微流控技術(shù)與全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)糖化血清白蛋白的方法比對(duì)

沃燕波

（寧波職業(yè)技術(shù)學(xué)院乙烯工程副產(chǎn)物高質(zhì)化利用浙江省應(yīng)用技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，浙江寧波 315800）

糖尿病治療的關(guān)鍵是對(duì)患者的血糖水平進(jìn)行有效監(jiān)測(cè)與控制，糖化血清白蛋白（glyecated albumin，GA）是葡萄糖與血漿中白蛋白結(jié)合形成的酮胺類化合物，是一項(xiàng)反映過(guò)去2-3 周平均血糖水平的指標(biāo)，其所反映的平均血糖水平周期比目前公認(rèn)的血糖檢測(cè)“金標(biāo)準(zhǔn)”——糖化血紅蛋白要更短一些，因此，相較于糖化血紅蛋白，對(duì)其進(jìn)行測(cè)定更有利于對(duì)治療效果的及時(shí)確認(rèn)，以及臨床用藥量的及時(shí)調(diào)整[1-2]。本文按照NCCLS文件EP9-A2要求，對(duì)課題組研制開(kāi)發(fā)的基于微流控技術(shù)的GA檢測(cè)試劑和全自動(dòng)生化分析儀的GA檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行了比對(duì)研究[3-4]，以評(píng)判兩方法在檢測(cè)GA時(shí)測(cè)定結(jié)果的可比性，報(bào)道如下：

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本收集

收集檢測(cè)范圍內(nèi)均勻分布的無(wú)溶血、黃疸、乳糜的新鮮GA血清標(biāo)本，共40份。

1.1.2 試劑

GA檢測(cè)試劑，批號(hào)：2020112301；白蛋白檢測(cè)試劑，批號(hào)：2020120302，均為阿里生物技術(shù)泰州有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 儀器

日立7180全自動(dòng)生化分析儀。

1.2 方法

1.2.1 基于微流控技術(shù)的GA檢測(cè)試劑的測(cè)試步驟

將樣本通過(guò)加樣孔加入樣本槽，啟動(dòng)測(cè)定后，試劑1經(jīng)自動(dòng)釋放至試劑1槽，隨后儀器自動(dòng)離心使試劑1進(jìn)入定量槽，樣本實(shí)現(xiàn)分離并進(jìn)入樣本定量槽，接著儀器進(jìn)行二次離心使定量槽的樣本和試劑1混合均勻，混合液之后會(huì)進(jìn)入分離流道，填充至預(yù)裝有試劑2的比色孔進(jìn)行測(cè)定。

1.2.2 樣本測(cè)定

每天測(cè)定8份新鮮血清樣本，要求盡量在檢測(cè)范圍內(nèi)均勻分布。隨機(jī)對(duì)樣本按1到8的順序編號(hào)，用兩種方法同時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。為減少交叉污染及漂移對(duì)樣本測(cè)定的影響，按照1，2，3，4，5，6，7，8，8，7，6，5，4，3，2，1的順序進(jìn)行。連續(xù)5d，共測(cè)定40份樣本。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果的記錄

記錄測(cè)定結(jié)果：Xij和Yij，其中：Xij 為全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定值，Yij為微流控技術(shù)系統(tǒng)測(cè)定值，i為樣本序號(hào)（1、2、3…40），j為同一份樣本的測(cè)定次序（1、2）。計(jì)算每個(gè)樣本測(cè)定的均值，樣本重復(fù)測(cè)定間差值的絕對(duì)值及兩種方法測(cè)定結(jié)果間的均值 差值。

1.2.4 離群點(diǎn)檢查

（1）組內(nèi)離群點(diǎn)檢查：按照文件要求，計(jì)算樣本重復(fù)測(cè)定間差值絕對(duì)值的平均數(shù)，若某樣本重復(fù)測(cè)定間差值超出了該平均數(shù)的4倍時(shí)，則判斷該樣本為組內(nèi)離群點(diǎn)。

（2）組間離群點(diǎn)檢查：計(jì)算兩種方法測(cè)定結(jié)果間均值差值絕對(duì)值的平均數(shù)，如某樣本兩種方法測(cè)定結(jié)果間均值差值超出該平均數(shù)4倍時(shí)，則判斷該樣本為組間離群點(diǎn)。

如離群點(diǎn)超過(guò)1個(gè)時(shí)，整組數(shù)據(jù)應(yīng)舍棄，尋找原因后重新進(jìn)行評(píng)價(jià)。如離群點(diǎn)為1個(gè)，可以補(bǔ)充數(shù)據(jù)后重新進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.2.5 作圖及線性關(guān)系的目測(cè)檢查

（1）散點(diǎn)圖1：以微流控技術(shù)系統(tǒng)每份樣本雙份測(cè)定的均值為Y軸；以全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)系統(tǒng)每份樣本份測(cè)定的均值為X軸作散點(diǎn)圖1；

（2）散點(diǎn)圖2：以微流控技術(shù)系統(tǒng)每份樣本雙份測(cè)定值為Y軸，以全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)系統(tǒng)每份樣雙份測(cè)定的均值為X軸作散點(diǎn)圖2；

（3）偏倚圖1：以（Yi-Xi）為Y軸；X軸為（Yi+ Xi）/2，以直線X=0做水平中線偏倚圖1；

（4）偏倚圖2：以（Yij-Xi）為Y軸；X軸為（Yi+ Xi）/2，以直線X=0作為水平中線偏倚圖2。

圖2 基于微流控技術(shù)的GA檢測(cè)試劑與全自動(dòng)生化分析儀GA各次測(cè)定結(jié)果的散點(diǎn)圖

通過(guò)目測(cè)觀察散點(diǎn)圖是否呈線性，并判斷偏倚圖中數(shù)據(jù)的離散程度是否均勻。

1.2.6 X值合適范圍的檢驗(yàn)

根據(jù)文件進(jìn)行相關(guān)系數(shù)計(jì)算[3-4]，如果r≥0.975，則認(rèn)為選擇的數(shù)據(jù)范圍適合，數(shù)據(jù)能滿足測(cè)定要求，否則，則認(rèn)為選擇的數(shù)據(jù)范圍不適合，數(shù)據(jù)不能滿足測(cè)定要求，需要擴(kuò)大檢測(cè)數(shù)據(jù)范圍。

1.2.7 線性回歸分析

根據(jù)文件[3-4]，計(jì)算兩個(gè)方法間的線性回歸方程：Y=a+bX。

1.2.8 預(yù)期偏倚及可信區(qū)間計(jì)算

以10%為允許誤差，按文件要求[3-4]，計(jì)算GA濃度為16%時(shí)的預(yù)期偏倚及95%可信區(qū)間。當(dāng)預(yù)期偏差可信區(qū)間的上限＞允許誤差＞預(yù)期偏差可信區(qū)間的下限時(shí)，表示基于微流控技術(shù)的GA檢測(cè)試劑的檢測(cè)結(jié)果與全自動(dòng)生化分析儀的檢測(cè)結(jié)果相當(dāng)；當(dāng)允許誤差＞預(yù)期偏差可信區(qū)間的上限時(shí)，表示基于微流控技術(shù)的GA檢測(cè)試劑的檢測(cè)結(jié)果與全自動(dòng)生化分析儀的檢測(cè)結(jié)果相當(dāng)，偏差可以接受；當(dāng)允許誤差＜預(yù)期偏差可信區(qū)間的下限時(shí)，表示基于微流控技術(shù)的GA檢測(cè)試劑的檢測(cè)結(jié)果與全自動(dòng)生化分析儀的檢測(cè)結(jié)果不相當(dāng)，偏差不能接受。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Excel軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理及作圖分析。

2 結(jié)果

2.1 測(cè)定結(jié)果

根據(jù)文件[3-4]，計(jì)算兩種方法每個(gè)樣本測(cè)定的均值，樣本重復(fù)測(cè)定間差值的絕對(duì)值及測(cè)定結(jié)果間的均值差值，結(jié)果如下表所示：

表1 兩種方法測(cè)定結(jié)果

2.2 離群點(diǎn)檢查

根據(jù)文件[3-4]，若某樣本重復(fù)測(cè)定間差值超出了樣本重復(fù)測(cè)定間差值絕對(duì)值的平均數(shù)的4倍，則判斷該樣本為組內(nèi)離群點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，微流控技術(shù)方法樣本重復(fù)測(cè)定間差值絕對(duì)值的平均數(shù)為3.4，4倍的平均數(shù)的值為13.6，經(jīng)檢查發(fā)現(xiàn)未有樣本的重復(fù)測(cè)定間差值超出13.6，說(shuō)明微流控技術(shù)方法沒(méi)有組內(nèi)離群點(diǎn)；全自動(dòng)生化分析儀法樣本重復(fù)測(cè)定間差值絕對(duì)值的平均數(shù)為3.2，4倍的平均數(shù)的值為12.8，經(jīng)檢查發(fā)現(xiàn)未有樣本的重復(fù)測(cè)定間差值超出12.8，說(shuō)明全自動(dòng)生化分析儀法沒(méi)有組內(nèi)離群點(diǎn)。

若某樣本兩種方法測(cè)定結(jié)果間均值差值超出兩種方法測(cè)定結(jié)果間均值差值絕對(duì)值的平均數(shù)的4倍時(shí)，則判斷該樣本為組間離群點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，兩種方法測(cè)定結(jié)果間均值差值絕對(duì)值的平均數(shù)為1.7，4倍的平均數(shù)的值為6.8，經(jīng)檢查發(fā)現(xiàn)未有樣本的兩種方法測(cè)定結(jié)果間均值差值超出6.8，說(shuō)明沒(méi)有組間離 群值。

2.3 散點(diǎn)圖、偏倚圖分析

以全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)系統(tǒng)的測(cè)定結(jié)果為X，基于微流控技術(shù)的GA檢測(cè)試劑的檢測(cè)結(jié)果為Y，作散點(diǎn)圖和偏倚圖；如下圖所示：圖1、2為基于微流控技術(shù)的GA檢測(cè)試劑與全自動(dòng)生化分析儀GA濃度檢測(cè)的散點(diǎn)圖，目測(cè)可見(jiàn)基于微流控技術(shù)的GA檢測(cè)試劑的測(cè)定值與全自動(dòng)生化分析儀GA測(cè)定值呈直線關(guān)系，說(shuō)明兩方法相關(guān)性較好。

圖1 基于微流控技術(shù)的GA檢測(cè)試劑與全自動(dòng)生化分析儀GA重復(fù)測(cè)定均值的散點(diǎn)圖

圖3、4為基于微流控技術(shù)的GA檢測(cè)試劑與全自動(dòng)生化分析儀GA濃度檢測(cè)的偏倚圖，從圖中可以看出，基于微流控技術(shù)的GA檢測(cè)試劑與全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定同一份血清時(shí)差值較小，分布較為合理，說(shuō)明兩方法間結(jié)果不存在差異。

圖3 基于微流控技術(shù)的GA檢測(cè)試劑與全自動(dòng)生化分析儀GA重復(fù)測(cè)定均值偏差圖

圖4 基于微流控技術(shù)的GA檢測(cè)試劑與全自動(dòng)生化分析儀GA各次測(cè)定結(jié)果偏差圖

2.4 X值合適范圍的檢驗(yàn)及線性回歸分析

結(jié)果顯示，基于微流控技術(shù)的GA檢測(cè)試劑與全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定GA的相關(guān)系數(shù)r=0.9889，大于文件規(guī)定的0.975，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)選擇的數(shù)據(jù)范圍適合，能滿足測(cè)定要求。兩方法的線性回歸方程為 Y=1.1151+0.9901X。

2.5 偏差估計(jì)

結(jié)果顯示，當(dāng)GA的濃度為16%時(shí)，計(jì)算得允許偏倚為1.6%，預(yù)期偏差95%可信區(qū)間下限為0.0749%，預(yù)期偏差95%可信區(qū)間上限為1.8390%。預(yù)期偏差可信區(qū)間的下限＜允許誤差＜預(yù)期偏差可信區(qū)間的上限，說(shuō)明基于微流控技術(shù)的GA檢測(cè)試劑與全自動(dòng)生化分析儀對(duì)GA檢測(cè)的結(jié)果偏倚可接受，檢測(cè)結(jié)果具有良好的可比性。

3 討論

糖尿病是我國(guó)最常見(jiàn)的慢性病之一，其特點(diǎn)是病程長(zhǎng)、難治愈、需要定期監(jiān)測(cè)和長(zhǎng)期管理，控制方法除確?；颊呦嚓P(guān)檢測(cè)指標(biāo)在合理范圍外，還要確保這些指標(biāo)不能有反復(fù)過(guò)大波動(dòng)，否則將對(duì)患者身體健康帶來(lái)極大損害[5]。為加強(qiáng)對(duì)糖尿病等慢性病的防治工作，國(guó)務(wù)院辦公廳于2017年印發(fā)并實(shí)施了《中國(guó)防治慢性病中長(zhǎng)期規(guī)劃（2017—2025 年）》，指出：社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心和鄉(xiāng)鎮(zhèn)衛(wèi)生院要逐步提供血糖等常規(guī)項(xiàng)目的檢測(cè)服務(wù)。

據(jù)國(guó)家統(tǒng)計(jì)局發(fā)布的 《中華人民共和國(guó)2020年國(guó)民經(jīng)濟(jì)和社會(huì)發(fā)展統(tǒng)計(jì)公報(bào)》顯示，至2020年末，全國(guó)共有醫(yī)療衛(wèi)生機(jī)構(gòu)102.3萬(wàn)個(gè)，其中醫(yī)院3.5萬(wàn)個(gè)，基層醫(yī)療衛(wèi)生機(jī)構(gòu)97.1萬(wàn)個(gè)。我國(guó)的基層醫(yī)療衛(wèi)生機(jī)構(gòu)的數(shù)目遠(yuǎn)大于醫(yī)院的數(shù)目，占比高達(dá)95%，但診療人次占比僅為55%。設(shè)備配置不足、設(shè)施落后、技術(shù)不足，常規(guī)檢驗(yàn)方法實(shí)施難度大，效率低，開(kāi)展困難，是就診人次偏低的主要原因之一。2021年2月21日，中央一號(hào)文件《中共中央國(guó)務(wù)院關(guān)于全面推進(jìn)鄉(xiāng)村振興加快農(nóng)業(yè)農(nóng)村現(xiàn)代化的意見(jiàn)》正式發(fā)布，明確指出要全面提升基層衛(wèi)生服務(wù)水平。而目前基層醫(yī)療服務(wù)體系建設(shè)中，最為迫切的問(wèn)題之一就是重要疾病和常見(jiàn)病診斷方面的能力建設(shè)，這就需要有適合基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)的快速簡(jiǎn)便的實(shí)驗(yàn)診斷體系。

微流控芯片技術(shù)是21世紀(jì)最為重要的前沿技術(shù)之一，其主要功能是在微米級(jí)的流道內(nèi)精準(zhǔn)的操縱微升或納升體積的液體，并且進(jìn)行分離、定量、混合等功能，用戶只需注入樣品并啟動(dòng)系統(tǒng)，即可完成檢測(cè)。微流控芯片系統(tǒng)微型化、集成化和自動(dòng)化的特點(diǎn)使得它很適合應(yīng)用于現(xiàn)場(chǎng)和個(gè)體分析。微流控技術(shù)按實(shí)現(xiàn)的載體形式，簡(jiǎn)單的可以分為盤式，卡式，片式和液滴式。相比于其他3種平臺(tái)，盤式微流控技術(shù)能很方便實(shí)現(xiàn)全血分離及多人份多指標(biāo)檢測(cè)，具有集成度高、檢測(cè)速度快、檢測(cè)精度高、檢測(cè)成本低等特點(diǎn)[12-13]。離心式微流控盤式芯片通過(guò)離心力驅(qū)動(dòng)進(jìn)行微流體的操控，不需要特殊的設(shè)備，容易實(shí)現(xiàn)。而且運(yùn)用盤片芯片設(shè)計(jì)，可以進(jìn)行平行化操作，即可同時(shí)對(duì)多個(gè)檢測(cè)單元實(shí)現(xiàn)微流體的控制和檢測(cè)，因此速度快、通量高且容易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，適用于多指標(biāo)或多樣本檢測(cè)，可用于中通量或高通量的樣品檢測(cè)。

為了評(píng)估本課題組開(kāi)發(fā)的離心式微流控盤式GA檢測(cè)芯片與全自動(dòng)生化分析儀的測(cè)定結(jié)果間是否存在誤差，我們根據(jù)CLSI EP9-A2文件的流程[3-4]，對(duì)本課題組開(kāi)發(fā)的基于微流控技術(shù)的GA檢測(cè)試劑的測(cè)定結(jié)果與全自動(dòng)生化分析儀乙醇的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行了比對(duì)，結(jié)果顯示，兩方法檢測(cè)結(jié)果的重復(fù)性均較好，沒(méi)有方法內(nèi)和方法間離群值，當(dāng)以全自動(dòng)生化儀的檢測(cè)系統(tǒng)為比較方法時(shí)，本課題組開(kāi)發(fā)的基于微流控技術(shù)的GA檢測(cè)試劑的測(cè)定結(jié)果與其線性關(guān)系良好，說(shuō)明兩方法間的相關(guān)性較好。進(jìn)一步通過(guò)偏差估計(jì)發(fā)現(xiàn)，本課題組開(kāi)發(fā)的基于微流控技術(shù)的GA檢測(cè)試劑測(cè)定結(jié)果與全自動(dòng)生化分析儀的偏倚可接受，說(shuō)明兩方法間的檢測(cè)結(jié)果具有良好的可比性。