白僵菌固體發(fā)酵菌絲生長階段溫度與CO2變化

蔡守平，楊際偉，曾麗瓊，林和再，蘭 翔，謝 崢，何學(xué)友

(1.福建省林業(yè)科學(xué)研究院、國家林業(yè)局南方山地用材林培育重點實驗室，福建 福州 350012；2.福建省科技廳農(nóng)牧業(yè)科研中試中心，福建 福州 350012； 3.漳浦縣林業(yè)局，福建 漳浦，363200；4.古田縣林業(yè)局，福建 古田 352200)

白僵菌具有致病力強(qiáng)、寄主譜廣及對環(huán)境友好等特點，在農(nóng)林害蟲生物防治中得到廣泛應(yīng)用，具有十分廣闊的市場前景[1-2]。規(guī)?；罅可a(chǎn)白僵菌分生孢子是大面積應(yīng)用的基礎(chǔ)，目前菌廠白僵菌孢子生產(chǎn)普遍采用的技術(shù)是液固雙相發(fā)酵法[3-6]，即首先經(jīng)液體發(fā)酵獲得白僵菌液體菌種(菌絲體或芽生孢子)，再接種到固體培養(yǎng)料上，擴(kuò)大培養(yǎng)規(guī)模，獲得大量分生孢子。固體發(fā)酵階段受到菌株特性、固體培養(yǎng)料組成、發(fā)酵方式等多種因素影響[5-6]，不同學(xué)者對白僵菌固體發(fā)酵參數(shù)的研究結(jié)果存在一定的差異。白僵菌固體發(fā)酵過程可分為菌絲生長階段和產(chǎn)孢階段[3-4]，菌絲生長量是決定產(chǎn)孢量的直接因素，且菌絲生長階段早期會產(chǎn)生大量的“發(fā)酵熱”，調(diào)控難度大，是固體發(fā)酵成功與否的關(guān)鍵階段[7]。本研究在研制了一套適宜于白僵菌固體發(fā)酵的發(fā)酵箱的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步開展固體發(fā)酵中試試驗，對白僵菌菌絲生長階段的溫度、CO2變化情況進(jìn)行監(jiān)測、調(diào)控，為規(guī)?；a(chǎn)提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 白僵菌固體發(fā)酵箱的研制

白僵菌固體發(fā)酵箱結(jié)構(gòu)見圖1。發(fā)酵箱為304不銹鋼材質(zhì)，長方體立式結(jié)構(gòu)，箱體長×寬×高為1.5 m×0.8 m×2.3 m。正面為鋼化玻璃材質(zhì)對開門，方便觀察內(nèi)部情況。箱體內(nèi)部主要包括支撐架與托盤、傳感器組及循環(huán)組件。發(fā)酵箱整體密封性較好，箱體內(nèi)部支撐架為10層×2列固定支架，用于放置發(fā)酵淺盤，層間距為18 cm。傳感器組件、循環(huán)組件與放置于發(fā)酵室的物聯(lián)網(wǎng)控制主機(jī)有線連接，構(gòu)成智能監(jiān)控技術(shù)系統(tǒng)，實現(xiàn)實驗環(huán)境遠(yuǎn)程智能監(jiān)測、預(yù)警與控制功能。傳感器組包括空氣溫濕度傳感器、二氧化碳濃度傳感器和固體培養(yǎng)料溫度傳感器?？諝鉁貪穸葌鞲衅靼惭b于發(fā)酵室內(nèi)，二氧化碳濃度傳感器和培養(yǎng)料溫度傳感器安裝于發(fā)酵箱中。發(fā)酵箱內(nèi)裝有網(wǎng)絡(luò)攝像機(jī)，用于定期拍攝固體培養(yǎng)料的變化情況。發(fā)酵箱放置于發(fā)酵室。

發(fā)酵盤自下向上編號為1～10號，1～3層為發(fā)酵箱下層，4～7層為發(fā)酵箱中層，8～10層為發(fā)酵箱上層；溫度傳感器分別位于1層、6層、10層，分別測定發(fā)酵箱下部、中部、上部的發(fā)酵基質(zhì)溫度。

循環(huán)組件置于發(fā)酵箱內(nèi)。為解決固體發(fā)酵箱內(nèi)上、下層之間的培養(yǎng)料溫度梯度和菌絲生長不均一的問題，經(jīng)多次采用“U”型、“L”型的空氣循環(huán)裝置對比試驗，最終選擇循環(huán)效果好的“L”型，即通過從發(fā)酵箱上部至底部引入2條“L”型管道延伸至底部，頂部安裝換氣扇，將上層空氣通過管道泵至下層。用于實現(xiàn)發(fā)酵箱內(nèi)空氣的內(nèi)循環(huán)和發(fā)酵箱內(nèi)空氣與發(fā)酵箱外空氣的外循環(huán)。

1.2 白僵菌固體發(fā)酵

1.2.1 液體菌種的培養(yǎng)

1)斜面菌種。供試菌株選擇菌絲生長快、產(chǎn)孢量較高的球孢白僵菌(BeauveriabassianaBbFZ-51)菌株，系福建省林業(yè)科學(xué)研究院森林保護(hù)研究所研究人員分離、保存。試管斜面菌種用PDA培養(yǎng)基在25 ℃條件下純化培養(yǎng)備用。

2)三角瓶液體菌種培養(yǎng)基。配制SDY培養(yǎng)基1 L裝入1000 mL三角瓶中，每瓶裝500 mL培養(yǎng)基，瓶口紗布包扎后置于121 ℃蒸汽高壓滅菌30 min，冷卻后備用。

3)接種。在無菌操作臺中，從試管菌種斜面上挑取孢子接入三角瓶液體培養(yǎng)基中，放入(25±1) ℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中振蕩(120 r·min-1)培養(yǎng)72 h，培養(yǎng)成白色粘稠菌絲體液待用。

4)發(fā)酵罐液體發(fā)酵。液體發(fā)酵采用30 L的液體發(fā)酵罐(鎮(zhèn)江日泰生物工程設(shè)備有限公司生產(chǎn))，發(fā)酵罐液體培養(yǎng)基成分為2%白砂糖+4%黃豆粉，裝液量20 L，經(jīng)121 ℃蒸汽高壓滅菌1 h后冷卻，接入振蕩培養(yǎng)好的三角瓶液體菌液，液體發(fā)酵罐罐溫設(shè)置為25 ℃，發(fā)酵培養(yǎng)48 h后得到的發(fā)酵液供固體培養(yǎng)料接種用。

1.2.2 固體發(fā)酵中試

1)固體培養(yǎng)料配制。按麥麩∶谷殼∶水重量為4∶1∶4比例，分別將麥麩和谷殼稱量，混合均勻后加水再拌勻、裝袋，每袋重約2 kg，放入高壓滅菌鍋121 ℃蒸汽高壓滅菌50 min，冷卻后備用。

2)接種。在預(yù)先空間滅菌的密閉房間內(nèi)進(jìn)行，按20%的接種量(V/W)，將培養(yǎng)好的發(fā)酵罐液體菌種倒入固體培養(yǎng)料中，攪拌機(jī)拌勻后分裝入消毒過的培養(yǎng)盤(40 cm×60 cm)中，培養(yǎng)料厚度約2.5 cm，每盤重量約2 kg，接種完畢后移入置于發(fā)酵箱每層支架上，關(guān)閉發(fā)酵箱門，開始固體發(fā)酵。

1.3 溫度監(jiān)測與控制

發(fā)酵室內(nèi)布置2個發(fā)酵箱，同時開展固體發(fā)酵。固體發(fā)酵開始后，通過空氣溫濕度傳感器記錄發(fā)酵室內(nèi)的溫濕度，智能調(diào)控加熱器運行狀態(tài)使室溫保持在20 ℃。2個發(fā)酵箱分別做如下處理：1號發(fā)酵箱(未開啟空氣內(nèi)循環(huán))使用固體培養(yǎng)料溫度傳感器實時記錄固體培養(yǎng)料的溫度，分別于發(fā)酵箱上、中、下層(依次位于箱內(nèi)第10、6、1層的培養(yǎng)盤料內(nèi))分別插入1個溫度傳感器，上部和下部分別設(shè)置1個CO2濃度傳感器，固體培養(yǎng)料溫度和CO2濃度每30 min各記錄1次；發(fā)酵箱中的上層設(shè)置1個攝像頭，設(shè)置每30 min定時拍攝1次，記錄培養(yǎng)盤固體培養(yǎng)料的狀態(tài)變化。2號發(fā)酵箱(開啟空氣內(nèi)循環(huán))基礎(chǔ)操作同1號發(fā)酵箱，但啟動空氣循環(huán)系統(tǒng)，空氣泵(內(nèi)循環(huán))設(shè)定常開狀態(tài)；散熱扇(外循環(huán))關(guān)聯(lián)空氣溫度傳感器，箱內(nèi)空氣溫度超過32 ℃時啟動。

2 結(jié)果與分析

2.1 白僵菌固體發(fā)酵生長及溫度、CO2的變化

白僵菌固體發(fā)酵菌絲生長過程見圖2，溫度變化見圖3，CO2變化見圖4。從圖2～圖4可以看出，固體培養(yǎng)料接種白僵菌菌液后置于發(fā)酵箱內(nèi)，菌絲生長和溫度變化分為發(fā)酵準(zhǔn)備期(延滯期)、菌絲初始生長期(升溫期)、菌絲旺盛生長期(穩(wěn)定期)、產(chǎn)孢期等4個階段。

圖2 白僵菌菌絲生長階段固體培養(yǎng)料變化

圖3 白僵菌固體發(fā)酵過程中溫度變化

2.1.1 發(fā)酵準(zhǔn)備期(延滯期) 發(fā)酵時段為0～24 h，發(fā)酵箱內(nèi)培養(yǎng)盤固體培養(yǎng)料沒有太多變化，僅在24 h時開始有一些白色菌絲點在培養(yǎng)料表面形成，此階段箱內(nèi)固體料的溫度變化幅度不明顯，僅呈小幅上升的趨勢，維持在22 ℃(發(fā)酵室內(nèi)溫度設(shè)定為20 ℃)，沒有出現(xiàn)明顯的溫度梯度，即上、中、下層發(fā)酵料溫差別不大；而發(fā)酵箱內(nèi)CO2濃度則呈現(xiàn)逐漸升高的狀態(tài)，從2000 mg·m-3逐漸上升到5000 mg·m-3。

2.1.2 菌絲初始生長期(升溫期) 發(fā)酵時段為24～48 h，24 h固體料開始出現(xiàn)一些白色菌絲，并在固體料表面及內(nèi)部擴(kuò)展；至48 h時，固體培養(yǎng)料表面形成一層白色薄菌絲層。此階段固體培養(yǎng)料的溫度呈急劇上升階段，尤其是中、上層料溫上升更為明顯，48 h時中層發(fā)酵溫度為31 ℃，上層溫度為29.9 ℃，下層溫度為25.9 ℃，形成明顯的溫度梯度；本階段發(fā)酵箱內(nèi)上層CO2濃度也快速升高，從5000 mg·m-3上升至13000 mg·m-3，而下層CO2濃度呈波動上升，升速較慢，從5000 mg·m-3升到6500 mg·m-3，表明CO2濃度亦呈明顯的濃度梯度(圖4)。

2.1.3 菌絲旺盛生長期(穩(wěn)定期) 發(fā)酵時段為48～96 h，固體培養(yǎng)料上菌絲明顯增多，逐漸覆蓋整個培養(yǎng)料，至72 h時，固體培養(yǎng)料表面被厚厚的菌絲層覆蓋，72 h后菌絲層厚度逐漸增加，肉眼觀察變化不大；但上、下層菌絲的均勻度存在明顯差異，中上層較為均勻，能覆蓋整個固體培養(yǎng)料，而下層有部分固體培養(yǎng)料則會出現(xiàn)菌絲生長較慢的現(xiàn)象(圖5)。該階段固體培養(yǎng)料的發(fā)酵溫度隨發(fā)酵時間推移而逐漸降低，中上層溫度48 h時為31 ℃，72 h時降到27 ℃，96 h時降為25 ℃，下層發(fā)酵溫度48 h時為25.9 ℃，72 h時降至23 ℃，96 h時降至22 ℃，中上層與下層的溫度梯度依然十分明顯；CO2濃度則因發(fā)酵箱內(nèi)濕度大，導(dǎo)致二氧化碳傳感器受到結(jié)露影響，無法準(zhǔn)確記錄。

2.1.4 產(chǎn)孢期 發(fā)酵時段為96 h以后(共需7～10 d)，該階段表層菌絲開始逐漸產(chǎn)生分生孢子，進(jìn)入產(chǎn)孢周期。固體料溫依然呈現(xiàn)緩慢下降的趨勢，逐漸下降接近或略高于發(fā)酵室內(nèi)的溫度，上中層與下層的溫度差異也進(jìn)一步縮小。

2.2 空氣循環(huán)對白僵菌固體發(fā)酵的影響

引入空氣循環(huán)系統(tǒng)后，固體發(fā)酵情況見圖6和圖7?？諝庋h(huán)對固體發(fā)酵過程沒有影響，菌絲生長階段與未加入循環(huán)系統(tǒng)保持一致。從圖6可以看出，空氣循環(huán)后，顯著消除了上、下層培養(yǎng)料發(fā)酵的溫度梯度，使上、下層的溫度差異大幅度縮??；24～48 h為顯著升溫階段；48 h時上層溫度為30.3 ℃，下層溫度為29.2 ℃。循環(huán)系統(tǒng)的加入也顯著改善了CO2濃度梯度的現(xiàn)象，前30 h發(fā)酵箱上下層CO2濃度基本保持一致；30 h后CO2濃度顯著升高；至42 h時發(fā)酵箱上層CO2濃度為16000 mg·m-3，下層濃度為13000 mg·m-3，上下層濃度差較未引入循環(huán)系統(tǒng)顯著縮小(圖7)。通過圖5可以看出，在循環(huán)系統(tǒng)加入后，上、下層固體培養(yǎng)料中的白僵菌菌絲生長較為均勻，沒有出現(xiàn)中下層菌絲不能布滿的情況。

圖6 空氣內(nèi)循環(huán)對培養(yǎng)料發(fā)酵溫度的影響

圖7 空氣內(nèi)循環(huán)對發(fā)酵箱CO2濃度的影響

3 小結(jié)與討論

3.1 小結(jié)

本研究采用發(fā)酵箱進(jìn)行球孢白僵菌固體發(fā)酵中試及智能自動監(jiān)測，揭示了白僵菌在箱內(nèi)不同部位發(fā)酵準(zhǔn)備期(延滯期)、菌絲初始生長期(升溫期)、菌絲旺盛生長期(穩(wěn)定期)和產(chǎn)孢期各階段的菌絲生長、固體培養(yǎng)料溫度、箱內(nèi)CO2濃度變化規(guī)律，表明上、下層料溫、CO2濃度差異梯度大，尤其升溫期因發(fā)酵產(chǎn)生的大量“發(fā)酵熱”致溫度變化幅度最大。本試驗通過加入空氣內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)較好地調(diào)控了不同層間料溫和箱內(nèi)CO2濃度差異較大的現(xiàn)象，能有效促進(jìn)發(fā)酵箱內(nèi)上、中、下層培養(yǎng)料中菌絲生長且布滿均勻，利于發(fā)酵后期白僵菌產(chǎn)孢，為白僵菌大規(guī)模生產(chǎn)工藝改進(jìn)和完善提供了技術(shù)參考。

3.2 討論

白僵菌生長不同時期對環(huán)境溫濕度要求不盡相同，因此要根據(jù)白僵菌的生長特點在不同的發(fā)酵階段采取不同的環(huán)境調(diào)控模式[3-4]。本研究發(fā)現(xiàn)白僵菌固體發(fā)酵前24 h為發(fā)酵準(zhǔn)備期(延滯期)，該階段培養(yǎng)料溫度和發(fā)酵箱內(nèi)CO2濃度上升不顯著，說明生物活動并不活躍。升溫期料溫和箱內(nèi)CO2濃度急劇上升，有文獻(xiàn)報道該階段為對數(shù)生長期，但試驗觀察本階段菌絲并不明顯，可能是由于該階段主要是發(fā)酵過程中的一些代謝活動非?；钴S致使溫度和CO2濃度升高。48～96 h是白僵菌菌絲生長最旺盛的階段，此階段發(fā)酵溫度卻是逐漸下降的，所以白僵菌固體發(fā)酵過程中 “產(chǎn)熱”機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

白僵菌固體發(fā)酵階段除受菌株特性、固體培養(yǎng)料的物理狀態(tài)(成分、含水率、通氣性)及接種量的影響外，發(fā)酵環(huán)境條件控制對固體發(fā)酵成功與否也至關(guān)重要。發(fā)酵空間、發(fā)酵量、環(huán)境溫濕度、空氣循環(huán)與熱交換等都直接影響固體發(fā)酵的效率[6-8]。傳統(tǒng)的開放式淺盤發(fā)酵周期長、環(huán)境條件難控制，其中發(fā)酵過程中的溫度梯度是由于發(fā)酵過程中產(chǎn)熱，而熱空氣單位質(zhì)量比較輕，導(dǎo)致發(fā)酵空間中上層溫度顯著高于下層，溫度梯度的產(chǎn)生往往會導(dǎo)致中上層發(fā)酵盤的溫度過高甚至出現(xiàn)“燒盤”的現(xiàn)象，溫度的升高同時還會導(dǎo)致固體基質(zhì)濕度散發(fā)過快以及影響微生物生長[8]；而下層往往由于溫度達(dá)不到最佳發(fā)酵溫度而產(chǎn)生生長緩慢的情況，在開放空間中如通過常規(guī)的通風(fēng)裝置來促進(jìn)空氣循環(huán)，又容易導(dǎo)致空氣濕度快速下降。采用發(fā)酵箱進(jìn)行固體發(fā)酵，發(fā)酵過程空氣濕度不易散失，并引入空氣循環(huán)裝置，顯著消除了溫度梯度現(xiàn)象，促進(jìn)了菌絲生長均勻性，提高了發(fā)酵效率。由于白僵菌菌絲生長階段與產(chǎn)孢階段對環(huán)境溫濕度要求并不一致，對如何自動調(diào)控發(fā)酵箱內(nèi)的溫濕度等相關(guān)參數(shù)，最大程度促進(jìn)白僵菌產(chǎn)孢，也有待進(jìn)一步研究。

發(fā)酵過程因生物代謝活動，必然帶來CO2的釋放，代謝強(qiáng)度也會在CO2的釋放速率上得到反映[9]，一些學(xué)者認(rèn)為CO2濃度可以作為生物量的間接指標(biāo)[10-11]。也有學(xué)者研究表明，真菌生長不同階段對CO2的敏感性和需求也不一樣，過高的CO2濃度往往會抑制真菌的生長[12]。本試驗通過監(jiān)測固體發(fā)酵箱中的CO2累積濃度可以看出，白僵菌固體發(fā)酵過程中的CO2釋放量非常大，CO2的累積對白僵菌菌絲生長和產(chǎn)孢的影響有待進(jìn)一步研究；同時，我們認(rèn)為有必要加入發(fā)酵箱內(nèi)外空氣交換裝置來降低發(fā)酵箱內(nèi)的CO2濃度，但是空氣交換必然帶來溫度和濕度的散失[10]，所以空氣的交換量和頻度有待進(jìn)一步研究。試驗中，為適應(yīng)高濕環(huán)境，采用了紅外吸收型CO2傳感器，能夠耐受一定的高濕環(huán)境，但發(fā)酵箱持續(xù)的高濕環(huán)境仍然使傳感器元器件在試驗后期產(chǎn)生結(jié)露，進(jìn)而影響數(shù)據(jù)采集，導(dǎo)致后期數(shù)據(jù)出現(xiàn)斷崖式下降的現(xiàn)象，這是工業(yè)傳感產(chǎn)品在持續(xù)高濕環(huán)境下應(yīng)用的普遍問題之一。因此如何避免或祛除傳感器結(jié)露帶來的影響，進(jìn)而獲得準(zhǔn)確的監(jiān)測數(shù)據(jù)，是研究解決CO2對白僵菌固態(tài)發(fā)酵過程影響的重要技術(shù)問題。