值/期望值），CpG 島定義為Y＞0.6 且GC 含量＞50%的200 bp 序列區(qū)域。

2 結(jié)果與分析

2.1 LcSAI 基因啟動(dòng)子的PCR 擴(kuò)增

以妃子笑基因組DNA 為模板，LcSAIpFw、LcSAIpRe 為引物，擴(kuò)增出長(zhǎng)約1 000～2 000 bp 的單一條帶，與預(yù)測(cè)目的條帶大小吻合（圖1）。將PCR 產(chǎn)物純化回收后連接至pEASY-T1 載體，轉(zhuǎn)入大腸桿菌Trans1-T1 感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)后進(jìn)行菌液PCR 鑒定（圖2），陽(yáng)性克隆菌液經(jīng)測(cè)序，結(jié)果顯示獲得1 514 bpLcSAI基因啟動(dòng)子序列。

圖1 LcSAI 基因啟動(dòng)子克隆結(jié)果Fig.1 Cloning of LcSAI gene promoter

圖2 菌液PCR 檢測(cè)結(jié)果Fig.2 PCR detection of bacterial liquid

2.2 LcSAI 基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果

利用在線(xiàn)軟件BDGP 對(duì)LcSAI基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，LcSAI可能存在3 處核心啟動(dòng)子區(qū)域，分別位于276～326、458～508、1 183～1 233 bp，分值分別為0.94、0.82 和0.83，可能的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)分別為C、A、A（表1）。根據(jù)結(jié)果可推測(cè)位于276～326 bp 的序列很可能就是該基因真正的核心啟動(dòng)子區(qū)域，轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)為位于第316 bp 的C。

表1 LcSAI 基因啟動(dòng)子核心啟動(dòng)子區(qū)域Table 1 Core promoter region of LcSAI gene promoter

2.3 LcSAI 基因啟動(dòng)子順式作用元件預(yù)測(cè)結(jié)果

利用在線(xiàn)軟件PlantCARE 對(duì)LcSAI基因啟動(dòng)子順式作用元件進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果（圖3）顯示，LcSAI啟動(dòng)子序列除了存在大量的啟動(dòng)子核心元件如TATA-box 和增強(qiáng)元件CAAT-box 外，還存在多種特殊順式元件，如光響應(yīng)順式元件、植物激素應(yīng)答元件、MYB 結(jié)合位點(diǎn)、MYC 結(jié)合位點(diǎn)及一些未知功能元件。

圖3 LcSAI 基因啟動(dòng)子序列及其關(guān)鍵元件Fig.3 Promoter sequence of LcSAI gene and its key elements

由表2可知，LcSAI啟動(dòng)子中含有35 個(gè)TATA-box 核心啟動(dòng)元件、38 個(gè)CAAT-box 增強(qiáng)元件，多種光響應(yīng)元件和植物激素應(yīng)答元件。光響應(yīng)元件有5 種，分別為3-AF1 binding site、ATCT-motif、Box 4、G-box 和TCT-motif，其 中G-box 數(shù)量最多、有8 個(gè)，ATCT-motif 有4 個(gè)，Box 4 有2 個(gè)，3-AF1 binding site 和TCT-motif 各1 個(gè)。在植物激素響應(yīng)元件中，LcSAI啟動(dòng)子含有茉莉酸甲酯響應(yīng)元件CGTCA-motif 和TGACGmotif 各2 個(gè)，赤霉素響應(yīng)元件TATC-box 和水楊酸響應(yīng)元件TCA-element 各1 個(gè)，脫落酸響應(yīng)元件 ABRE 有5 個(gè)。

表2 LcSAI 啟動(dòng)子序列所含順式作用元件Table 2 Cis-acting elements in LcSAI promoter sequence

2.4 LcSAI 基因啟動(dòng)子CpG 島預(yù)測(cè)結(jié)果

CpG 島作為表觀調(diào)控的重要組成部分，在基因調(diào)控方面起重要作用。通過(guò)在線(xiàn)CpG 島預(yù)測(cè)軟件CpG Island Searcher 對(duì)LcSAI啟動(dòng)子序列進(jìn)行CpG 島預(yù)測(cè)。預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，在LcSAI基因啟動(dòng)子區(qū)沒(méi)有符合限定條件的CpG 島，這可能與獲得的序列長(zhǎng)度有關(guān)。

3 討論

可溶性酸性轉(zhuǎn)化酶定位在植物體液泡中，催化蔗糖水解為己糖，在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用。以積累己糖為主的葡萄果實(shí)中，在果實(shí)發(fā)育全過(guò)程中酸性轉(zhuǎn)化酶活力均維持較高水平［17］?；虮磉_(dá)水平是由基因上游的啟動(dòng)子順式作用元件及轉(zhuǎn)錄因子共同調(diào)控。啟動(dòng)子中包括多種順式作用元件，如上游啟動(dòng)子元件、核心啟動(dòng)子元件、特殊啟動(dòng)子元件、遠(yuǎn)端上游元件等。其中在植物逆境脅迫誘導(dǎo)基因表達(dá)起關(guān)鍵作用為特殊啟動(dòng)子元件［18］。本研究通過(guò)克隆妃子笑酸性轉(zhuǎn)化酶LcSAI啟動(dòng)子，采用生物信息學(xué)方法對(duì)LcSAI啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)、順式作用元件及CpG 島進(jìn)行在線(xiàn)預(yù)測(cè)，分析結(jié)果表明LcSAI啟動(dòng)子片段轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)為在核心啟動(dòng)子區(qū)域第316 bp 的C。LcSAI啟動(dòng)子區(qū)沒(méi)有預(yù)測(cè)到符合限定條件的CpG 島，可能與獲得序列長(zhǎng)度不同有關(guān)。

對(duì)啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)和順式元件的探索不僅有助于更好地調(diào)節(jié)單個(gè)或多個(gè)異源基因響應(yīng)化學(xué)、生物以及環(huán)境因素刺激，而且為研究者改良作物提供了新思路，從而開(kāi)啟了設(shè)計(jì)啟動(dòng)子的新領(lǐng)域［19］。?？∑娴龋?0］對(duì)甘蔗可溶性酸性轉(zhuǎn)化酶基因及部分啟動(dòng)子進(jìn)行克隆和序列分析發(fā)現(xiàn)，SoSAI1基因啟動(dòng)子在甘蔗生長(zhǎng)發(fā)育和蔗糖積累并在應(yīng)對(duì)環(huán)境脅迫中發(fā)揮作用。本研究表明，荔枝LcSAI啟動(dòng)子序列包含核心啟動(dòng)元件TATA-box 35 個(gè)和CAAT-box 38 個(gè)。其中核心啟動(dòng)元件TATA-box有介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄的作用，普遍存在于真核生物啟動(dòng)子上，含有TATA-box 的基因?qū)D(zhuǎn)錄調(diào)控比較敏感［21］。核心啟動(dòng)元件CAAT-box 可增強(qiáng)啟動(dòng)子的強(qiáng)度，原因是因?yàn)镃AAT-box 對(duì)轉(zhuǎn)錄起始的頻率具有一定影響。此外，妃子笑LcSAI的啟動(dòng)子中還包含多種特殊啟動(dòng)子元件，如光響應(yīng)元件（3-AF1 binding site、ATCT-motif、Box 4、G-box、TCT-motif）和植物激素響應(yīng)元件（ABRE 脫落酸響應(yīng)元件、CGTCA-motif、TGACG-motif 茉莉酸甲酯響應(yīng)元件、TATC-box 赤霉素響應(yīng)元件、TCAelement 水楊酸響應(yīng)元件）。后續(xù)將對(duì)植物激素應(yīng)答元件與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合調(diào)控LcSAI基因的表達(dá)進(jìn)行深入研究。

4 結(jié)論

本研究以妃子笑荔枝為材料，克隆得到1 514 bpLcSAI啟動(dòng)子片段，LcSAI啟動(dòng)子片段轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)可能存在3 處核心啟動(dòng)子區(qū)域。根據(jù)得分，位于276～326 bp 的序列很可能為L(zhǎng)cSAI啟動(dòng)子真正的核心啟動(dòng)子區(qū)域，轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)為位于第316 bp 的C。LcSAI基因的啟動(dòng)子序列包括35 個(gè)TATA-box、38 個(gè)CAAT-box 核心啟動(dòng)元件以及多種特殊啟動(dòng)子元件，如多種光響應(yīng)元件和植物激素響應(yīng)元件。LcSAI基因啟動(dòng)子共含有近30 種順式作用元件，意味著LcSAI具有復(fù)雜的表達(dá)調(diào)控機(jī)制，順式作用元件與相應(yīng)的反式作用因子相互作用發(fā)揮生物學(xué)功能。