網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒、雞貧血病毒、大腸桿菌混合感染誘導(dǎo)肉雞腺胃炎

杜建才 ， 王桂花 ， 楊 潔 ， 張賢文 ， 魏寶國(guó) ， 孫玉鳳 ， 成子強(qiáng)

(山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 ， 山東 泰安 271018)

山東某養(yǎng)雞場(chǎng)規(guī)模為4萬只商品肉雞，在11日齡開始發(fā)病，發(fā)病率為40%，病雞生長(zhǎng)停滯，消瘦，糞便刺鼻，消化不良，精神不佳，羽毛蓬松。剖檢表現(xiàn)為腺胃高度腫脹，腺胃乳頭消失，腺胃糜爛。經(jīng)了解病雞在1日齡注射新城疫疫苗、禽流感疫苗和雞傳染性法氏囊病疫苗,期間未用過其他藥物。根據(jù)臨床和大體剖檢病變觀察的判斷進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢查，通過組織病理及血涂片觀察、病原學(xué)檢測(cè)，最終診斷為網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒(Reticuloendotheliosis virus,REV)、雞貧血病毒(Chicken anemia virus,CAV)、大腸桿菌(Escherichiacoli,E.coli)混合感染引起肉雞腺胃炎。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物來源 2019年11月21日，山東威海市某養(yǎng)雞場(chǎng)送檢22日齡的AA+商品肉雞。

1.2 主要試劑與器材 TaRaKa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit試劑盒、TIANamp Genomic DNA Kit試劑盒和2×TaqMaster Mix試劑，均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。電泳儀(dyy-5C型，上海市六一儀器廠)；光學(xué)顯微鏡(Olympus 公司);石蠟切片機(jī)(rm2134型，Leica公司);生物組織包埋機(jī)(jb-L7，湖北俊杰電子有限公司);恒溫水浴鍋(hh-4，國(guó)華電器有限公司);電熱恒溫干燥箱(ws203型，江蘇吳淞五金廠);PCR儀(Eppendorf公司);電子天平(fa2204A型，上海精天電子儀器有限公司);離心機(jī)(TG14 WS，湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司)。

1.3 大體剖檢病變觀察 對(duì)送檢病雞進(jìn)行剖檢，觀察大體病變并記錄。

1.4 病理組織學(xué)觀察 無菌采集病雞心臟、肝臟、脾臟、腎臟、腺胃、法氏囊等組織，固定于10%的中性福爾馬林溶液，石蠟包埋、切片，H.E.染色，光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.5 血涂片觀察 無菌采集病雞血液，制備血涂片，吉姆薩染色，光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.6 細(xì)菌的分離鑒定 無菌采集病雞肝臟，接種環(huán)刮取深部組織，劃線接種于血瓊脂平板，37 ℃恒溫箱培養(yǎng)18～24 h，挑取優(yōu)勢(shì)菌落接種于TSB肉湯培養(yǎng)基，37 ℃搖床培養(yǎng)18～24 h。

1.7 PCR擴(kuò)增 根據(jù)文獻(xiàn)[1]合成腺胃炎相關(guān)病毒如J亞群禽白血病病毒(Avian leukosis virus subgroup J，ALV-J)、網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒(REV)、圓圈病毒3型(Gyrovirus 3，GyV3)、雞貧血病毒(CAV)和馬立克氏病病毒(Marek's disease virus，MDV)的特異性引物，引物由華大基因(北京)有限公司合成，引物序列見表1。取送檢病雞肝臟，研磨，分別使用組織DNA、RNA提取試劑盒提取DNA、RNA，以DNA和RNA逆轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為20 μL：2×TaqPCR Master Mix 10 μL，上下游引物各0.5 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O補(bǔ)至20 μL。

表1 傳染性病毒性腺胃炎相關(guān)病原引物序列Table 1 Transmissible viral proventriculitis related pathogen primer sequence

按細(xì)菌DNA提取試劑盒說明書提取菌液DNA，合成細(xì)菌16S rDNA常規(guī)引物，以菌液DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.0% 瓊脂糖凝膠電泳，送華大基因(北京)有限公司測(cè)序，并進(jìn)一步分析。

2 結(jié)果

2.1 大體剖檢病變 剖檢可見胸肌消瘦蒼白(圖1A)；腹腔有泡沫樣拉絲黏液(圖1B)；腺胃明顯膨脹腫大(圖1C)；腺胃乳頭消失，發(fā)生糜爛(圖1D)；十二指腸有出血斑(圖1E)；骨髓顏色淡呈粉紅色(圖1F)；脾臟萎縮(圖1G)；法氏囊萎縮(圖1H)。

圖1 病雞大體剖檢病變(比例尺:1 cm)Fig.1 Gross autopsy of diseased chicken lesions (Scale bar: 1 cm)A：胸肌; B：腹腔; C、D：腺胃; E：十二指腸; F：股骨; G：脾臟； H：法氏囊A:Pectoralis; B:Abdominal cavity; C，D:Proventriculus; E:Dodecadactylon; F:Femur; G:Spleen; H:Bursa of Fabricius

2.2 病理組織學(xué)觀察 顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)：腺胃間質(zhì)出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，導(dǎo)管上皮細(xì)胞出現(xiàn)增生(圖2A)；腺胃黏膜的上皮細(xì)胞化生為磷狀上皮細(xì)胞(圖2B)；腺胃間質(zhì)出現(xiàn)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，腺管上皮細(xì)胞發(fā)生壞死(圖2C)；十二指腸黏膜上皮細(xì)胞壞死，出現(xiàn)核碎裂(圖2D)；十二指腸固有層出現(xiàn)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，可見核分裂象(圖2E)；胸腺髓質(zhì)出現(xiàn)大量膠原纖維(圖2F)。

圖2 病理組織切片觀察(H.E.染色)Fig.2 Observation of pathological tissue sections (H.E. staining)A：腺胃間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(綠色箭頭)，導(dǎo)管上皮細(xì)胞增生(黑色箭頭); B：腺胃黏膜上皮細(xì)胞化生磷狀上皮細(xì)胞(黑色箭頭); C：腺胃淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)(黑色箭頭)，腺管上皮細(xì)胞壞死(綠色箭頭); D：十二指腸黏膜上皮細(xì)胞壞死，核碎裂(黑色箭頭); E：十二指腸固有層淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)(黑色箭頭)，出現(xiàn)核分裂象(綠色箭頭); F：胸腺髓質(zhì)膠原纖維增多(黑色箭頭)A:Proventriculus interstitial inflammatory cell infiltration(green arrow),ductal epithelial cell proliferation(black arrow); B:Metaplasia of proventriculus mucosal epithelial cells into phosphorous epithelial cells(black arrow); C:Infiltration of lymphocytes in the proventriculus(black arrow),necrosis of glandular epithelial cells(green arrow); D:Duodenal mucosal epithelial cell necrosis,nuclear fragmentation(black arrow); E:Infiltration of lymphocytes in the lamina propria of the duodenum(black arrow),mitotic figures appear(green arrow); F:Increased thymic medulla collagen fibers(black arrow)

2.3 血涂片觀察 血涂片觀察發(fā)現(xiàn)：幼稚紅細(xì)胞明顯增多(圖3A)；紅細(xì)胞中存在大量異型性紅細(xì)胞(圖3B)；異嗜性粒細(xì)胞增多并且崩解釋放出桿狀顆粒(圖3C)；外周血中出現(xiàn)未成熟的骨髓細(xì)胞(圖3D)。

圖3 病雞的血像變化(瑞氏-吉姆薩染色)Fig.3 Blood image changes of sick chickens (Wright-Giemsa staining)A：幼稚紅細(xì)胞; B：異型性紅細(xì)胞(黑色箭頭); C：異嗜性粒細(xì)胞(黑色箭頭)； D：未成熟的骨髓細(xì)胞(黑色箭頭)A:Naive red blood cells; B:Atypical red blood cells(black arrow); C:Heterophilic granulocyte(black arrow); D:Immature bone marrow cells(black arrow)

2.4 細(xì)菌分離鑒定 血瓊脂培養(yǎng)基置于37 ℃培養(yǎng)箱中24 h后，長(zhǎng)出大小均勻一致的單個(gè)菌落，菌落呈灰白色，表面光滑濕潤(rùn)，呈凸起的圓形(圖4)。將菌液PCR擴(kuò)增出現(xiàn)的特異性條帶進(jìn)行膠回收送華大基因(北京)有限公司進(jìn)行測(cè)序，用DNASTAR軟件對(duì)獲得的基因測(cè)序結(jié)果與GenBank已發(fā)布的同源大腸桿菌序列進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果顯示其同源性為100%。

圖4 血瓊脂培養(yǎng)基菌落形態(tài)Fig.4 Colony morphology on blood agar medium

2.5 PCR檢測(cè) 將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示：用CAV和REV的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別在676 bp和291 bp處出現(xiàn)陽性特異性條帶(圖5、圖6)，將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物送至華大基因(北京)有限公司進(jìn)行測(cè)序，用DNA-STAR軟件對(duì)獲得的基因測(cè)序結(jié)果與GenBank已發(fā)布CAV和REV序列進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果表明其與CAV和REV的同源性均大于90%；用ALV-J、GyV3、MDV的特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，未出現(xiàn)陽性條帶。用細(xì)菌16S rDNA引物進(jìn)行菌液PCR擴(kuò)增，在1 600 bp出現(xiàn)特異性條帶(圖7)。

圖5 CAV基因的PCR擴(kuò)增Fig.5 PCR amplification of CAV geneM：DL-1 000 DNA 相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); 1：陽性對(duì)照; 2：陰性對(duì)照; 3～9：肝臟M:DL-1 000 DNA marker; 1:Positive control; 2:Negative control; 3-9:Liver

圖6 REV基因的PCR擴(kuò)增Fig.6 PCR amplification of REV geneM：DL-1 000 DNA 相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)； 1～5：肝臟；6：陽性對(duì)照； 7：陰性對(duì)照M:DL-1 000 DNA marker; 1-5:Liver; 6:Positive control; 7:Negative control

圖7 16S rDNA菌液的PCR擴(kuò)增Fig.7 PCR amplification of 16S rDNA in bacterial solutionM：DL-2 000 DNA 相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)； 1～3：肝臟M:DL-2 000 DNA marker; 1-3:Liver

3 討論

1978年Kouwenhoven等[2]根據(jù)荷蘭發(fā)病雞表現(xiàn)出生長(zhǎng)緩慢或阻滯，高度消瘦，腺胃腫大，腺胃乳頭糜爛等臨床癥狀提出“腺胃炎”一詞，我國(guó)學(xué)者王永坤等[3]1996年首次發(fā)現(xiàn)該病，近期本團(tuán)隊(duì)首次從腺胃炎肉雞中發(fā)現(xiàn)腺胃炎與圓圈病毒3型(Gyrovirus 3,GyV3)有關(guān)[1]。腺胃炎臨床剖檢表現(xiàn)為腺胃高度腫脹，外觀明顯腫脹膨大，如“乒乓球”一樣，觸摸堅(jiān)硬[4]，消瘦、整齊度差等[5]。雞腺胃炎可以在不同品種的蛋雞和肉雞上發(fā)生，但對(duì)商業(yè)肉雞的經(jīng)濟(jì)影響比較大，主要影響5～30日齡的肉雞[6]，在世界范圍內(nèi)均有發(fā)生，在我國(guó)多個(gè)地區(qū)流行，由于該病的病因復(fù)雜不明[7]，死淘率高，影響生產(chǎn)性能的同時(shí)也產(chǎn)生了顯著的免疫抑制，給養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失[8-9]。

2019年11月送檢病雞根據(jù)臨床癥狀、大體病變、組織病理學(xué)和血涂片觀察以及細(xì)菌分離鑒定、病毒PCR檢測(cè)綜合診斷為CAV、REV和E.coli混合感染引起腺胃炎。雞傳染性腺胃炎在我國(guó)呈全國(guó)流行，近年來腺胃炎頻頻發(fā)生，發(fā)病率和死亡率均在50%以上[10]。該病由于致病因素復(fù)雜不明，不同的臨床表現(xiàn)常導(dǎo)致混淆或復(fù)雜的診斷，當(dāng)顯微鏡觀察證實(shí)腺體發(fā)炎時(shí)，才能正確使用腺胃炎一詞，并且只能通過腺胃的炎癥和增大以及非化膿性壞死性腺胃炎的組織病理學(xué)證據(jù)來診斷[11]。腺胃炎組織病理學(xué)研究表明腺管上皮細(xì)胞壞死，黏膜固有層和腺體間質(zhì)淋巴細(xì)胞中度或重度浸潤(rùn)，在腺體中隨著排泄管腺管上皮細(xì)胞的增生和化生，腺體導(dǎo)管上皮細(xì)胞不斷發(fā)生增生和化生改變，腺管上皮細(xì)胞被增生的導(dǎo)管上皮細(xì)胞取代[12]。而本病例從剖檢腺胃腫大到病理組織學(xué)發(fā)現(xiàn)腺胃有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，腺管上皮細(xì)胞壞死和增生以及化生，腺胃間質(zhì)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)等，在臨床剖檢和組織病理學(xué)方面可以確定病雞患有腺胃炎。腺胃炎引起的主要經(jīng)濟(jì)問題是其影響肉雞群整體性能，患有這種疾病的肉雞飼料轉(zhuǎn)化率增加，生長(zhǎng)速度較慢，這意味著需要消耗更多的飼料，會(huì)造成一定的經(jīng)濟(jì)損失[11]。

值得注意的是多種病毒混合感染引起腺胃炎的病例越來越多，免疫抑制性病毒的感染更為嚴(yán)重，因?yàn)槊庖咭种撇∨c腺胃炎之間的關(guān)系比較含糊，易被忽視[13]。REV是一種常見的致腫瘤病的病毒，單獨(dú)感染就可以導(dǎo)致腫瘤病變并極有可能表現(xiàn)為腺胃腫大，已被證實(shí)可與CAV協(xié)同導(dǎo)致更加明顯的病變[14]。2種免疫抑制性病毒的協(xié)同作用加速了病情的發(fā)展，并且免疫抑制的禽類往往對(duì)疫苗沒有足夠的反應(yīng)，容易受到二次感染。由于免疫抑制病病毒的感染，雞群免疫能力下降，容易受到條件致病菌的繼發(fā)感染，在本病例中，2種免疫抑制病的混合感染加速病情發(fā)展的同時(shí)繼發(fā)感染大腸桿菌，進(jìn)而導(dǎo)致比較嚴(yán)重的腺胃炎。

近年來，多種病毒混合感染比單一感染導(dǎo)致的免疫抑制性疾病更加嚴(yán)重，我國(guó)普遍存在免疫抑制病毒REV和CAV的雙重感染，并且REV、CAV、ALV-J、MDV等幾種免疫抑制病病毒的混合感染也越來越多。目前，REV和ALV-J沒有商業(yè)化疫苗，在防控上只能通過雞場(chǎng)凈化來阻斷病毒的傳播。腺胃炎的發(fā)生在世界范圍內(nèi)逐漸增多，并且發(fā)病日齡的范圍逐漸擴(kuò)大，其病因、發(fā)病機(jī)制等尚不明確，在診斷和治療上存在很大困難，現(xiàn)只能做好防控。我們認(rèn)為免疫抑制病和腺胃炎的關(guān)系要聯(lián)系起來，從根源上了解腺胃炎的發(fā)生，多種病毒的混合感染誘發(fā)腺胃炎的情況應(yīng)該引起重視，免疫抑制病病毒和條件致病菌的早期防控對(duì)未來規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)的發(fā)展至關(guān)重要。