1-MCP處理維持軟棗獼猴桃活性氧的代謝平衡

陳曦冉，張鵬，賈曉昱，李江闊

（1.沈陽農業(yè)大學食品學院，遼寧沈陽 110866）

（2.天津市農業(yè)科學院農產品保鮮與加工技術研究所，國家農產品保鮮工程技術研究中心（天津），農業(yè)農村部農產品貯藏保鮮重點實驗室，天津市農產品采后生理與貯藏保鮮重點實驗室，天津 300384）

軟棗獼猴桃（Actinidia arguta）為獼猴桃科獼猴桃屬的漿果類水果，果皮光滑細膩，果肉味美多汁，同時富含多種營養(yǎng)物質，其中維生素C含量遠高于其他類型水果[1,2]。軟棗獼猴桃若在貯藏期間活性氧代謝受到破壞，果實內自由基大量累積，引起細胞膜脂過氧化，加速植物細胞衰老，引起品質下降[3-5]。因此，維持活性氧代謝平衡是保持軟棗獼猴桃品質的重要因素。此前，研究者們主要采用氣調貯藏、低溫貯藏、UV-C輻照、水楊酸、1-MCP熏蒸等[6-10]物理或化學方法，來延緩軟棗獼猴桃品質下降。

1-MCP作為一種無毒高效的乙烯受體抑制劑[11]，優(yōu)先與乙烯受體發(fā)生不可逆的結合，抑制內源乙烯的正常作用，進而達到延緩果實衰老的目的[12,13]。Li等[14]發(fā)現，用1-MCP浸泡芒果可以推遲乙烯和呼吸速率高峰的出現，誘導POD、CAT和SOD的活性。另外，1-MCP處理可以提高黑莓的抗氧化酶活性[15]。Xu等[16]研究表明，1-MCP可以減少獼猴桃貯藏期間的腐爛率，保持果實硬度的同時不同程度的提高APX、SOD和CAT活性。安容慧等[17]采用1-MCP對娃娃菜進行熏蒸處理，發(fā)現可以抑制MDA、H2O2和O2-·的增加，提高POD、CAT、SOD和GR的活性。軟棗獼猴桃屬于呼吸躍變型果實，乙烯對貯藏期間品質的影響較大[18,19]，而1-MCP在抑制乙烯生成的同時延緩果實軟化進程[20]，可以減少果實組織中自由基的積累，延緩果實的成熟與衰老，維持果實較好的品質。

目前，1-MCP處理采后獼猴桃的研究多集中在維持鮮果品質方面，但針對其在軟棗獼猴桃活性氧代謝相關變化的研究較少。因此，本文研究了1-MCP處理對軟棗獼猴桃冰溫貯藏期間抗氧化及活性氧代謝的影響，為軟棗獼猴桃的貯藏保鮮提供理論和技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

軟棗獼猴桃于2020年9月22日采摘自遼寧省丹東市，品種為“龍成二號”，挑選個體均一、無傷病、成熟度（可溶性固形物含量6.5%～7.0%）一致的果實進行處理。小籃（長×寬×高=17.5 cm×10 cm×11 cm），寧波國嘉農產品保鮮包裝技術有限公司產品；PE袋（長×寬=35 cm×45 cm，厚度34 μm）、1-MCP便攜包，國家農產品保鮮工程技術研究中心（天津）提供。

氫氧化鈉、草酸、EDTA、偏磷酸醋酸、硫酸、鉬酸銨、三氯乙酸，天津市江天化工有限公司；二硫蘇糖醇、TritionX-100、硫代巴比妥酸，上海麥克林生化科技有限公司；磷酸氫二納、磷酸二氫鈉、聚乙二醇6000、聚乙烯吡咯烷酮、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、愈創(chuàng)木酚、30% H2O2，天津市大茂化學試劑廠；以上試劑均為國產分析純；生理鹽水，石家莊四藥有限公司；O2-·試劑盒、H2O2試劑盒、SOD試劑盒、GR試劑盒、GSSG試劑盒、GSH試劑盒，南京建成生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

Sigma3-30K型高速離心機，德國SIGMA離心機有限公司；Check PiontⅡ便攜式測氧儀，丹麥Dansensor公司；F-900便攜式乙烯分析儀，美國FELIX儀器公司；DDS-307A型電導率儀，上海儀電科學儀器儀表有限公司；SynergyH1全功能微孔板檢測儀酶標儀，美國伯騰儀器有限公司；TU-1810ASPC紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；HH-1恒溫水浴鍋，金壇市金南儀器制造有限公司。

1.3 試驗方法

果實園內采摘后進行篩選，在基地冷庫內預冷并處理，本實驗設置兩個處理，CK組不進行處理，將分裝成籃的果實直接裝入PE袋中，封口將其扎緊；1-MCP組將分裝成籃的果實裝入PE袋內，采用1.0 μL/L濃度的1-MCP便攜包密封處理12 h。隨后采用冷鏈物流車（0～4 ℃）12 h內運回天津實驗室，在冰溫庫內（-0.5±0.3 ℃）開袋預冷12 h后封口進行貯藏。每組處理軟棗獼猴桃各15籃，每籃約2.2 kg，測定周期為60 d，每15 d各拿出三籃果實測定相關指標。

1.4 指標測定

1.4.1 呼吸強度、乙烯生成速率

呼吸強度采用靜置法[21]測定。

乙烯生成速率參照張鵬等[22]方法。

1.4.2 O2-·活性、H2O2和MDA含量、相對電導率的測定

O2-·活性采用試劑盒（比色法）測定，結果以U/g prot表示。

H2O2含量采用試劑盒（比色法）測定，結果以mmol/g prot表示。

MDA含量采用硫代巴比妥酸(TBA)法[23]測定。

相對電導率使用電導率儀測定，稱取果皮0.5 g加入50 mL去離子水，震蕩立即測定P0；靜置30 min后測定P1；沸水浴15 min冷卻至室溫測定P2。

1.4.3 SOD、CAT、POD、APX活性測定

SOD活性采用試劑盒（羥胺法）測定，結果以U/mg prot表示。

CAT活性參照王艷穎等[24]方法稍作改動。

POD和APX活性參照曹建康等[25]方法。

1.4.4 GR活性及AsA、GSSG、GSH含量測定

GR活性采用試劑盒（紫外比色法）測定，結果以U/g prot表示。

AsA含量采用鉬藍比色法[26]測定。

GSSG含量采用試劑盒（微量酶標法）測定，結果以μmol/L表示。

GSH含量采用試劑盒（分光光度法）測定，結果以mg/g prot表示。

1.4.5 數據分析

采用Excel 2010進行數據匯總處理與分析，SPSS 19.0進行Duncan’s多重差異顯著性分析，p＜0.05表示差異顯著，SMICA 14.1進行正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA），檢驗其相關性。

2 結果與分析

2.1 1-MCP處理對軟棗獼猴桃呼吸強度、乙烯生成速率的影響

呼吸是果實采后的基本代謝活動。由圖1a可知，軟棗獼猴桃呼吸強度呈先上升后下降的趨勢，處理組一直處于較低水平，0～15 d上升速度較快，15 d出現呼吸高峰，對照組為92.09 mg/(kg·h)，處理組為78.29 mg/(kg·h)。1-MCP處理保持較低的果實呼吸強度，減少貯藏期間果實營養(yǎng)物質的損失，維持貯藏期品質，姜毅等[27]的研究發(fā)現1.5 μL/L 1-MCP可以有效抑制兩種無花果的呼吸強度并且推遲呼吸高峰的出現，這與本試驗結果相似。

乙烯是可以促進果實衰老的內源激素。如圖1b所示，在貯藏期間，獼猴桃乙烯呈現先上升后下降的趨勢，0～30 d時乙烯生成速率增加緩慢，45 d時各處理達到最大值，隨后又快速下降，在貯藏60 d時，對照組乙烯生成速率為3.08 μL/(kg·h)，是處理組的1.3倍。1-MCP能夠顯著（p＜0.05）抑制乙烯生成速率，可能是因為1-MCP率先與乙烯受體結合，從而減少果實乙烯的生成。

2.2 1-MCP處理對軟棗獼猴桃O2-·活性、H2O2、MDA含量及相對電導率的影響

O2-·過度積累會對植物造成嚴重的損害。由圖2a可知，在整個貯藏期間果實O2-·活性逐漸升高，0 d時O2-·活性為350.47 U/g prot，60 d時對照組O2-·活性上升到863.81 U/g prot，上升幅度為146.47%，處理組O2-·活性為699.62 U/g prot，漲幅為99.62%。貯藏期間處理組O2-·活性顯著（p＜0.05）低于對照組，說明1.0 μL/L 1-MCP處理抑制O2-·效果好，降低對果實的傷害。林靜穎等[28]研究也表明，1-MCP處理可以抑制“油?”果實O2-·生成速率，提高其貯藏品質。

過多的H2O2影響正常的細胞代謝。由圖2b可知，果實H2O2含量在0～45 d上升緩慢，60 d大幅度升高，此時對照組含量為230.17 mmol/g prot，為處理組的1.47倍。統(tǒng)計分析表明，處理組果實組織中的H2O2含量顯著（p＜0.05）低于對照組，說明1.0 μL/L 1-MCP處理有效降低H2O2的生成。

MDA含量可以反應細胞膜脂過氧化程度。由圖2c可知，在果實貯藏的60 d內，MDA含量呈直線上升，0～30 d各組處理間的差異不明顯，45 d兩組處理MDA含量大幅度升高，但處理組上升幅度較小。60 d兩組處理同樣繼續(xù)升高，并且達到最大值，此時對照組含量為1.89 nmol/g為處理組的1.39倍，差異顯著（p＜0.05）。這表明，1-MCP處理可以抑制軟棗獼猴桃果實組織內MDA增加，減緩貯藏期果實細胞膜的破壞程度。

相對電導率的大小可以描述果蔬組織衰老伴隨著細胞膜通透性增加的程度。如圖2d所示，貯藏期間相對電導率不斷上升，0～15 d各組處理差異較小，30 d后處理效果顯著（p＜0.05），60 d時對照組為48.00%，處理組為33.36%。處理組的相對電導率上升較慢，說明1-MCP對貯藏期間果實胞膜衰老有抑制作用，維持細胞微環(huán)境和正常的生理代謝，這與徐冬穎等[29]對軟棗獼猴桃的研究結果一致，1-MCP可以有效抑制果實膜脂損傷，降低貯藏期MDA含量及相對電導率的增長。

2.3 1-MCP處理對軟棗獼猴桃SOD、CAT、POD、APX活性的影響

SOD分布于高等植物葉綠體、線粒體中，可以清除并催化組織中的O2-·轉變?yōu)镠2O2。由圖3a可知，在貯藏0～15 d時SOD含量呈現下降的趨勢，隨后開始小幅度升高再繼續(xù)下降，60 d時對照組和處理組SOD含量分別為280.18 U/mg prot和323.87 U/mg prot，且整個貯藏期處理組的SOD含量均顯著（p＜0.05）高于對照組，這與曹森等[30]對“東紅”獼猴桃的研究結果一致。

CAT可以將H2O2催化分解為對果實無害的H2O和O2。CAT活性先升高再減少，0～15 d兩組差異不明顯，30 d活性達到峰值，此時對照組為40.56 U/g，處理組為55.19 U/g，隨后開始下降，貯藏末期處理組CAT活性較對照組高12.22 U/g。說明1-MCP處理可以維持軟棗獼猴桃較高的CAT活性，延緩其活性的下降，差異顯著（p＜0.05）。杜林笑等[31]的研究發(fā)現在貯藏末期1-MCP處理的庫爾勒香梨CAT活性顯著高于對照組，這與本研究結果相似。

貯藏期間POD活性與CAT活性相同呈先上升后下降的趨勢（圖3c），1-MCP可以促進其活性的升高并且延緩下降，15 d時對照組與處理組POD活性分別為0.61、0.70 U/g，隨后果實POD活性開始逐漸下降。0～60 d處理組POD活性顯著（p＜0.05）高于對照組，說明1-MCP對于維持POD活性有較好的作用。

由圖3d可知，APX活性與POD、CAT活性變化相同，呈現升高再降低的趨勢。在貯藏15 d時處理組APX活性達到高峰，隨后開始下降，60 d時處理組APX活性下降為3.78 U/g，比對照組高2.67 U/g?？梢?-MCP處理可以保持軟棗獼猴桃較高的APX活性，提高APX抗氧化酶的活性。這與Xu等[32]采用1-MCP處理對獼猴桃的研究結果一致。

2.4 1-MCP處理對軟棗獼猴桃GR活性、AsA、GSSG、GSH含量的影響

GR可以維持組織中充足的GSH水平。GR活性呈現先上升后下降的趨勢，貯藏15 d時對照組活性較高，30 d兩組處理GR活性開始降低，但處理組下降速度較慢，貯藏中后期處理組GR活性顯著（p＜0.05）高于對照組，60 d時為0.12 U/g prot，是對照組的2.40倍。結果表明1-MCP可有效維持軟棗獼猴桃較高的GR活性，楊乾等[33]的研究也證實了水楊酸處理可以維持甜瓜較高的GR活性。

AsA是重要的抗氧化劑可以直接清除H2O2。如圖4b所示，在整個貯藏期間AsA含量先上升后下降，0～15 d各組AsA含量相差較小，處理組在30 d出現最大值，較對照組晚15 d，此時AsA含量為75.88 mg/100 g，30 d后AsA含量開始大幅度下降，但處理組含量始終顯著（p＜0.05）高于對照組。由此可見，1-MCP可以減少貯藏期間果實AsA含量的消耗，侯佳迪等[34]研究表明，1-MCP處理可以有效延緩桃果實AsA含量的下降，與本研究結果相似。

在GR的催化下GSSG可以轉化成GSH，而GSH又可以將脫氫抗壞血酸（DHA）還原成AsA，這對維持果實組織H2O2平衡起到了重要的作用。GSSG含量先上升后下降，15 d時對照組GSSG含量高于處理組，相較于0 d漲幅分別為24.81%和1.80%。貯藏30 d達到峰值，且處理組含量顯著（p＜0.05）高于對照組，45 d時，對照組與處理組GSSG含量分別為271.67 μmol/L、409.57 μmol/L，60 d時為218.61 μmol/L、289.24 μmol/L。30～60 d，處理組GSSG含量高于對照組，說明1-MCP處理可以緩解軟棗獼猴桃貯藏中后期GSSG含量的下降。

如圖4d所示，1-MCP處理在貯藏期間GSH含量呈現先上升后下降的趨勢，貯藏前期各組處理差異不大，30 d兩組處理分別達到最大值，處理組的GSH含量顯著（p＜0.05）高于對照組，此時對照組為78.76 mg/g prot，處理組為89.67 mg/g prot，60 d時分別降低到54.70 mg/g prot、67.55 mg/g prot。由此可知，1-MCP處理可以維持果實較高的GSH含量，有利于保護果實在貯藏期間膜的完整性，與張飛等[35]對紫背天葵的研究相似，1-MCP處理可以提高GSH含量，維持較高的抗氧化能力。

2.5 基于OPLS-DA法研究1-MCP處理對軟棗獼猴桃活性氧代謝的影響

兩組處理進行OPLS-DA分析，根據VIP值大于1，可將果實差異指標確定為SOD、GSH、GSSG、AsA和CAT。SOD和CAT為特征成分的主要原因可能是，1-MCP提高了組織中抗氧化酶的活性，本研究中SOD和CAT作用較為明顯，進而增強清除自由基的能力，降低對細胞膜的傷害。GSSG、GSH、AsA成為特征成分的主要原因可能是，1-MCP激活了果實的抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)，與對照相比GSSG、GSH含量可以維持在較高的水平，同時減少AsA作為營養(yǎng)物質在貯藏期間的消耗，作為抗氧化物參與到清除活性氧中，進而延緩果實衰老期的到來。

3 討論

呼吸作用是果實采后的一個重要生理活動，乙烯作為植物的衰老激素，可以促進果實的后熟進程。本研究軟棗獼猴桃的呼吸高峰出現在貯藏的15 d，45 d時乙烯生成速率最大，1-MCP處理較CK處理可以有效抑制呼吸和乙烯的生成，減緩貯藏期間營養(yǎng)物質的消耗，維持果實品質，延緩衰老速度，與洪偉榮等[36]利用1-MCP預處理對機械損傷的獼猴桃的研究結果相同。

ROS有幾種常見形式，為O2-·、H2O2和羥基自由基（·OH）等，當ROS含量過高時會加劇果實組織的衰老進程[37]。本研究結果顯示，CK處理組在貯藏過程中O2-·活性和H2O2含量逐漸升高，說明果實組織遭受到氧化脅迫，而1-MCP處理組可以有效抑制ROS的積累，延緩膜脂氧化進程，從而降低MDA含量以及相對電導率的升高。

果蔬中降解ROS的途徑分為酶促和非酶促兩種[38]。SOD、POD、APX、CAT為酶促系統(tǒng)的主要抗氧化酶[39]。非酶促包括AsA、GSH、總酚等，可直接降低ROS。SOD將O2-·歧化為H2O2再通過POD、APX、CAT去除，本研究發(fā)現，SOD活性在貯藏中期出現峰值，表明抗氧化系統(tǒng)開始作用，1-MCP處理可以持續(xù)提高SOD活性，保持POD、APX、CAT清除H2O2能力，說明1-MCP在提高軟棗獼猴抗氧化酶活性的同時，增強自由基清除能力，這與尹健等[40]對“金紅寶”甜瓜的研究結果一致。OPLS-DA法分析將SOD和CAT確定為差異性指標，表明這兩種酶對清除自由基具有重要作用。抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)為植物體內的一個重要抗氧化系統(tǒng)，對維持果實正常生理代謝、貯藏期品質有著重要的意義[41-43]。本研究結果表明，CK處理組GR活性一直處于較低水平，1-MCP處理下的差異指標AsA、GSSG及GSH含量下降速度較慢，表明處理可以提高該系統(tǒng)的抗氧化能力，提高軟棗獼猴桃的貯藏品質，與霍俊偉等[44]對藍靛果的研究結果相似。

4 結論

綜上所述，1.0 μL/L 1-MCP處理降低軟棗獼猴桃呼吸強度和乙烯生成速率，抑制O2-·、H2O2、MDA和相對電導率的增加，維持較高SOD、CAT、POD、APX、GR活性，減緩AsA、GSSG、GSH含量的下降。1.0 μL/L 1-MCP可以有效降低貯藏期間軟棗獼猴桃的生理活性，緩解膜脂過氧化，維持果實活性氧代謝平衡，保持較高的果實品質。1-MCP保鮮技術具有易操作、成本低、效果好等優(yōu)點，本實驗對果實抗氧化及活性氧代謝進行較為系統(tǒng)的研究，為軟棗獼猴桃采后保鮮技術提供理論依據。