低魚粉飼料中添加?；撬釋?duì)許氏平鲉腸道結(jié)構(gòu)、免疫及抗氧化能力的影響

■衛(wèi)力博 彭祖想 嚴(yán) 林 高 欣 翟浩杰 王 偉，2 任同軍，2 韓雨哲，2*

（1.大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，遼寧 大連 116023；2.遼寧省北方魚類應(yīng)用生物學(xué)與增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116023）

許氏平鲉又名黑鲪、黑寨，屬近岸底層肉食性魚類，具有抗病性強(qiáng)、營(yíng)養(yǎng)豐富和生長(zhǎng)快速等優(yōu)點(diǎn)，是我國(guó)北方沿海網(wǎng)箱養(yǎng)殖的重要經(jīng)濟(jì)魚類[1-2]。隨著我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖規(guī)模逐漸擴(kuò)大，許氏平鲉養(yǎng)殖產(chǎn)量逐步上升，對(duì)飼料的需求也不斷增加，魚粉作為水產(chǎn)飼料中最重要的蛋白源，由于資源有限，價(jià)格上漲等原因已經(jīng)嚴(yán)重影響了其養(yǎng)殖效益[3]。為了節(jié)約飼料成本，通常以成本低廉且資源豐富的植物蛋白源（豆粕、菜粕、花生粕等）進(jìn)行魚粉替代，但植物蛋白源除了存在蛋白酶抑制劑、硫代葡萄糖苷等大量?jī)?nèi)源性抗?fàn)I養(yǎng)因子外，還缺乏某些在魚類生長(zhǎng)過(guò)程中所需的重要氨基酸，如?；撬帷⒌鞍彼岬萚4-5]。

?；撬?，化學(xué)名稱2-氨基乙磺酸，是含硫氨基酸代謝的最終產(chǎn)物，作為動(dòng)物體含量最豐富的游離氨基酸，具有誘食、促生長(zhǎng)、參與膽汁酸調(diào)節(jié)與滲透調(diào)節(jié)、提高免疫和抗氧化能力等功能[6-8]。魚類具有一定的牛磺酸合成能力，但普遍較弱，無(wú)法滿足自身需求，特別是肉食性魚類[9]。目前研究已表明，通過(guò)在低魚粉飼料中添加?；撬峥筛纳浦参锏鞍自磳?dǎo)致的生長(zhǎng)緩慢和綠肝綜合征等現(xiàn)象，起到節(jié)約魚粉的效果。Takagiet等[10-11]報(bào)道在低魚粉高植物蛋白飼料中添加?；撬?，能夠顯著改善鲉魚和紅鯛的生長(zhǎng)性能并降低了綠肝綜合征的發(fā)病率。劉興旺等[12]研究表明，在植物蛋白替代魚粉條件下補(bǔ)充牛磺酸可促進(jìn)大菱鲆生長(zhǎng)，并緩解植物蛋白所導(dǎo)致的脂肪代謝異?，F(xiàn)象。目前許氏平鲉飼料研究主要集中在動(dòng)植物蛋白源替代不同比例魚粉上[13-15]，而關(guān)于補(bǔ)充功能性添加劑來(lái)提高低魚粉飼料利用率和緩解低魚粉飼料所帶來(lái)的負(fù)面效果上的研究甚少[16]。本試驗(yàn)通過(guò)在低魚粉飼料中添加牛磺酸，探究其對(duì)許氏平鲉腸道結(jié)構(gòu)、免疫和抗氧化能力的影響，以期為許氏平鲉低魚粉飼料中牛磺酸的使用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)用魚

試驗(yàn)用許氏平鲉購(gòu)自大連飛鯤水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司，選取規(guī)格均一、健康無(wú)傷的平均體質(zhì)量為（36.25±0.04）g 的許氏平鲉120 尾，暫養(yǎng)1 周以適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室養(yǎng)殖條件，期間投喂對(duì)照組基礎(chǔ)飼料。

1.2 試驗(yàn)飼料

以豆粕、魚粉為主要蛋白源，魚油為主要脂肪源，配制?；撬崴椒謩e為0（T1 組，對(duì)照組）、0.8%（T2 組）、1.6%（T3 組）、2.4%（T4 組）、3.2%（T5 組）的5種等能低魚粉飼料。?；撬幔ê?9%）購(gòu)自湖北遠(yuǎn)大生命科學(xué)與技術(shù)有限責(zé)任公司。甘氨酸的含量隨飼料中?；撬岷康脑黾佣鴾p少以保證各試驗(yàn)飼料氮的含量一致。所有飼料原料粉碎過(guò)60 目篩，原料按照配方進(jìn)行逐級(jí)混勻，期間添加適量的水使其黏合度適宜，經(jīng)制粒機(jī)制成2 mm 顆粒飼料，于40 ℃烘箱中烘至水分為10%左右，晾至室溫后存于密封袋中，于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?，試?yàn)飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1。

表1 試驗(yàn)飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)，%）

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與養(yǎng)殖管理

試驗(yàn)開始前，停食24 h，將試驗(yàn)用魚隨機(jī)分成5組，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)8尾魚，共計(jì)15個(gè)水槽，置于循環(huán)水設(shè)施中養(yǎng)殖。養(yǎng)殖周期為56 d，每天8：00 和17：00 投喂試驗(yàn)飼料至表觀飽食，每日18：30 進(jìn)行換水，換水量為總水體的1/3。養(yǎng)殖期間，24 h 連續(xù)充氣，控制水溫17～19 ℃，溶解氧濃度大于6 mg/L，pH 7.3～7.8。

1.4 樣品采集

試驗(yàn)結(jié)束后，所有魚[平均終末體質(zhì)量（49.37±1.26）g]進(jìn)行禁食24 h處理，每個(gè)養(yǎng)殖水槽隨機(jī)選3尾魚取1 cm 中腸，用4%多聚甲醛固定，用于制作腸道組織切片；剩余試驗(yàn)魚截取完整前腸和肝臟置于液氮中速凍，后轉(zhuǎn)移至超低溫冰箱（-80 ℃）中保存進(jìn)行酶活性測(cè)定。

1.5 酶活性指標(biāo)測(cè)定

腸道消化酶包括淀粉酶（AMS）、脂肪酶（LPS）和蛋白酶（PRO），肝臟免疫酶包括堿性磷酸酶（AKP）、酸性磷酸酶（ACP）和溶菌酶（LZM），肝臟抗氧化指標(biāo)包括過(guò)氧化氫酶（CAT）、總超氧化物歧化酶（T-SOD）和丙二醛（MDA），上述指標(biāo)測(cè)定試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所有限公司，并參照說(shuō)明書進(jìn)行測(cè)定。

1.6 腸道組織形態(tài)觀察

腸道樣品經(jīng)乙醇脫水后置于二甲苯中透明，隨后進(jìn)行石蠟包埋處理，使用切片機(jī)橫向間隔切片，而后進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色，中性樹膠封片。使用光學(xué)顯微鏡拍照后用圖像軟件S-Viewer 進(jìn)行觀察測(cè)量。

1.7 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（Mean±SE）”表示。使用SPSS 21.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（one-way ANOVA），采用Duncan’s 法進(jìn)行組間差異分析，設(shè)置差異顯著為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 低魚粉飼料中添加?；撬釋?duì)許氏平鲉腸道消化酶活性的影響（見表2）

由表2可知，T2、T3和T4組淀粉酶和脂肪酶均顯著高于對(duì)照組（T1組）（P<0.05），T5組與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異（P>0.05）。T2組腸道蛋白酶活性顯著高于其他各組（P<0.05），之后隨著牛磺酸添加量的增加，蛋白酶活性有所下降。

表2 低魚粉飼料中添加?；撬釋?duì)許氏平鲉腸道消化酶活性的影響（n=3，U/mg prot.）

2.2 低魚粉飼料中添加?；撬釋?duì)許氏平鲉腸道結(jié)構(gòu)的影響（見圖1、表3）

由圖1可知，對(duì)照組許氏平鲉中腸皺襞高度較低，皺襞破損嚴(yán)重，而?；撬崽砑咏M許氏平鲉腸道皺襞無(wú)明顯損傷脫落情況，皺襞整齊排列，由表3 可知，T2、T3組皺襞高度和皺襞寬度顯著高于對(duì)照組（P<0.05）。

表3 低魚粉飼料中添加?；撬釋?duì)許氏平鲉腸道形態(tài)的影響（n=3，μm）

圖1 許氏平鲉腸道組織結(jié)構(gòu)

2.3 低魚粉飼料中添加?；撬釋?duì)許氏平鲉肝臟免疫指標(biāo)的影響（見表4）

由表4可知，與對(duì)照組相比，T2和T3組堿性磷酸酶、溶菌酶活性顯著提高（P<0.05）；各?；撬崽砑咏M的酸性磷酸酶活性顯著高于對(duì)照組（P<0.05），且隨著牛磺酸含量的升高有下降趨勢(shì)，但差異不顯著（P>0.05）。

表4 低魚粉飼料中添加?；撬釋?duì)許氏平鲉肝臟免疫指標(biāo)的影響（n=3）

2.4 低魚粉飼料中添加牛磺酸對(duì)許氏平鲉肝臟抗氧化能力的影響（見表5）

表5 低魚粉飼料中添加?；撬釋?duì)許氏平鲉肝臟抗氧化能力的影響（n=3）

由表5可知，T2組過(guò)氧化氫酶活性顯著高于其他各組（P<0.05），之后出現(xiàn)下降趨勢(shì)。?；撬崽砑咏M丙二醛含量相較于對(duì)照組顯著下降（P<0.05），且隨著牛磺酸添加量的增加有上升趨勢(shì)。各組間總超氧化物歧化酶活性無(wú)顯著差異（P>0.05）。

3 討論

3.1 低魚粉飼料中添加?；撬釋?duì)許氏平鲉腸道健康的影響

魚類腸道消化酶是反映魚體消化生理機(jī)能的重要指標(biāo)，可以直接影響魚體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收和利用情況[17]。試驗(yàn)結(jié)果表明在低魚粉飼料中添加適宜?；撬峥稍鰪?qiáng)許氏平鲉腸道脂肪酶、淀粉酶和蛋白酶活性，提升魚體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收。研究表明?；撬嵩隰~體內(nèi)會(huì)與膽酸、鵝脫氧膽酸等游離膽酸合成?；悄懰岷团；蛆Z脫氧膽酸，結(jié)合膽汁酸的增加進(jìn)而會(huì)激活魚體內(nèi)膽鹽刺激脂酶來(lái)分解脂肪[18-20]，對(duì)脂肪酶活性具有促進(jìn)作用；淀粉酶活性的提升一方面與?；撬崽嵘龣C(jī)體α-淀粉酶基因的相對(duì)表達(dá)量有關(guān)[21]，另一方面?；撬釙?huì)刺激胰島素的釋放來(lái)血糖降低，從而間接促使淀粉酶活性升高進(jìn)行葡萄糖分解；此外適量?；撬徇€會(huì)刺激魚體蛋白酶分泌，促進(jìn)蛋白質(zhì)的消化吸收[22]。

腸道皺襞高度、寬度以及肌層厚度會(huì)直接影響腸道的完整性和穩(wěn)固性，對(duì)魚體健康極為重要。低魚粉高植物蛋白飼料因存在大量抗?fàn)I養(yǎng)因子和適口性差等原因會(huì)對(duì)魚類腸道造成損傷，而本試驗(yàn)結(jié)果顯示通過(guò)添加牛磺酸可以明顯修復(fù)許氏平鲉腸道的損傷狀態(tài)，提升腸道皺襞高度及寬度。據(jù)相關(guān)報(bào)道?；撬岵粌H作為結(jié)腸上皮細(xì)胞中含量最豐富的游離氨基酸，與上皮細(xì)胞增殖和腸道結(jié)構(gòu)的變化相關(guān)[23]，還會(huì)通過(guò)調(diào)節(jié)TLRs/NF-κB 信號(hào)通路，下調(diào)腸道促炎因子與上調(diào)抗炎因子的表達(dá)，緩解高植物蛋白引起的腸道炎癥，保持腸道健康生長(zhǎng)[24]。但隨著牛磺酸添加量的上升，許氏平鲉腸道消化酶活性、皺襞高度及寬度有下降趨勢(shì)，在青魚[25]、花鰻鱺[26]的研究上也得到了類似結(jié)果，其原因可能是魚類攝入過(guò)量?；撬釙?huì)導(dǎo)致腸道處于高酸度環(huán)境，抑制腸道擬桿菌門等一些參與營(yíng)養(yǎng)代謝的優(yōu)勢(shì)菌群生長(zhǎng)[27]和腸道α-淀粉酶基因的相對(duì)表達(dá)[21]，進(jìn)而對(duì)腸道健康造成嚴(yán)重?fù)p傷。

3.2 低魚粉飼料中添加?；撬釋?duì)許氏平鲉免疫水平的影響

牛磺酸作為機(jī)體內(nèi)淋巴細(xì)胞和吞噬細(xì)胞中含量最豐富的游離氨基酸，具有促進(jìn)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生白介素、促進(jìn)免疫球蛋白分泌和增強(qiáng)中性粒細(xì)胞吞噬殺菌能力等多種生物學(xué)功能[28]。溶菌酶可水解致病菌細(xì)胞壁的肽聚糖，致其內(nèi)容物流出，加速細(xì)菌溶解[29]；堿性磷酸酶存在機(jī)體各組織中，可通過(guò)改變細(xì)菌表面結(jié)構(gòu)，加速吞噬細(xì)胞對(duì)其進(jìn)行吞噬降解[30]；酸性磷酸酶是巨噬細(xì)胞溶酶體的標(biāo)志酶，而溶酶體通過(guò)水解致病菌來(lái)達(dá)到保護(hù)機(jī)體的作用[31]。本試驗(yàn)中，飼料中添加0.8%牛磺酸會(huì)顯著增強(qiáng)許氏平鲉肝臟溶菌酶、堿性磷酸酶和酸性磷酸酶的活性，表明適量的?；撬釋?duì)增強(qiáng)機(jī)體免疫具有重要作用，此外Zhang 等[32]在探究牛磺酸對(duì)黃顙魚急性氨中毒的緩解作用時(shí)也有相同的發(fā)現(xiàn)，牛磺酸可以有效遏制試驗(yàn)魚體內(nèi)溶菌酶活性和細(xì)胞吞噬指數(shù)下降的現(xiàn)象。但當(dāng)?；撬崽砑恿吭?.6%～3.6%時(shí)，許氏平鲉肝臟免疫酶活性出現(xiàn)下降趨勢(shì)，這一結(jié)果與青魚[25]、草魚[33]、紅鰭東方鲀[34]的研究上相同，說(shuō)明過(guò)多的?；撬釙?huì)對(duì)魚體免疫應(yīng)答產(chǎn)生抑制作用，相關(guān)研究表明過(guò)量的?；撬釙?huì)上調(diào)魚類的促炎細(xì)胞因子，肝臟健康程度下降，導(dǎo)致機(jī)體免疫酶活性降低[35]。此外腸道健康與魚體健康水平息息相關(guān)，過(guò)多的?；撬釘z入時(shí)腸道受損，同樣會(huì)使機(jī)體的免疫水平下降[36]。

3.3 低魚粉飼料中添加?；撬釋?duì)許氏平鲉抗氧化能力的影響

相關(guān)研究表明，?；撬釙?huì)與機(jī)體內(nèi)次氯酸結(jié)合生成?；锹劝?，而?；锹劝窌?huì)激活Nrf2/ARE 信號(hào)通路，從而上調(diào)抗氧化酶的相對(duì)基因表達(dá)[37]，此外?；撬嶙鳛榫€粒體蛋白質(zhì)合成的調(diào)節(jié)器，具有增強(qiáng)電子傳遞鏈活性并保護(hù)線粒體免受過(guò)量超氧化物影響的作用，進(jìn)而提升機(jī)體的抗氧化能力[38]。本試驗(yàn)研究中，飼料中添加?；撬崽岣吡诉^(guò)氧化氫酶活性并顯著降低了丙二醛的含量，表明?；撬岽龠M(jìn)了魚體對(duì)氧自由基的清除能力，降低了脂質(zhì)過(guò)氧化物的產(chǎn)生，緩解了許氏平鲉攝食高植物蛋白飼料后機(jī)體的氧化損傷程度。Rosemberg 等[39]在探究?；撬釋?duì)乙醇急性誘導(dǎo)斑馬魚大腦氧化應(yīng)激后的保護(hù)效果時(shí)也有相同發(fā)現(xiàn)，150 mg/L 和400 mg/L ?；撬峥捎行б种浦|(zhì)過(guò)氧化并提升過(guò)氧化氫酶、超氧化物歧化酶的活性。此外本試驗(yàn)中當(dāng)?；撬崽砑恿砍^(guò)0.8%時(shí)過(guò)氧化氫酶活性有降低趨勢(shì)，丙二醛含量有上升趨勢(shì)，表明適宜的?；撬岷繉?duì)機(jī)體抗氧化能力具有提升作用，而含量過(guò)高可能會(huì)產(chǎn)生抑制作用，其原因可能是過(guò)高牛磺酸水平會(huì)使魚類肝臟出現(xiàn)肝竇擴(kuò)張現(xiàn)象，加速肝細(xì)胞與血液之間的物質(zhì)交換，降低血清中白蛋白、球蛋白含量，打破了肝臟代謝平衡，使肝臟健康受損，機(jī)體的抗氧化能力下降[40]。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)通過(guò)在低魚粉飼料中添加?；撬犸曫B(yǎng)許氏平鲉56 d后發(fā)現(xiàn)，適量?；撬峥商嵘S氏平鲉腸道脂肪酶、蛋白酶和淀粉酶活性并改善其腸道結(jié)構(gòu)，提高肝臟免疫及抗氧化能力，但過(guò)量?；撬釙?huì)對(duì)魚體產(chǎn)生不利的影響，根據(jù)腸道健康指標(biāo)，建議許氏平鲉低魚粉飼料牛磺酸最適添加范圍為0.8%～1.6%。