KLF2、GBP5和DUSP3基因檢測對活動性肺結(jié)核病人的診斷價值

周佳玉,隋愛華,李金鳳,王芳芳,林存智

(青島大學(xué)附屬醫(yī)院,山東 青島 266003 1 呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科； 2 醫(yī)學(xué)研究中心)

結(jié)核病是由結(jié)核分支桿菌引起的慢性傳染性疾病，每年新增感染結(jié)核(TB)病人1 000萬人，是世界十大致死疾病之一，中國也是全球30個結(jié)核高負(fù)擔(dān)國家之一[1]。結(jié)核病主要傳染源是痰涂片陽性的肺結(jié)核病人，但是全球結(jié)核分支桿菌感染者多數(shù)以潛伏結(jié)核感染(LTBI)存在，而LTBI可發(fā)展為活動性結(jié)核,成為主要的傳染源[2]，早期、快速、有效地診斷肺結(jié)核和有效地篩查LTBI人群對有效控制結(jié)核病有重大意義。目前，用于診斷LTBI的方法有結(jié)核菌素試驗(TST)和γ-干擾素釋放試驗(IGRAs)，但是由于接種卡介苗的影響，IGRAs在LTBI中的診斷效能更高[3-4]。QuantiFERON TB-GOLD (QFT)試驗為IGRAs方法之一，可用于區(qū)分LTBI和健康人群。既往有研究顯示，實時熒光定量PCR(RT-PCR)技術(shù)檢測結(jié)核相關(guān)基因可以用于肺結(jié)核的診斷[5-6]。SWEENEY等[7]進(jìn)行的Meta分析發(fā)現(xiàn)，鳥苷酸結(jié)合蛋白5(GBP5)、Krüppel樣轉(zhuǎn)錄因子2(KLF2)、雙特異性磷酸酶3(DUSP3)基因在肺結(jié)核診斷中有意義，并提出TB評分可用于診斷肺結(jié)核和LTBI。本文研究外周血單個核細(xì)胞(PBMC)中KLF2、GBP5、DUSP3基因表達(dá)和TB評分在活動性肺結(jié)核(ATB)和LTBI人群中差異，并探討其在ATB中的診斷價值。

1 資料和方法

1.1 一般資料

本實驗采取前瞻性研究方法，研究對象來源于2019年5月1日—12月31日就診于青島大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸與危重醫(yī)學(xué)科和青島市黃島結(jié)核病防治所病人，以及同期青島大學(xué)附屬醫(yī)院體檢中心健康體檢者。其中ATB病人110例，男性64例，女性46例，平均年齡(46.65±19.40)歲，診斷符合中華醫(yī)學(xué)會結(jié)核病學(xué)分會《肺結(jié)核診斷和治療指南》標(biāo)準(zhǔn)[8]，排除合并免疫缺陷類疾病及服用免疫抑制劑的病人。肺部其他疾病(OPD)病人114例，男性62例，女性52例，平均年齡(54.94±15.18)歲；胸部CT檢查顯示肺部有陰影，QFT試驗陰性，痰抗酸桿菌檢測連續(xù)3次陰性，有肺部疾病癥狀及體征，包括肺癌、支氣管擴(kuò)張伴感染、慢性阻塞性肺疾病、機(jī)化性肺炎、結(jié)節(jié)病、細(xì)菌性肺炎、肺曲霉菌病、肺隱球菌病等。LTBI病人52例，男性30例，女性22例，平均年齡(54.03±16.18)歲；雙肺CT檢查正常，QFT試驗陽性，無結(jié)核感染癥狀、體征及病原學(xué)依據(jù)[9]。健康對照者63例，其中男性34例，女性29例，平均年齡(46.40±18.34)歲；QFT試驗陰性且無結(jié)核感染癥狀、體征，無肺部影像學(xué)改變。4組人群性別差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，OPD組年齡高于ATB組和健康對照組(F=16.164，P<0.05)。本研究獲得研究對象或家屬的知情同意，并通過青島大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)。

1.2 儀器和試劑

RT-PCR儀(Roche LightCycler480Ⅱ，Switzerland);Thermo Nano Drop 2000C核酸檢測儀(Thermo Fisher Scientific，USA);人外周血淋巴細(xì)胞分離液(Ficoll配制，天津市灝洋生物制品科技有限公司);RNAiso Plus(Takara，Japan);PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Erase(Perfect Real time,Takara，Japan);TB Green Premix Ex Taq Ⅱ(Tli R NaseH Plus,Takara，Japan);PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3 研究方法

1.3.1標(biāo)本采集和處理 采集受檢者外周靜脈血4 mL，EDTA抗凝，采用Ficoll密度梯度離心法分離PBMC。應(yīng)用Trizol法提取PBMC總RNA，用Thermo Nano Drop 2000C核酸檢測儀檢測RNA濃度及質(zhì)量。

1.3.2RT-PCR方法檢測KLF2、GBP5、DUSP3基因表達(dá) 在0.2 mL反應(yīng)管中加入5×gDNA Eraser Buffer 2 μL、gDNA Eraser 1 μL、Total RNA 1 ng、RNase Free H2O至10 μL，42 ℃反應(yīng)2 min；再次加入PrimeScript RT Enzyme Mix I 1 μL、RT Primer Mix 1 μL、5×PrimeScript Buffer 24 μL、RNase Free H2O 4 μL混勻，37 ℃、15 min，85 ℃、5 s，得到cDNA。RT-PCR反應(yīng)體系20 μL，內(nèi)含：TB Green Premix Ex Taq Ⅱ(Tli RNaseH Plus,2×)10.0 μL，PCR上游和下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL，cDNA 2.0 μL，滅菌水6.4 μL。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃、30 s，1個循環(huán)；95 ℃、5 s，60 ℃、30 s，40個循環(huán)；融解曲線分析95 ℃、5 s，60 ℃、60 s，95 ℃，1個循環(huán)；降溫40 ℃、60 s，1個循環(huán)。反應(yīng)在Roche Light Cycler 480Ⅱ RT-PCR儀中進(jìn)行。反應(yīng)結(jié)束后得到Ct值，以2-△Ct值(△Ct=目的基因Ct值-內(nèi)參照基因Ct值)表示目的基因的表達(dá)量。以GAPDH基因作為內(nèi)參照。實驗所用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司設(shè)計合成，見表1。

1.3.3TB評分的計算 TB評分=(GBP5基因表達(dá)+DUSP3基因表達(dá))/2-KLF2基因表達(dá)[8]。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS Statistics 23軟件以及GraphPadPrism 5軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。首先應(yīng)用Shapiro-Wilk檢驗分析數(shù)據(jù)是否服從正態(tài)分布，非正態(tài)分布計量資料結(jié)果以M(P25，P75)表示,多組數(shù)據(jù)間比較采用Kruskal-WallisH檢驗，兩兩比較采用Bonferroni校正多重比較的方法。應(yīng)用受試者工作特征曲線(ROC曲線)下面積(AUC)評估診斷效能[7]，用Youden指數(shù)計算最佳診斷界值[10]。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 PCR引物及其序列

2 結(jié) 果

2.1 各組KLF2、GBP5和DUSP3基因表達(dá)比較

ATB組、OPD組、LTBI組以及健康對照組KLF2、GBP5和DUSP3基因表達(dá)差異有顯著意義(χ2=26.842～145.162,P<0.01)。其中KLF2基因表達(dá)ATB組高于OPD組和健康對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(z=4.274、4.477,P<0.01)，但OPD組、LTBI組和健康對照組比較差異無顯著意義(P>0.05)。GBP5基因表達(dá)ATB組高于OPD組和健康對照組(z=2.785、5.108,P<0.01)，OPD組高于健康對照組(z=2.770,P<0.01)。DUSP3基因表達(dá)ATB組高于OPD組、LTBI組和健康對照組，差異有顯著性(z=3.793～11.524，P<0.01)，OPD組高于LTBI組(z=3.505,P<0.01)和健康對照組(z=8.370,P<0.01)，LTBI組高于健康對照組(z=3.882,P<0.01)。見表2。

表2 各組KLF2、GBP5和DUSP3基因表達(dá)量的比較(M(P25，P75))

2.2 KLF2、DUSP3和GBP5基因表達(dá)及TB評分的診斷效能

2.2.1區(qū)分ATB和OPD的診斷效能 以ATB為陽性、OPD為陰性，繪制ROC曲線進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，KLF2、DUSP3、GBP5基因和TB評分的AUC均<0.700。見圖1a和表3。

2.2.2區(qū)分ATB和LTBI的診斷效能 以ATB為陽性、LTBI為陰性，ROC曲線分析顯示，DUSP3基因的AUC為0.805，靈敏度為55.5%，特異度為90.4%；TB評分的AUC為0.771，靈敏度為51.8%，特異度為88.5%。見圖1b和表3。

2.2.3區(qū)分ATB和健康人群的診斷效能 以ATB為陽性、健康人群為陰性，ROC曲線分析顯示，DUSP3基因的AUC為0.962，靈敏度為96.4%，特異度為84.1%；TB評分的AUC為0.929，診斷靈敏度為96.4%，特異度為82.5%。GBP5、KLF2基因的AUC分別為0.710、0.724。見圖1c和表3。

2.2.4區(qū)分LTBI和健康人群的診斷效能 以健康人群為陰性、LTBI為陽性，ROC曲線診斷效能分析顯示，DUSP3基因的AUC為0.712，診斷靈敏度為59.6%，特異度為84.1%。見圖1d和表4。

表3 KLF2、GBP5、DUSP3基因表達(dá)和TB評分預(yù)測ATB的價值比較

表4 KLF2、GBP5、DUSP3基因表達(dá)及TB評分預(yù)測LTBI的價值

a：以ATB組為陽性、OPD組為陰性的ROC曲線；b：以ATB組為陽性、LTBI組為陰性的ROC曲線；c：以ATB組為陽性、健康對照組為陰性的ROC曲線；d：以LTBI組為陽性、健康對照組為陰性的ROC曲線。

3 討 論

目前全球有近17億人感染結(jié)核，多數(shù)為LTBI狀態(tài)，部分可發(fā)展為ATB，且結(jié)核已成為慢性傳染病中致死率最高的疾病[1]。早期診斷和治療結(jié)核感染能夠有效地改善病人預(yù)后，也是控制結(jié)核傳播的重要環(huán)節(jié)。LTBI的診斷在結(jié)核防控中起著至關(guān)重要的作用。目前診斷肺結(jié)核的方法主要包括臨床癥狀體征、影像學(xué)檢查、病原學(xué)檢查(痰涂片、痰培養(yǎng)、痰結(jié)核菌PCR+探針檢測)、病理檢查、免疫學(xué)檢查(TST、酶聯(lián)免疫吸附試驗、IGRAs)等[8,11]。LTBI的診斷方法包括TST和IGRAs，IGRAs具有較高的靈敏度和陰性預(yù)測值，但是由于IGRAs價格昂貴，TST仍廣泛應(yīng)用[12-15]。傳統(tǒng)的結(jié)核診斷方法存在缺陷，TST檢測的假陽性率高[16]，痰涂片檢查的陽性率為60%～80%，但合并HIV感染者中痰涂片陽性的檢出率僅有10%～30%[12]。結(jié)核分支桿菌培養(yǎng)為結(jié)核感染診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但是培養(yǎng)周期長。雖然IGRAs診斷結(jié)核的準(zhǔn)確性高于TST，但是其檢測結(jié)果受CD4+T淋巴細(xì)胞計數(shù)影響[17]，且不能區(qū)分ATB與LTBI[18]。目前，有研究顯示可通過檢測某些基因的表達(dá)來診斷ATB和LTBI。

本文研究對象中，OPD組的年齡高于ATB組和健康對照組，但是無證據(jù)顯示結(jié)核病的發(fā)病率及3組基因的表達(dá)量與年齡相關(guān)。本文PCR檢測結(jié)果顯示，ATB組、OPD組、LTBI組以及健康對照組KLF2、GBP5、DUSP3基因表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義。KLF2基因在人類單核細(xì)胞中高表達(dá)，在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、感染性疾病、動脈粥樣硬化等疾病中有重要作用。KLF2基因可調(diào)節(jié)單核細(xì)胞的功能和分化，調(diào)節(jié)炎癥因子白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子α(TNFα)、核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)等，炎癥情況下循環(huán)單核細(xì)胞中的KLF2基因表達(dá)下調(diào)[19-24]。本實驗結(jié)果顯示，KLF2基因在ATB中表達(dá)上調(diào)，與SWEENEY等[7]研究結(jié)果不一致，其原因需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)行研究。GBP5基因可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞釋放γ-干擾素促進(jìn)炎癥反應(yīng)[25]，炎癥時GBP5基因表達(dá)上調(diào)促進(jìn)AIM2炎性體的活化及IL-1β、IL-18等炎性細(xì)胞因子的釋放[26]。LAUX等[5]研究顯示，聯(lián)合檢測外周血GBP5基因和CD64基因表達(dá)區(qū)分ATB和OPD診斷效能高。ROE等[27]研究顯示，外周血中GBP5基因表達(dá)可作為預(yù)測結(jié)核發(fā)病基因之一。本實驗結(jié)果亦顯示，GBP5基因在ATB組的表達(dá)顯著高于OPD組和健康對照組，差異有顯著性，與SWEENEY等[7]研究結(jié)果一致，但不能區(qū)分ATB和LTBI。DUSP3也稱為VH1相關(guān)磷酸酶(VHR)，為一種絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)磷酸化調(diào)節(jié)因子，在細(xì)胞周期調(diào)控及血管生成中起重要作用，與多種腫瘤發(fā)病及腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)；也可通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞中NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子[28-30]。本研究結(jié)果顯示，DUSP3基因在ATB組表達(dá)上調(diào)，可用于區(qū)分ATB和LTBI；LTBI組DUSP3基因表達(dá)高于健康對照組，該基因有望成為區(qū)分LTBI和健康人群的指標(biāo)之一。

本文研究結(jié)果顯示，DUSP3基因表達(dá)、TB評分可以作為區(qū)分ATB和LTBI的診斷依據(jù)，二者AUC分別為0.805和0.771，特異度分別為90.4%和88.5%，但靈敏度較低；以ATB為陽性、健康人群為陰性進(jìn)行ROC曲線分析，結(jié)果顯示，GBP5基因和KLF2基因表達(dá)在診斷ATB中有一定的診斷準(zhǔn)確性，AUC分別為0.710和0.724；DUSP3基因表達(dá)和TB評分的診斷效能高，AUC分別為0.962和0.929，且具有較高的靈敏度和特異度，有望成為診斷ATB的血液標(biāo)志物。本文研究預(yù)測LTBI時，DUSP3基因表達(dá)的AUC為0.712，靈敏度和特異度分別為59.6%、84.1%，以其作為診斷LTBI的指標(biāo)有一定臨床意義；KLF2基因、GBP5基因表達(dá)對ATB的診斷效能和既往研究結(jié)果相似，但DUSP3基因的診斷效能明顯高于既往研究[6]。

綜上所述，KLF2基因、GBP5基因表達(dá)單獨(dú)診斷ATB的效能不高，而DUSP3基因表達(dá)有較高的診斷價值，綜合3組基因表達(dá)的TB評分具有較高的診斷準(zhǔn)確性。本文研究標(biāo)本來源于受試者的外周靜脈血，標(biāo)本較痰液易獲取、污染概率更小，檢測周期短，尤其是對無痰病人，這為ATB的診斷提供了新的思路。DUSP3基因表達(dá)和TB評分用于區(qū)分ATB和LTBI有一定的臨床意義，因此DUSP3基因和TB評分有望成為ATB診斷的血液標(biāo)志物之一，對ATB的早期診斷、治療有重要的意義。對于LTBI的篩查，采集受試者外周血標(biāo)本操作較TST試驗方便，可降低人為因素帶來的誤差，價格也較IGRAs檢測低。DUSP3基因表達(dá)在預(yù)測LTBI時有一定效能，這為LTBI的篩查研究提供了一個新的方向。本研究存在以下缺陷：實驗樣本較少，需進(jìn)一步擴(kuò)大研究樣本以提高研究結(jié)果的準(zhǔn)確性；未追蹤ATB病人經(jīng)過治療后血液中相關(guān)基因表達(dá)量變化；未設(shè)置免疫缺陷組分析免疫功能對3組基因表達(dá)的影響。