基于特征肽測定阿膠食品中的5種雜皮源成分

趙艷霞，鞏麗萍，石峰，杭寶建，羅學(xué)剛

（1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457）（2.山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院，山東濟(jì)南 250101）

阿膠為我國傳統(tǒng)中藥[1]，同時(shí)為山東省地方特色產(chǎn)品。阿膠是以馬科動物驢的干燥皮或鮮皮經(jīng)煎煮、濃縮制成的固體膠，其主要成分為驢皮膠原蛋白。市面上的阿膠食品主要有阿膠糕、阿膠漿、阿膠口服液、阿膠膏等（為方便研究對象分類將液態(tài)阿膠食品統(tǒng)稱為阿膠飲品）。這些阿膠產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊，價(jià)格也相差甚遠(yuǎn)。原因在于，阿膠生產(chǎn)企業(yè)皮源材料不同，部分不法企業(yè)采用馬、牛、豬等雜皮冒充或是皮革加工過程中割下來廢棄的頭臉皮和腿腳皮等下腳料投料，而非整張?bào)H皮投料生產(chǎn)，并且現(xiàn)有檢測標(biāo)準(zhǔn)不能很好地控制和反映產(chǎn)品品質(zhì)。

阿膠糕是以阿膠、核桃仁、黑芝麻、紅棗、枸杞或其他可用于食品的普通食品原料或衛(wèi)生部批準(zhǔn)的允許使用的新食品原料為原料，添加冰糖、黃酒等輔料，經(jīng)原料處理、配料、熬制、冷卻、切片、包裝等加工工藝制成的含阿膠類食品。阿膠飲品是以阿膠、水為主要原料，添加或不添加大棗、枸杞、人參等中藥材，采用現(xiàn)代提取、分離、精制技術(shù)研制而成的產(chǎn)品，主要包括阿膠漿、阿膠口服液、阿膠膏等。作為阿膠的衍生品，阿膠糕及阿膠飲品極具山東地方特色。

目前動物皮源成分的檢測方法主要有熒光定量PCR法、液質(zhì)聯(lián)用法等[2-9]，這些方法大多用于動物皮及原料阿膠的檢測。針對阿膠糕及阿膠飲品中馬皮等雜皮源成分的檢測方法，目前尚無相關(guān)國家、地方標(biāo)準(zhǔn)發(fā)布。

本研究通過獲取動物皮源特征肽段的分子量信息采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)種類的鑒別，方法簡便、快速、準(zhǔn)確、靈敏，可有效控制阿膠食品的摻假現(xiàn)象，提升產(chǎn)品品質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 主要儀器設(shè)備

AB SCIEX Triple Quad 6500+超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國AB公司；CP225D電子天平，美國賽得利斯公司；渦旋振蕩器，大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；KQ-300GDV型恒溫超聲儀，昆山市超聲儀器有限公司；超純水儀，美國Millipore公司。

1.1.2 主要耗材和試劑

乙腈（色譜純），美國Fisher公司；甲酸（質(zhì)譜級），美國ACS恩科化學(xué)公司；丙酮（分析純），國藥集團(tuán)；三氯乙酸（分析純），天津市科密歐化學(xué)試劑公司；胰蛋白酶（序列分析純），Sigma公司；碳酸氫銨（分析純），國藥集團(tuán)；去離子水。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：阿膠對照藥材、馬源寡肽A（C31H54N12O11），購于中國食品藥品檢定研究院，純度≥90.0%；牛源特征肽（C34H55N13O13）、豬源特征肽（C34H58N12O11）、駱駝源特征肽（C61H93N17O25）、鹿源特征肽（C61H93N17O25），由上海強(qiáng)耀生物有限公司合成，純度≥90.0%。

樣品：不同廠家阿膠糕樣品共19批次，不同廠家阿膠飲品（包括阿膠漿、阿膠口服液、阿膠膏）共10批次。

1.2 儀器主要工作條件

色譜參數(shù)：色譜柱為Waters BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，2.5 μm），流動相A為0.1%甲酸水溶液，流動相B為0.1%甲酸乙腈溶液，梯度洗脫程序：0～1.5 min，5% B；1.5～6 min，5% B～50% B；6～6.1 min，50% B～70% B；6.1～8 min，70% B；8～8.1 min，70%B～5% B；8.1～12 min，5% B。流速0.3 mL/min，柱溫40 ℃，進(jìn)樣量2 μL。

質(zhì)譜參數(shù)：離子源：電噴霧離子源（ESI）；掃描模式：正離子掃描；多反應(yīng)監(jiān)測；渦旋離子噴霧溫度：550 ℃；離子化電壓：5500 V；氣簾氣：35；霧化氣：50；輔助加熱氣：55；入口電壓：10 V；碰撞室出口電壓：19 V；碰撞氣：9；其他質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 各特征肽的質(zhì)譜采集離子信息Table 1 Ion information of five marker peptides acquired by mass spectrometry

1.3 溶液配制

稀釋液：取碳酸氫銨適量，加水溶解并稀釋制成10 mg/mL的溶液，密閉保存。

胰蛋白酶溶液：取胰蛋白酶適量，加稀釋液溶解并稀釋制成1 mg/mL的溶液，臨用現(xiàn)配。

各雜皮特征肽標(biāo)準(zhǔn)儲備液：準(zhǔn)確稱取馬源寡肽A、牛源特征肽、豬源特征肽、駱駝源特征肽、鹿源特征肽對照品適量，精密稱定，加稀釋液溶解并稀釋制成1 mg/mL的溶液。

阿膠基質(zhì)溶液：取阿膠對照藥材粉末適量，精密稱定，加稀釋液溶解并稀釋制成0.2 mg/mL的溶液。

各雜皮特征肽中間工作溶液：精密量取各雜皮特征肽標(biāo)準(zhǔn)儲備液適量，加阿膠基質(zhì)溶液稀釋制成4.0 μg/mL的溶液。

標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液：精密量取中間工作溶液適量，加阿膠基質(zhì)溶液稀釋，制成系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液。馬源寡肽A、鹿皮特征肽的濃度為5、10、50、100、200、500 ng/mL，牛皮特征肽、豬皮特征肽、駱駝皮特征肽的濃度為10、20、50、100、200、500 ng/mL。

酶解：精密量取各系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液1.00 mL，分別加胰蛋白酶溶液100 μL，搖勻，37 ℃恒溫酶解16 h，取出，冷卻至室溫，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，用于LC-MS/MS定量測定。

1.4 樣品前處理

阿膠糕：取試樣約50 g，冷凍放置過夜，取出，置于粉碎機(jī)中粉碎。稱取粉碎好的試樣1.0 g，置于50 mL塑料離心管中，精密加入稀釋液50 mL，超聲處理30 min，以8000 r/min離心10 min，精密量取上清液1 mL，加稀釋液稀釋至10 mL，搖勻，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾。

阿膠飲品：取試樣不少于100 mL（g），混勻。稱取混勻后的試樣2.0 g，精密稱定，置于15 mL塑料離心管中，精密加入稀釋液10 mL，搖勻。精密量取1 mL，加稀釋液稀釋至5.00 mL，搖勻，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾。

酶解：取上述濾液按照標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液酶解步驟進(jìn)行酶解，用于LC-MS/MS定量測定。

1.5 數(shù)據(jù)處理

標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液和樣品溶液通過液質(zhì)聯(lián)用儀進(jìn)行測試，以各特征肽峰面積為縱坐標(biāo)，以濃度為橫坐標(biāo)對標(biāo)準(zhǔn)工作溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，并計(jì)算樣品溶液中各雜皮源成分含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 專屬性

2.1.1 特征肽的發(fā)現(xiàn)

阿膠主要成分為驢皮膠原蛋白，皮類膠原蛋白主要由Ⅰ型膠原蛋白組成，占膠原蛋白總量的80%～85%。通過將驢與馬、牛、豬、駱駝、鹿的Ⅰ型膠原蛋白序列進(jìn)行blast多序列比對，找到不同物種膠原蛋白之間的差異序列，進(jìn)一步采用胰蛋白酶酶切膠原蛋白獲得物種相對的理論特征肽段，再通過高分質(zhì)譜對各特征肽進(jìn)行驗(yàn)證，對碎片進(jìn)行歸屬，找到各物種的特異性肽段[7]。

2.1.2 專屬性實(shí)驗(yàn)

以馬、牛、豬、駱駝、鹿皮模擬阿膠生產(chǎn)工藝分別熬制成獲得各物種的雜皮膠。以各雜皮膠樣品為陽性樣品，阿膠基質(zhì)溶液配制樣品溶液，按1.4項(xiàng)下進(jìn)行樣品制備，選擇馬、牛、豬、駱駝、鹿皮特征肽檢測離子對進(jìn)行測定。在馬、牛、豬、駱駝、鹿皮膠各色譜圖中特征肽相應(yīng)的保留時(shí)間位置上，均無其他物種的特征肽檢出，阿膠基質(zhì)溶液經(jīng)酶解處理后進(jìn)樣的色譜圖中，各特征肽相應(yīng)的的保留時(shí)間位置上均無各特征肽的的色譜峰，說明各雜皮膠的特征肽段具有物種特異性，專屬性強(qiáng)，對測定結(jié)果無干擾，見圖1。

2.2 樣品前處理?xiàng)l件的選擇

取粉碎后的阿膠糕樣品加入適量已知各雜皮肽含量的雜皮膠，用稀釋液溶解過濾，得到樣品濾液。取濾液之一以酸沉淀蛋白法進(jìn)行提取（平行3份）：采用30%三氯乙酸沉淀蛋白（準(zhǔn)確吸取試樣濾液4.00 mL，加入4.00 mL的30%三氯乙酸溶液，充分振蕩混勻，4 ℃靜置20 min，以8000 r/min離心5 min，棄上清，用2 mL冷丙酮洗滌沉淀，再離心5 min，棄丙酮清液；重復(fù)洗滌一次，得沉淀，室溫下置通風(fēng)櫥10 min揮干丙酮，制得提取物，向提取物中加稀釋液溶解并稀釋至15 mL，得提取物溶液，另一份濾液平行3份按照1.3項(xiàng)下酶解步驟進(jìn)行酶解測定。分別準(zhǔn)確吸取提取物溶液和樣品濾液各1.00 mL，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液酶解步驟進(jìn)行酶解，進(jìn)樣分析并計(jì)算各雜皮特征肽含量，結(jié)果顯示提取物溶液中馬、牛、豬、駱駝、鹿雜皮肽的平均含量分別為530、975、846、911、703 mg/kg，樣品濾液中為947、1523、1520、1518、1237 mg/kg，表明酸沉淀蛋白法回收率明顯低于樣品直接溶解稀釋法，后者更簡便、準(zhǔn)確度更高，所以樣品提取選擇采用直接溶解稀釋法。

阿膠飲品為液體樣品，基質(zhì)分散性好，通過向樣品中加入適量已知各雜皮肽含量的雜皮膠，進(jìn)行前處理后進(jìn)樣測定，各雜皮肽的回收率在92.6%～103.4%，表明直接稀釋提取可用于阿膠飲品的測定。

2.3 色譜條件的考察

本實(shí)驗(yàn)比較了不同色譜柱XBridge BEH C18（100 mm×2.1 mm，2.5 μm）、BEH C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）、BEH Shiled RP C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液兩種流動相體系對目標(biāo)化合物進(jìn)行分離的情況。結(jié)果表明不同色譜柱上各雜皮肽的保留時(shí)間不同，通過調(diào)節(jié)流動相的比例，均可實(shí)現(xiàn)與基質(zhì)中干擾組分的有效分離。樣品溶液經(jīng)酶解后有一定的基質(zhì)，填料粒徑越小的色譜柱壓力越大，隨著樣品測定次數(shù)增多，壓力會持續(xù)增加，影響色譜柱的壽命，同時(shí)也會對儀器產(chǎn)生影響，因此推薦使用填料粒徑相對大的XBridge BEH C18為分析色譜柱。前流動相相比后流動相得到的各雜皮肽的離子信號強(qiáng)度更高，多次進(jìn)樣的保留時(shí)間RSD值更小，保留行為更穩(wěn)定，分析原因?yàn)橛袡C(jī)相中酸的加入可使氫離子的濃度在梯度洗脫過程中保持穩(wěn)定，提高了被分析化合物的離子化效率和穩(wěn)定性。

2.4 質(zhì)譜條件的考察

將各雜皮肽標(biāo)準(zhǔn)溶液（4.0 μg/mL）通過蠕動泵（流速10 μL/min）進(jìn)樣，通過一級全掃描找到母離子，再通過二級全掃描找到二級碎片離子，不斷改變碰撞能使碎片離子響應(yīng)增強(qiáng)，通過優(yōu)化獲得最佳離子源參數(shù)，確定碎裂電壓及碰撞能量。按照《質(zhì)譜分析方法通則》（GB/T 6041-2020）的要求，選擇兩隊(duì)特征子離子對目標(biāo)化合物進(jìn)行定性定量分析，以信噪比高、峰形好、干擾小的離子對作為定量離子對進(jìn)行定量，以另一對離子對作為定性離子對，并同時(shí)應(yīng)用兩隊(duì)離子對進(jìn)行豐度比計(jì)算以定性分析。

2.5 胰蛋白酶酶解條件的考察

胰蛋白酶是膠原蛋白最常用水解酶，是一種肽鏈內(nèi)切酶，只斷裂賴氨酸或精氨酸的羧基參與形成的肽鍵，是特異性最強(qiáng)的蛋白酶，可特異性水解阿膠中的膠原蛋白。膠原蛋白水解后會得到大量多肽，通過比對篩選出可以用作定性定量分析的特征肽。為獲得高的酶解效率，以本實(shí)驗(yàn)室熬制的馬皮膠、牛皮膠、豬皮膠、駱駝皮膠、鹿皮膠作為樣品，按照1.3項(xiàng)阿膠基質(zhì)溶液制備雜皮膠溶液，再按照1.4項(xiàng)下酶解過程進(jìn)行酶解，固定酶解溫度（胰蛋白酶最適溫度37 ℃）和酶解時(shí)間[7]，以各雜皮肽的定量離子對峰面積考察不同濃度酶（0.25、0.5、1、2、4、5 mg/mL，各加100 μL）對測定結(jié)果的影響，結(jié)果見圖2。

由圖2可以看出，隨著酶濃度的逐漸增加，酶解效率也升高，逐漸達(dá)到平穩(wěn)。根據(jù)酶解效果確定試樣溶液加濃度為1 mg/mL的胰蛋白酶溶液100 μL。

2.6 方法的線性關(guān)系及定量限

取雜皮特征肽系列標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣，以各特征肽峰面積Y為縱坐標(biāo)，各特征肽對照品濃度（ng/mL）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明馬源寡肽A、鹿皮特征肽在5～500 ng/mL、牛皮特征肽、豬皮特征肽、駱駝皮特征肽在10～500 ng/mL濃度范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)r均大于0.999，各雜皮特征肽線性關(guān)系良好。將各雜皮特征肽標(biāo)準(zhǔn)溶液逐級稀釋，以10倍信噪比對應(yīng)的溶液濃度折合計(jì)算到阿膠糕、阿膠飲品中的定量限，結(jié)果見表2。

表2 各特征肽的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)及定量限Table 2 Linearity ranges,regression equations, correlation coefficients (r) and LOQs for the marker peptides

2.7 空白基質(zhì)的選擇

本研究實(shí)際樣品有阿膠糕、阿膠漿、阿膠口服液、阿膠膏等，樣品組成有一定差異，因此對不同的空白基質(zhì)進(jìn)行了考察。

阿膠糕空白基質(zhì)溶液：稱取粉碎好的陰性阿膠糕試樣1.0 g置于50 mL塑料離心管中，精密加入稀釋液50 mL，超聲處理30 min，以8000 r/min離心10 min，精密量取上清液稀釋10倍后作為阿膠糕空白基質(zhì)溶液。

阿膠飲品空白基質(zhì)：分別稱取阿膠漿、阿膠膏混勻后的試樣2.0 g，精密稱定，分別置于15 mL塑料離心管中，精密加入稀釋液10 mL，搖勻，精密量取上清液稀釋5倍后分別作為阿膠飲品空白基質(zhì)溶液。

按照1.3項(xiàng)下分別配制阿膠糕、阿膠漿、阿膠膏空白基質(zhì)標(biāo)曲，與阿膠基質(zhì)配制標(biāo)曲測定同一加標(biāo)后的阿膠糕、阿膠漿、阿膠膏樣品，不同空白基質(zhì)測定的樣品結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.96%～5.78%，差異較小。為操作方便，測定樣品時(shí)統(tǒng)一選擇了阿膠對照藥材作為空白基質(zhì)。

2.8 定量方式與基質(zhì)效應(yīng)評價(jià)

采用液質(zhì)聯(lián)用對復(fù)雜基質(zhì)樣品進(jìn)行分析，復(fù)雜基質(zhì)會對測定結(jié)果產(chǎn)生一定影響。因此，在建立方法時(shí)需對基質(zhì)效應(yīng)（ME）進(jìn)行評價(jià)[10-12]。本方法測定的目標(biāo)物為阿膠通過胰蛋白酶酶解產(chǎn)生的各雜皮源特征肽，故以阿膠對照藥材為基質(zhì)評估基質(zhì)效應(yīng)。分別用稀釋液和阿膠基質(zhì)溶液按1.3項(xiàng)下分別配制標(biāo)準(zhǔn)曲線，將以阿膠基質(zhì)溶液配制的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液進(jìn)行酶解處理，分別進(jìn)樣測定，評估基質(zhì)效應(yīng)，結(jié)果顯示馬、牛、豬、駱駝、鹿雜皮特征肽的的絕對基質(zhì)效應(yīng)分別為21.0%、25.6%、22.3%、23.7%、21.9%，均大于20.0%，說明有一定的基質(zhì)效應(yīng)，因此本方法采用基質(zhì)匹配的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行測定，確保定量結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2.9 各特征肽溶液的穩(wěn)定性

考察了各雜皮特征肽標(biāo)準(zhǔn)溶液（濃度為100 ng/mL）的穩(wěn)定性。分別考察了液相進(jìn)樣室溫度15 ℃下，放置時(shí)間為0、2、4、6、8、12 h時(shí)，目標(biāo)肽段的峰面積變化情況，各雜皮特征肽峰面積的RSD值均小于5.0%，說明各雜皮特征肽穩(wěn)定性好。

2.10 回收率和精密度

對馬皮膠、牛皮膠、豬皮膠、駱駝皮膠、鹿皮膠按照1.3項(xiàng)阿膠基質(zhì)溶液制備雜皮膠溶液，再按照酶解過程酶解后進(jìn)樣測定，得到各雜皮膠中特征肽的準(zhǔn)確含量。通過向阿膠糕、阿膠飲品樣品中添加5%、10%、50%三個(gè)濃度水平的雜皮膠，平行測定6次，每個(gè)水平平均回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差結(jié)果見表3。各雜皮肽的平均加標(biāo)回收率在86.8%～103.5%，RSD值均小于10%，能夠滿足實(shí)際樣品檢測需求。

表3 加標(biāo)回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差結(jié)果（n=6）Table 3 Recoveries and RSD of five marker peptides (n=6)

2.11 實(shí)際樣品測定

采用本方法對來源于生產(chǎn)企業(yè)以及市場銷售的19批阿膠糕樣品、10批阿膠飲品（包括阿膠漿、阿膠口服液、阿膠膏）樣品按1.4項(xiàng)下制備供試品溶液，注入液質(zhì)聯(lián)用儀進(jìn)行測定，4批阿膠糕、2批阿膠漿樣品檢出馬源性成分，含量為15.5～68.3 mg/kg；4批阿膠糕、1批阿膠膏樣品檢出牛源性成分，含量為6.5～91.3 mg/kg。

3 結(jié)論

本文建立了基于特征肽的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定阿膠糕及阿膠飲品中馬皮等雜皮源成分含量的檢測方法，考察了樣品前處理方式，比較了酶的用量，進(jìn)行了基質(zhì)效應(yīng)評估，采用基質(zhì)匹配的標(biāo)準(zhǔn)曲線定量，方法準(zhǔn)確度高。樣品測定結(jié)果表明生產(chǎn)企業(yè)存在一定的摻假行為，因此非常有必要對阿膠產(chǎn)品進(jìn)行雜皮源成分的檢測。本方法操作簡便，結(jié)果可靠，重現(xiàn)性好，可用于阿膠糕及阿膠飲品中馬皮等雜皮源成分的測定，提升產(chǎn)品質(zhì)量，同時(shí)可為產(chǎn)品監(jiān)管提供技術(shù)支撐。