BoNT/A和倍他米松對(duì)骨關(guān)節(jié)炎模型大鼠鎮(zhèn)痛效果比較

楊慧,王琳,萬(wàn)慧偉,周雯雯,李鐵山

(青島大學(xué)附屬醫(yī)院康復(fù)二科,山東 青島 266003)

骨關(guān)節(jié)炎疼痛是最常見(jiàn)的慢性疼痛之一[1]，雖止痛治療辦法多，但多存在效果差、持續(xù)時(shí)間短、副作用大等缺陷[2]，因此需尋求新的鎮(zhèn)痛藥物。近年來(lái)A型肉毒毒素(BoNT/A)的鎮(zhèn)痛作用受到了人們?cè)絹?lái)越多的關(guān)注[3-5]，其具有單次給藥、鎮(zhèn)痛作用時(shí)間長(zhǎng)、副作用少等優(yōu)點(diǎn)。本研究擬觀察關(guān)節(jié)腔注射BoNT/A對(duì)大鼠骨關(guān)節(jié)炎疼痛的鎮(zhèn)痛作用，并與常用關(guān)節(jié)腔注射藥物倍他米松進(jìn)行比較，以進(jìn)一步評(píng)估BoNT/A對(duì)骨關(guān)節(jié)炎疼痛的治療效果，并探討B(tài)oNT/A可能的鎮(zhèn)痛機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量170～200 g，由青島大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。所有大鼠均飼養(yǎng)在青島大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，分籠飼養(yǎng)，每籠5只，大鼠可以自由獲得食物和水。室內(nèi)溫度維持在22 ℃，明暗交替12 h/12 h。適應(yīng)喂養(yǎng)7 d后用于實(shí)驗(yàn)。纖毛機(jī)械痛刺激儀(美國(guó)North Coast公司)；通道式鼠足支撐力測(cè)量?jī)x(濟(jì)南益延科技有限公司)；凝膠成像分析系統(tǒng)(美國(guó)UVP公司)。BoNT/A(美國(guó)Allergan公司)；復(fù)方倍他米松(濃度為7 g/L,杭州默沙東制藥有限公司)，單碘乙酸鈉(MIA，購(gòu)自美國(guó)Sigma公司)，兔抗大鼠P2X4嘌呤受體(P2X4R)抗體、FITC標(biāo)記山羊抗兔 IgG(BiossAntibodies公司)。

1.2 動(dòng)物模型制備及分組

參照HAVELIN等[6]方法建立大鼠踝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎疼痛模型。消毒大鼠踝關(guān)節(jié)周圍的皮膚，按住大鼠左腿，定位腓骨外踝窩，用28號(hào)針垂直插入皮膚，然后插入左脛骨跗骨關(guān)節(jié)腔，向關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射80 g/L的MIA 50 μL構(gòu)建骨關(guān)節(jié)炎模型。同時(shí)隨機(jī)選取12只大鼠向關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射50 μL生理鹽水作為對(duì)照組。21 d后測(cè)量大鼠造模側(cè)及對(duì)側(cè)后爪的機(jī)械刺激撤足閾值(PWT)及負(fù)重情況，測(cè)量3次，將出現(xiàn)PWT及負(fù)重較對(duì)測(cè)后肢明顯下降的行為學(xué)表現(xiàn)穩(wěn)定者納入實(shí)驗(yàn)并作為模型組。造模21 d后，將模型組SD大鼠隨機(jī)分為生理鹽水組(A組)、倍他米松組(B組)、BoNT/A組(C組)，每組15只，分別向關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射25 μL生理鹽水、25 μL復(fù)方倍他米松以及5 U的BoNT/A(25 μL)。

1.3 疼痛行為學(xué)測(cè)試

分別于造模前1 d，造模后21 d及給藥后0、1、3、7、14、21 d，從各組中隨機(jī)抽取6只大鼠進(jìn)行疼痛行為學(xué)測(cè)定。①PWT測(cè)定：將大鼠放置在一個(gè)底部為網(wǎng)格的特殊樹(shù)脂玻璃格子(26 cm×20 cm×14 cm)中適應(yīng)20 min后，應(yīng)用一系列強(qiáng)度遞增的纖毛(0.4、0.6、1.4、2.0、4.0、6.0、8.0、15.0 g)按up and down的方法[7]從2.0 g開(kāi)始垂直刺激大鼠左側(cè)足底部皮膚，每次刺激足底時(shí)間維持5 s，若在規(guī)定時(shí)間內(nèi)大鼠出現(xiàn)縮足、舔腳等陽(yáng)性反應(yīng)時(shí)更換相鄰小一級(jí)的纖毛測(cè)試，若無(wú)反應(yīng)則更換大一級(jí)的纖毛測(cè)試，每次刺激間隔為5 min，測(cè)試上限和下限的纖毛強(qiáng)度分別為15.0 g和0.4 g。計(jì)算50%縮足反應(yīng)的閾值，以此結(jié)果作為PWT評(píng)估指標(biāo)。②后肢支撐力百分比測(cè)定：訓(xùn)練大鼠通過(guò)隧道爬到一個(gè)有角度的樹(shù)脂玻璃室的平臺(tái)，使大鼠的后肢分開(kāi)放置在兩個(gè)稱量梯架上，安靜穩(wěn)定停留5 s后，使用儀器分別計(jì)算雙下肢的支撐力，測(cè)量3次取平均值，數(shù)據(jù)結(jié)果規(guī)范化為左/(左+右)的百分比，正常值為50%表明雙側(cè)后肢重量分布是相等的。

1.4 蛋白印跡法檢測(cè)P2X4R蛋白表達(dá)

分別于造模21 d及給藥后7、14、21 d，各組隨機(jī)取3只大鼠，用100 g/L水合氯醛(3 mL/kg)麻醉后處死動(dòng)物，迅速分離大鼠L4～L6脊髓節(jié)段，研磨成勻漿，制成蛋白懸液，取等量的組織蛋白樣品(含組織蛋白40 μg)加到聚丙烯酰胺凝膠電泳槽中，濃縮膠恒壓80 V約30 min，質(zhì)量濃度為150 g/L分離膠恒壓100 V 約90 min，采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)，恒流200 mA電轉(zhuǎn)移 90 min，于50 g/L脫脂奶粉封閉液中室溫下?lián)u床封閉 2 h，加入山羊抗大鼠P2X4R和GAPDH抗體孵育過(guò)夜，使用TBST漂洗后，將FITC標(biāo)記山羊抗兔IgG室溫?fù)u床孵育2 h，使用TBST漂洗后滴加發(fā)光液顯色成像，通過(guò)Image J 1.36軟件分析目標(biāo)條帶灰度值。以P2X4R/GAPDH的灰度比值表示P2X4R的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠不同時(shí)間PWT比較

造模前，各組大鼠注射側(cè)后足PWT差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。關(guān)節(jié)腔內(nèi)MIA 注射21 d后，對(duì)照組、模型組大鼠注射側(cè)后足的PWT值分別為(18.67±5.68)、(0.70±0.64)g,兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.699，P<0.01)。重復(fù)測(cè)量雙因素方差分析顯示，大鼠PWT不同組別、時(shí)間及組別與時(shí)間交互作用差異均有顯著意義(F時(shí)間=7.96，F(xiàn)組別=22.55，F(xiàn)時(shí)間×組別=3.73，P<0.01)。組內(nèi)比較，倍他米松組及BoNT/A組大鼠各時(shí)間點(diǎn)PWT比較差異有顯著性(F=3.58、17.02，P<0.05)，其中倍他米松組大鼠PWT在給藥后逐漸上升，7 d時(shí)達(dá)到高峰，隨后逐漸下降；而B(niǎo)oNT/A組大鼠PWT在給藥后逐漸上升，21 d時(shí)達(dá)到峰值，且有繼續(xù)上升的趨勢(shì); 生理鹽水組大鼠給藥后各時(shí)間點(diǎn)PWT差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。組間不同時(shí)間點(diǎn)比較，倍他米松組大鼠給藥后3 d和7 d 時(shí)PWT較生理鹽水組改善明顯，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2.74、3.14，P<0.05)，而14 d和21 d差異無(wú)顯著性(P>0.05)；BoNT/A組大鼠給藥后14、21 d時(shí)PWT較生理鹽水組改善明顯(F=11.90、13.25，P<0.01)。見(jiàn)表1。

2.2 各組大鼠不同時(shí)間后肢支撐力百分比比較

造模前，各組大鼠左側(cè)后肢支撐力百分比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。關(guān)節(jié)腔內(nèi)MIA注射21 d后，對(duì)照組、模型組大鼠左側(cè)后肢支撐力百分比分別為(51.27±5.22)%、(35.03±1.67)%，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.261，P<0.001)。重復(fù)測(cè)量雙因素方差分析顯示，后肢支撐力百分比不同組別、時(shí)間及組別與時(shí)間交互作用差異均有顯著性(F時(shí)間=102.89，F(xiàn)組別=25.63，F(xiàn)時(shí)間×組別=5.15，P<0.01)。組內(nèi)比較，各組大鼠給藥后后肢支撐力百分比隨給藥時(shí)間逐漸變化，差異有顯著性(F=8.21～150.55，P<0.01)。組間比較，各時(shí)間點(diǎn)倍他米松組大鼠后肢支撐力百分比與生理鹽水組相比，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；BoNT/A組給藥后7、14、21 d大鼠后足支撐力百分比均較生理鹽水組改善明顯(F=2.80～127.02，P<0.05)。見(jiàn)表2。

2.3 各組P2X4R表達(dá)比較

關(guān)節(jié)腔內(nèi)MIA注射21 d，對(duì)照組、模型組大鼠脊髓背角內(nèi)P2X4R蛋白表達(dá)量分別為0.68±0.26、1.20±0.11，兩組比較差異有顯著性(t=-3.178，P<0.05)。與生理鹽水組相比，給藥后7、14、21 d時(shí)BoNT/A組大鼠脊髓背角內(nèi)P2X4R蛋白表達(dá)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=43.04～150.36，P<0.05)；而各時(shí)間點(diǎn)倍他米松組與生理鹽水組比較，脊髓背角內(nèi)P2X4R的蛋白表達(dá)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3。

表1 給藥后不同時(shí)間各組大鼠PWT比較

表2 給藥后不同時(shí)間各組大鼠左側(cè)后肢支撐力百分比比較

表3 給藥后各組P2X4R蛋白表達(dá)比較

3 討 論

骨關(guān)節(jié)炎是一種常見(jiàn)的關(guān)節(jié)退行性疾病，疼痛是其最主要的癥狀，嚴(yán)重影響了病人的日常生活。目前對(duì)骨關(guān)節(jié)炎疼痛的治療主要包括藥物及非藥物治療，藥物治療包括口服(非甾體類抗炎藥、骨關(guān)節(jié)炎慢作用藥、軟骨保護(hù)劑及阿片類藥物等)、關(guān)節(jié)腔注射(糖皮質(zhì)激素(激素)、透明質(zhì)酸等)，非藥物治療包括衛(wèi)生宣教、體育鍛煉、減肥和針灸等[8]。雖然治療方法比較多，但存在疼痛緩解不足、藥物副作用大等問(wèn)題。對(duì)骨關(guān)節(jié)炎疼痛的治療仍是一個(gè)急需解決的問(wèn)題。

本文研究采用踝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射MIA方法誘導(dǎo)大鼠骨關(guān)節(jié)炎疼痛，結(jié)果顯示，MIA能夠?qū)е麓笫驪WT及后肢支撐力百分比明顯下降，這與相關(guān)研究結(jié)果相一致[9]；關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射倍他米松在給藥后早期(3、7 d)能明顯改善大鼠患側(cè)后肢PWT(評(píng)估誘發(fā)性疼痛指標(biāo))，但對(duì)大鼠后肢支撐力的變化(評(píng)估非誘發(fā)性疼痛指標(biāo))無(wú)明顯影響；但關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射BoNT/A對(duì)大鼠PWT及后肢支撐力均有改善作用，并且這種作用可持續(xù)至給藥后21 d，甚至更久，但其起效時(shí)間較倍他米松晚(7 d以后)。本文結(jié)果還顯示，BoNT/A組大鼠注射側(cè)后肢PWT及支撐力百分比明顯高于倍他米松組。以上結(jié)果表明,倍他米松與BoNT/A對(duì)骨關(guān)節(jié)炎疼痛均具有鎮(zhèn)痛作用，相較于倍他米松，雖然BoNT/A治療骨關(guān)節(jié)炎疼痛起效時(shí)間較慢，但其鎮(zhèn)痛作用持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)、效果更明顯。

倍他米松是關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射治療最常用的激素之一，其能抑制炎癥遞質(zhì)IL-6和IL-8等的表達(dá)，從而消除關(guān)節(jié)內(nèi)炎癥，減輕組織水腫而迅速發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用[10]，這可能與倍他米松注射早期即可改善大鼠患側(cè)后肢PWT有關(guān)。但骨關(guān)節(jié)炎并不是單純的炎癥性疼痛，許多臨床及前臨床試驗(yàn)證實(shí)骨關(guān)節(jié)炎中還存在神經(jīng)病理性疼痛[11-13]；本實(shí)驗(yàn)所使用的MIA誘導(dǎo)的動(dòng)物模型同樣被證實(shí)存在關(guān)節(jié)周圍神經(jīng)的損傷[6,14-15]。而倍他米松缺乏對(duì)神經(jīng)病理性痛的調(diào)節(jié)作用，這可能是其對(duì)后肢支撐力(更能反映神經(jīng)病理性痛中自發(fā)性疼痛特點(diǎn))的變化無(wú)明顯影響的原因。P2X4R是一種主要表達(dá)于脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞上、與神經(jīng)病理性痛產(chǎn)生和維持密切相關(guān)的嘌呤受體。當(dāng)周圍神經(jīng)損傷后，脊髓背角內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞上的P2X4R表達(dá)明顯上調(diào)，與脊髓背角內(nèi)增多的ATP相結(jié)合后誘導(dǎo)脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞活化，活化的脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞釋放神經(jīng)源性營(yíng)養(yǎng)因子BDNF，作用于中間抑制神經(jīng)元上的TRK-B受體，使中間抑制神經(jīng)元超極化，產(chǎn)生去抑制作用，從而使神經(jīng)元興奮性增高，產(chǎn)生痛覺(jué)過(guò)敏及痛覺(jué)超敏[16-17]。抑制P2X4R或敲除大鼠P2X4R基因能使坐骨結(jié)扎大鼠疼痛行為缺失[17-18]。本實(shí)驗(yàn)同樣顯示關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射MIA 21 d后L4～L6脊髓節(jié)段內(nèi)P2X4R的表達(dá)上調(diào)，表明MIA誘導(dǎo)的骨性關(guān)節(jié)炎中可能存在神經(jīng)病理性痛；而關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射BoNT/A能明顯逆轉(zhuǎn)這種MIA誘導(dǎo)的P2X4R蛋白表達(dá)的升高，表明BoNT/A有可能通過(guò)影響P2X4R蛋白的表達(dá)而對(duì)骨關(guān)節(jié)炎的神經(jīng)病理性痛產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用。而B(niǎo)oNT/A如何影響P2X4R蛋白水平，是否能對(duì)其產(chǎn)生直接的作用仍需進(jìn)一步的研究。有研究顯示，BoNT/A不僅能在注射部位發(fā)揮作用，還能通過(guò)逆向軸漿運(yùn)輸?shù)竭_(dá)背根神經(jīng)節(jié)，影響TRPV1的表達(dá)產(chǎn)生鎮(zhèn)痛效果[19]。更有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射BoNT/A可逆向軸漿運(yùn)輸至脊髓背角內(nèi)[20]。既往研究表明，BoNT/A不僅能作用于神經(jīng)元細(xì)胞，還能作用于脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞，調(diào)節(jié)兩者之間的相互作用而對(duì)神經(jīng)病理性痛產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用[21]。已有體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，BoNT/A能夠逆轉(zhuǎn)Lipopolysaccharide誘導(dǎo)的脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞的激活[22]，說(shuō)明BoNT/A對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞有直接作用。我們小組既往研究結(jié)果顯示，BoNT/A在分子構(gòu)型上與P2X4R有很強(qiáng)的親和力[23]。提示BoNT/A有可能通過(guò)逆向軸漿運(yùn)輸?shù)郊顾鑳?nèi)對(duì)P2X4R產(chǎn)生直接的調(diào)節(jié)作用。此外，我們前期研究也顯示，在CFA誘導(dǎo)的難治性關(guān)節(jié)炎大鼠模型中，關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射BoNT/A能通過(guò)抑制踝關(guān)節(jié)腔滑膜內(nèi)炎癥遞質(zhì)IL-1β的釋放，減輕局部滑膜炎癥，從而緩解大鼠疼痛相關(guān)行為[24]，表明BoNT/A還存在抗炎作用。也就是說(shuō)BoNT/A不僅能對(duì)骨關(guān)節(jié)炎大鼠的炎癥性疼痛產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用，還能對(duì)骨關(guān)節(jié)炎大鼠的神經(jīng)病理性痛進(jìn)行調(diào)節(jié)，這可能是BoNT/A鎮(zhèn)痛作用優(yōu)于倍他米松的原因。但BoNT/A關(guān)節(jié)腔注射后需要經(jīng)神經(jīng)末梢吸收發(fā)揮作用，BoNT/A是一種大分子蛋白，經(jīng)神經(jīng)末梢吸收緩慢，這可能是其鎮(zhèn)痛作用相較于倍他米松滯后的原因。

綜上所述，倍他米松以及BoNT/A均能緩解MIA誘導(dǎo)的骨關(guān)節(jié)炎大鼠的疼痛行為；但相較于倍他米松，BoNT/A治療的鎮(zhèn)痛作用更明顯，作用時(shí)間更長(zhǎng)，并且在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中未觀察到明顯不良反應(yīng)。倍他米松的鎮(zhèn)痛作用更多依賴于其抗炎作用，隨著抗炎效果的消退，其鎮(zhèn)痛作用也逐漸減退。BoNT/A不僅具有抗炎作用，還能通過(guò)調(diào)節(jié)脊髓背角內(nèi)P2X4R蛋白的表達(dá)而緩解骨關(guān)節(jié)炎的神經(jīng)病理性痛，而且BoNT/A在體內(nèi)神經(jīng)元中的活性可持續(xù)長(zhǎng)達(dá)5個(gè)月[25]，可對(duì)脊髓背角內(nèi)P2X4R蛋白的表達(dá)產(chǎn)生持久的調(diào)節(jié)作用，這可能是BoNT/A相較于倍他米松具有更持續(xù)鎮(zhèn)痛效果的原因。因此，就骨關(guān)節(jié)炎治療遠(yuǎn)期效果而言，關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射BoNT/A優(yōu)于倍他米松。