基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討黃芪治療子宮內(nèi)膜癌的機制

姜丕雨,李康康,周靜祎,王雪蓮,程明陽,陳雪紅

(青島大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院特種醫(yī)學(xué)系,山東 青島 266071)

子宮內(nèi)膜癌(EN)是發(fā)生在子宮內(nèi)膜的一組上皮性惡性腫瘤，是女性生殖系統(tǒng)常見惡性腫瘤之一，且近幾年EN的發(fā)病率逐漸上升[1]。EN發(fā)病與多種因素有關(guān)，目前針對EN治療以手術(shù)為主，輔以放療和化療[2]。但化療藥物具有較強的毒副作用，而中藥抗腫瘤具有多靶點、多方位以及不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點，在臨床上已成為腫瘤治療的重要研究方向[3]。近年來臨床上將黃芪應(yīng)用于多種腫瘤的治療，效果顯著，且有體外細胞實驗證明黃芪對EN細胞有較強的抑制作用[4]。本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，系統(tǒng)地探究黃芪的有效活性成分、潛在作用靶點以及調(diào)控的通路信息，為黃芪治療EN提供理論依據(jù)?，F(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料和方法

1.1 黃芪成分篩選

以“黃芪”為關(guān)鍵詞，以口服生物利用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.18為活性成分篩選條件，檢索中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺(TCMSP)[5]數(shù)據(jù)，獲得黃芪的有效活性成分。

1.2 活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

使用Uniprot數(shù)據(jù)庫校正與轉(zhuǎn)化功能，將查詢到的黃芪活性成分轉(zhuǎn)換成靶蛋白的規(guī)范名稱。將活性成分-靶點關(guān)聯(lián)信息導(dǎo)入到Cytoscape 3.7.0軟件，處理黃芪的活性成分和靶點的相關(guān)信息，從而構(gòu)建出黃芪活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖。

1.3 EN相關(guān)靶點檢索

以“endometrial carcinoma”為關(guān)鍵詞，檢索Genecards數(shù)據(jù)庫[6]、在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(OMIM數(shù)據(jù)庫)[7]等疾病基因數(shù)據(jù)庫，匯總疾病靶點并去除重復(fù)值，得到EN相關(guān)作用靶點。

1.4 蛋白質(zhì)互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及關(guān)鍵靶點篩選

選用Cytoscape 3.7.0軟件中的Biogenet插件構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。分別將黃芪有效活性成分的靶點與EN的相關(guān)靶點導(dǎo)入Biogenet中，生成兩個獨立的PPI網(wǎng)絡(luò)，使用Cytoscape軟件中Merge功能對這兩個PPI網(wǎng)絡(luò)取交集，使用CytoNCA插件分析PPI交集網(wǎng)絡(luò)中各個節(jié)點的屬性值。

1.5 生物通路富集分析

應(yīng)用Metascape在線分析平臺[8]對靶點進行通路富集分析，解析黃芪中抗EN活性成分顯著影響的生物通路，并探討其發(fā)揮抗EN作用的可能機制。

2 結(jié) 果

2.1 黃芪活性成分及靶點獲取

從TCMSP數(shù)據(jù)庫獲取到87個黃芪成分，根據(jù)OB≥30%和DL≥0.18篩選得到17個成分。其具體信息見表1。

表1 黃芪候選活性成分

2.2 黃芪活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

將TCMSP查詢到的黃芪活性成分與相關(guān)靶點的關(guān)聯(lián)數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.0軟件，得到黃芪活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖(圖1)。共獲得216個節(jié)點(包含198個靶點、17個活性成分和1個代表黃芪的節(jié)點)與427條關(guān)系，圖中節(jié)點面積大小代表相應(yīng)的Degree值，面積越大代表Degree值越大，表示與此點連接的邊越多，其重要性越高。

2.3 EN疾病靶點

檢索Genecards和OMIM數(shù)據(jù)庫分別得到靶點個數(shù)為1 651個和196個。匯總靶點并去除重復(fù)靶點，最終收集到1 845個疾病靶點。

2.4 黃芪治療EN的PPI網(wǎng)絡(luò)與關(guān)鍵靶點

2.4.1黃芪治療EN的PPI網(wǎng)絡(luò) 運用Cytoscape 3.7.0構(gòu)建黃芪PPI網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果顯示，可以與黃芪產(chǎn)生直接或間接作用的靶點為6 304個，6 304個靶點之間可產(chǎn)生的相互關(guān)系多達153 949種。同樣對EN的相關(guān)靶點繪制PPI網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果顯示有13 172個靶點與EN可產(chǎn)生直接或者間接的關(guān)系，其間的相互關(guān)系高達243 806種。用Cytoscape 3.7.0中的Merge功能對二者取交集，交集網(wǎng)絡(luò)見圖2。

2.4.2黃芪治療EN的關(guān)鍵靶點 對黃芪治療EN的PPI交集網(wǎng)絡(luò)進行拓撲屬性分析，篩選出在網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮重要作用的靶點。黃芪治療EN關(guān)鍵靶點見圖3。經(jīng)過2次篩選后，共獲得關(guān)鍵靶點238個，關(guān)鍵靶點的篩選策略見圖4。在得到核心PPI網(wǎng)絡(luò)后，應(yīng)用 MCODE插件對PPI模塊進行分析，得到了MCODE1～7共7個模塊，見圖5。根據(jù)P值，分別保留每個模塊中2個評分最佳的生物學(xué)進程以及描述功能，見表2。

2.5 黃芪治療EN的通路富集分析

應(yīng)用Metascape平臺對上述238個關(guān)鍵靶點進行了基因富集分析， 包括GO的Biological Process(BP)、Cellular Component (CC)、Molecular Function(MF)以及KEGG通路。分析結(jié)果顯示，黃芪治療EN主要涉及的生物學(xué)過程包括端粒結(jié)構(gòu)(Telomere organization)、DNA修復(fù)(DNA repair)、DNA復(fù)制依賴性核小體裝配(DNA replication-dependent nucleosome assembly)、DNA復(fù)制依賴性核小體結(jié)構(gòu)(DNA replication-dependent nucleosome organization)、蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物組裝(Protein-DNA complex assembly)、rDNA染色質(zhì)沉默(chro-matin silencing at rDNA)和基因沉默調(diào)控(regula-tion of gene silencing)等。這些過程直接作用于細胞損傷的修復(fù)和凋亡環(huán)節(jié)，表明黃芪對于EN細胞的修復(fù)和凋亡具有直接的調(diào)控作用。KEGG通路富集結(jié)果涉及病毒性癌癥(Viral carcinogenesis)、EB病毒感染(Epstein-Barr virus infection)、細胞周期(Cell cycle)、PI3K-Akt信號通路(PI3K-Akt signaling pathway)、癌癥轉(zhuǎn)錄失調(diào)(Transcriptional misregulation in cancer)、信號通路(Pathways in cancer)、MicroRNA(MicroRNAs in cancer)、HIF-1通路(HIF-1 signaling pathway)、Jak-STAT信號通路(Jak-STAT signaling pathway)、ErbB信號通路(ErbB signaling pathway)和蛋白聚糖(Proteoglycans in cancer)等。見圖6。

A：GO-BP分析；B：GO-CC分析；C：GO-MF分析；D：KEGG分析。氣泡顏色由紅色到綠色代表P值由大到小，越大代表顯著性越強；氣泡大小代表富集到該通路的基因數(shù)目，越大代表該通路的基因計數(shù)(Count值)越大；橫軸代表該通路基因所占總體基因的比值(Rich Factor)。

3 討 論

本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，初步探究了黃芪治療EN的活性成分、作用靶點及相關(guān)聯(lián)的生物學(xué)通路。根據(jù)OB≥30%和DL≥0.18，共篩選出黃芪活性成分17個，繪制上述活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖共獲得198個靶點和427條相互關(guān)系。由此可知，黃芪的有效成分之間存在協(xié)同作用，而協(xié)同調(diào)控的靶點也在EN發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，具有用于治療EN的潛力。

本文結(jié)果顯示，黃芪治療EN的主要成分可能為槲皮素、山奈酚、黃芪異黃烷苷等。其中，槲皮素可誘導(dǎo)腫瘤細胞過表達胱硫氨酸γ-裂解酶(CTH)從而誘導(dǎo)細胞凋亡[9]；山奈酚可激活Caspase 9和誘導(dǎo)細胞凋亡[10]，同時也可以上調(diào)p38、p53、p21、p-BRCA1和p-ATM等抑癌基因的表達，抑制腫瘤細胞增殖[11]。

3.1 關(guān)鍵靶點結(jié)果分析

本文研究按照篩選策略共得到238個潛在關(guān)鍵靶點。根據(jù)Degree值排序，其中較為重要的靶點有NTRK1、TP53和CUL3等。有研究表明，NTRK1基因可編碼原肌球蛋白受體激酶(TRK)家族中的TRKA蛋白，TRKA蛋白與神經(jīng)營養(yǎng)素結(jié)合后，通過PI3K、Ras/MAPK/ERK和PLC-γ誘導(dǎo)受體二聚化、磷酸化和下游信號級聯(lián)激活。由于基因融合或核苷酸突變所導(dǎo)致的TRK通路異常，是許多癌癥發(fā)生發(fā)展的重要原因[12]。抑癌基因TP53可以轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)編碼FAS基因以及其他可能編碼相關(guān)死亡受體的基因，還可通過PUMA和NOXA介導(dǎo)細胞凋亡從而發(fā)揮顯著的腫瘤抑制功能[13]。CUL3屬于Cullin蛋白家族，可參與多種細胞過程，包括細胞分裂、分化、細胞骨架重塑、應(yīng)激反應(yīng)和神經(jīng)細胞功能等，也與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[14]。提示黃芪可通過多靶點來影響EN發(fā)生和發(fā)展過程。

表2 黃芪治療EN關(guān)鍵靶點潛在module功能描述(前2位)

3.2 通路與生物進程分析

本文生物進程富集分析結(jié)果顯示，黃芪治療EN涉及的生物學(xué)進程包括端粒結(jié)構(gòu)、DNA修復(fù)、DNA復(fù)制依賴性核小體裝配、DNA復(fù)制依賴性核小體組織、蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物組裝、rDNA染色質(zhì)沉默、細胞凋亡信號通路、基因沉默調(diào)控等。這些進程與細胞修復(fù)和凋亡直接相關(guān)。這表明黃芪可能通過干擾EN細胞的修復(fù)和促進其凋亡來發(fā)揮作用。

本文通路富集分析結(jié)果顯示，黃芪可干預(yù)病毒致癌、細胞周期、PI3K-Akt通路、MicroRNA、HIF-1通路、Jak-STAT信號通路、蛋白聚糖、ErbB通路等，調(diào)控EN病理過程中的不同環(huán)節(jié)。

綜上所述，黃芪治療EN的主要成分可能是槲皮素、山奈酚和黃芪異黃烷苷等，關(guān)鍵作用靶點有NTRK1、TP53、CUL3等和涉及細胞周期、DNA修復(fù)、細胞凋亡、癌癥通路等多個生物學(xué)過程和信號通路。黃芪通過多成分-多靶點-多通路的方式來干預(yù)EN的發(fā)生和發(fā)展，體現(xiàn)了中藥治療疾病的整體性與系統(tǒng)性。