菟絲子總黃酮對小鼠睪丸間質細胞凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3的影響

李利娟，劉文濤，羅歡歡，孟曉彤，柴冰茹，谷 雨，廖禮彬，白生賓

1 新疆醫(yī)科大學 基礎醫(yī)學院，新疆烏魯木齊 830011；2 解放軍總醫(yī)院醫(yī)學創(chuàng)新研究部 學報編輯部，北京 100853

睪丸間質細胞是睪丸組織中合成并分泌雄性激素的主要細胞，在精子發(fā)生和成熟過程中發(fā)揮至關重要的作用[1]。研究表明，睪丸間質細胞凋亡可引起睪丸損傷，從而引發(fā)生精功能障礙，導致男性不育[1-2]。因此，維持間質細胞正常功能對保護男性生殖健康有重要意義。菟絲子總黃酮(total flavonoids from semen cuscutae，TFSC)作為菟絲子的主要活性成分之一，具有抗炎、抗凋亡等作用，同時對精子的活率和細胞的活力具有明顯的保護作用[3-5]。研究表明，TFSC可通過MAPK信號通路緩解雙酚A誘導的小鼠睪丸間質細胞凋亡，提高睪丸間質細胞分泌的睪酮含量，維持睪丸的正常功能[6]。為進一步探究TFSC緩解睪丸間質細胞凋亡作用與Bax、Bcl-2、Caspase-3凋亡關鍵蛋白的關系，本實驗以小鼠睪丸間質細胞系TM3細胞作為研究對象，探討TFSC抑制TM3細胞凋亡的可能作用機制，為其治療男性不育提供實驗數據。

材料與方法

1 實驗材料和試劑 TM3細胞、TM3細胞專用培養(yǎng)基(武漢普諾賽生命科技有限公司)；胎牛血清(BI)；CCK-8試劑盒(Biosharp)；抗Bax抗體、Caspase-3抗體(美國Cell Signaling Technology公司)；抗Bcl-2抗體、抗GAPDH抗體(英國Abcam公司)；山羊抗兔IgG-HRP(武漢博士德生物工程有限公司)，蛋白酶抑制劑、高效RIPA裂解液(北京索萊寶科技有限公司)；Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒(美國BD Pharmingen公司)；BCA蛋白定量試劑盒(美國Thermo公司)；SDS-PAGE凝膠試劑盒(北京全式金生物技術有限公司)；Acrolein(國藥集團)；菟絲子總黃酮(南京澤朗生物技術有限公司)。Herocell 180型CO2恒溫培養(yǎng)箱(上海潤度生物科技有限公司)；CytoFLEX型流式細胞儀(美國Beckman Coulter公司)；高速低溫離心機(德國Eppendorf公司)；全波長酶標儀、Western blot垂直電泳槽、轉印槽、成像分析儀(美國Bio Rad公司)。

2 細胞培養(yǎng) 用TM3細胞專用培養(yǎng)基(含5%HS+2.5% FBS+1%雙抗的DMEM/F12基礎培養(yǎng)基)于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進行TM3細胞的常規(guī)培養(yǎng)，待細胞密度生長至80%左右時，用0.25%的胰酶消化細胞，進行傳代處理。本實驗選用3～5代細胞。

3 CCK-8檢測細胞增殖活性 為篩選TFSC和丙烯醛(acrolein，ACR)的最佳處理濃度，選用對數生長期的TM3細胞，調整細胞密度為5×104/mL，每孔加入100 μL細胞懸液在96孔板中，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)過夜。待TM3細胞貼壁且生長穩(wěn)定后，按照TFSC(0、25、50、100、200、400、600 μg/mL，作用24 h)和ACR(0、10、50、100、200、400 μmol/L，分別作用4、12、24 h)濃度梯度進行藥物干預。于每孔中加入10 μL CCK-8試劑，輕輕混勻，37℃孵育2 h，用酶標儀檢測450 nm波長處各孔細胞的光密度(optical density，OD)值。篩選細胞存活率為50%時的ACR(即IC50)濃度和對TM3細胞增殖作用最明顯的TFSC濃度為后續(xù)實驗濃度。

4 實驗分組及細胞損傷模型的建立 將TM3細胞接種在6孔板中，在37℃、5% CO2的條件下培養(yǎng)過夜。待細胞貼壁且生長狀態(tài)良好時，分別設置對照組(加入等量培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h)、模型組(加 入 含35 μmol/L ACR的 培 養(yǎng) 液 培 養(yǎng)24 h)、TFSC低、中、高劑量組(先用35 μmol/L ACR培養(yǎng)24 h后，分別加入含100、200、400 μg/mL TFSC的完全培養(yǎng)基干預24 h)。

5 Annexin V/PI檢測細胞凋亡 根據細胞凋亡試劑盒說明書操作。將對數生長期的TM3細胞以1×105/孔接種于6孔板，培養(yǎng)12 h后，棄去培養(yǎng)液。按照實驗分組對細胞進行相應處理后，用無EDTA胰酶消化，1 000 r/min離心5 min收集細胞，棄上清。用預冷PBS將細胞洗兩遍，加100 μL 1 × Binding Buffer使細胞重懸，轉移至1.5 mL EP管，分 別 加5 μL Annxeni V-FITC和5 μL PI染液，混勻后室溫避光孵育15 min。最后加入400 μL 1 × Binding Buffer，輕輕混勻，過篩至流式管，流式細胞儀上機檢測，1 h內檢測完畢。

6 Western blotting檢測小鼠睪丸間質細胞Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白的表達 提取TM3細胞總蛋白，用BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白濃度的測定。按1∶5的比例加5 × SDS上樣緩沖液，100℃水 浴10 min。10% SDS-PAGE凝 膠 上 樣15 μg，電泳結束后將蛋白轉到PVDF膜上。用TBST配置的5%脫脂牛奶封閉2 h，TBST洗3次，10 min/次。加兔抗鼠多克隆抗體(抗體稀釋比例：Bcl-2 1∶1 000；Bax 1∶1 000；GAPDH 1∶5 000)，4℃條件下孵育過夜。充分漂洗后加山羊抗兔二抗(稀釋比例1∶1 000)室溫孵育2 h。使用ECL增強化學發(fā)光顯影，凝膠圖像分析儀分析結果。

7 統(tǒng)計學分析 采用SPSS26.0軟件分析數據，實驗數據均以±s表示。多組之間數據分析采用One-way ANOVA單因素方差分析，采用Tukey檢驗進行兩兩比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 TFSC和ACR對TM3細胞增殖活力的影響 CCK-8檢測結果顯示，TFSC在一定濃度范圍內可促進TM3細胞增殖，且濃度為100、200、400 μg/mL時，TM3細胞的增殖效果明顯(P＜ 0.05，圖1A)。不同濃度(0、10、50、100、200、400 μmol/L)的ACR在不同時間點對TM3細胞增殖具有一定抑制作用，且隨著ACR濃度的增高，細胞活性逐漸降低，除4 h和12 h 10 μmol/L ACR濃度組外，其余ACR各處理組的細胞活力均明顯降低(P＜0.05，圖1B)。說明ACR抑制睪丸間質細胞增殖，其抑制作用呈劑量依賴性。4 h、12 h、24 h這三個時間點ACR的IC50分別為112、73.16和33.97 μmol/L，最終選擇35 μmol/L ACR作用24 h進行后續(xù)實驗的研究。

圖1 TFSC(A)和ACR(B)對TM3細胞增殖活力的影響(aP ＜0.05, vs TFSC 0 μg/mL)Fig.1 Effects of TFSC (A) and ACR (B) on TM3 cell viability (aP ＜0.05, vs TFSC 0 μg/mL)

2 TFSC對ACR誘導的TM3細胞形態(tài)和增殖能力的影響 各組細胞形態(tài)倒置顯微鏡下觀察結果顯示(圖2A)，對照組細胞呈梭形或多邊形、上皮樣，排列緊密，界限清晰。與對照組比較，模型組細胞皺縮，甚至變圓脫落，細胞間隙增加，數量明顯減少，培養(yǎng)液中漂浮細胞及細胞碎片明顯增加。與模型組比較，TFSC低、中、高劑量作用一段時間后，可在一定程度上恢復細胞生長狀態(tài)，明顯增加細胞數量，減少漂浮細胞，增強細胞活力，中、高劑量組效果顯著(P＜ 0.05)，但未恢復到正常水平(圖2B)。

圖2 TFSC對ACR誘導的TM3細胞生長狀態(tài)和細胞活性的影響Fig.2 Effect of TFSC on the growth status and cell viability of ACR-induced TM3 cell

3 菟絲子總黃酮對抑制TM3細胞凋亡的影響 與對照組(細胞凋亡率11.68% ± 1.84%)比較，模型組細胞凋亡率(20.02% ± 0.41%)明顯增加(P＜0.05)，用TFSC低、中、高劑量作用一段時間后，細胞凋亡率分別為18.62% ± 0.73%、16.47% ±1.53%、15.5% ± 0.91%，相較于模型組，TFSC中、高劑量組細胞的凋亡率顯著降低(P＜ 0.05，圖3)。

圖3 流式細胞儀測不同濃度TFSC對ACR誘導TM3細胞凋亡的影響Fig.3 Influence of TFSC with different concentrations on the apoptosis of TM3 cell induced by ACR (Flow cytometer )

4 菟絲子黃酮對TM3細胞Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達的影響 與對照組比較，模型組 Bax 、Caspase-3蛋白表達明顯升高(P＜ 0.05)，Bcl-2蛋白的表達明顯下降(P＜ 0.05)。與模型組比較，TFSC中、高劑量組Bax、Caspase-3蛋白的表達明顯下降(P＜ 0.05)，TFSC低、中、高劑量組Bcl-2蛋白表達明顯升高(P＜ 0.05，圖4A～圖4D)。

圖4 TFSC對ACR誘導的TM3細胞Bcl-2、Caspase-3、Bax蛋白表達的影響Fig.4 Effects of TFSC on the protein expression levels of Bcl-2, Caspase-3 and Bcl-2 of ACR-induced TM3 cells

討 論

男性不育是人類生殖健康的一個重大問題，引起男性不育的因素很多，且機制復雜，其中睪丸間質細胞凋亡是導致生殖功能降低的一個重要方面。睪丸間質細胞的主要功能是參與睪酮的合成與分泌，機體內約90%的睪酮是睪丸間質細胞產生，在維持生精功能中發(fā)揮重要作用[7-9]。因此，睪丸間質細胞的數量和功能正常在生精過程中是十分重要的。ACR是臨床上常用的抗腫瘤藥物環(huán)磷酰胺的主要毒性代謝產物，除此之外，還來源于汽車尾氣、煙霧、過熱的食用油等[10]。研究發(fā)現，ACR可破壞細胞中的蛋白質，引起DNA損傷和脂質過氧化反應，從而使細胞發(fā)生凋亡[11-13]。本實驗以不同濃度ACR處理TM3細胞，結果顯示隨著ACR濃度的升高，TM3細胞存活率逐漸降低，且具有一定的劑量依賴效應。菟絲子是臨床上常用的一味補腎中草藥，菟絲子黃酮是其主要成分，在治療男性不育方面有一定的成效。研究表明菟絲子黃酮可改善睪丸的生精功能，促進睪丸生殖細胞增殖，促進睪酮分泌[14-15]。本實驗結果顯示TFSC在100、200、400、600 μg/mL濃度時可以促進TM3細胞增殖。此外，TFSC能夠緩解ACR誘導TM3細胞損傷，中、高劑量組作用明顯(P＜0.05)。流式結果顯示，與對照組相比，ACR模型組TM3細胞的凋亡率明顯增加(P＜0.05)，TFSC中、高劑量組明顯降低TM3細胞的凋亡率(P＜0.05)，這進一步提示菟絲子黃酮能夠抑制ACR誘導的TM3細胞凋亡。

細胞凋亡是機體內細胞的程序性死亡，在機體內環(huán)境的維持和多個系統(tǒng)的發(fā)育中發(fā)揮重要作用，細胞凋亡受Bcl-2家族、Caspase家族等多個基因的嚴格調控。近年來研究表明睪丸間質細胞的凋亡受多個因素和基因的調控，主要有Bcl-2、Caspase-3等[16-19]。Bcl-2家族蛋白是通過調節(jié)促凋亡與抗凋亡之間的平衡來維持線粒體的完整性的一類關鍵蛋白[20]。Bax可通過增強線粒體膜通透性，改變跨膜電位，從而促使線粒體內細胞色素C釋放到細胞質中，引起半胱氨酸天冬氨酸酶的級聯反應，最終導致Caspase-3被激活，引發(fā)細胞的凋亡[21-24]。Bcl-2蛋白可以通過抑制凋亡蛋白引發(fā)的一系列信號激活發(fā)揮抗凋亡作用[23-24]。為探究菟絲子總黃酮抑制TM3細胞凋亡的可能分子作用機制，我們進一步對凋亡相關蛋白的表達進行了相應的檢測。本實驗結果表明，在TM3細胞中，ACR通過降低抗凋亡的Bcl-2蛋白表達，增加促凋亡的Bax和Caspase-3蛋白表達，導致細胞發(fā)生凋亡，而在不同濃度TFSC干預后，與 ACR模型組相比，Bax和Caspase-3蛋白表達顯著降低，Bcl-2蛋白表達顯著升高。提示TFSC可通過改善抗凋亡與促凋亡蛋白的失衡以緩解間質細胞凋亡。

綜上所述，菟絲子總黃酮能夠促進睪丸間質細胞的增殖，降低丙烯醛誘導的小鼠睪丸間質細胞損傷，減少小鼠睪丸間質細胞的凋亡，其抗凋亡作用可能與Bcl-2蛋白表達上調和Bax、Caspase-3蛋白表達下調有關。本實驗僅對TFSC抑制TM3細胞凋亡的分子作用機制做了初步探討，對其具體的信號分子通路的作用仍待更深入的研究。