植物-耐鉛微生物聯(lián)合修復(fù)鉛污染土壤研究

姚潔,鮑立寧，姜宇,朱曙光,

(1.安徽建筑大學(xué) 環(huán)境與能源工程學(xué)院，安徽 合肥 230601；2.安徽建筑大學(xué) 水污染控制與廢水資源化安徽省重點實驗室，安徽 合肥 230601；3.安徽建筑大學(xué) 安徽省綠色建筑先進技術(shù)研究院，安徽 合肥 230601；)

重金屬污染日益嚴重，直接或間接地影響了生態(tài)系統(tǒng)和人類的生命健康。重金屬在土壤中的隱蔽性、潛伏性、長期性等特點，使其成為環(huán)境污染防治的重點和難點。生物修復(fù)技術(shù)作為新時期科技發(fā)展的產(chǎn)物，利用植物、微生物的生命代謝活動來減少環(huán)境中的有害物質(zhì)濃度，使被污染的環(huán)境能夠部分或完全恢復(fù)初始狀態(tài)[1]。目前生物修復(fù)技術(shù)主要包括植物修復(fù)、微生物修復(fù)和植物-微生物聯(lián)合修復(fù)三個方面。植物修復(fù)是利用超積累植物對土壤中的重金屬進行提取、吸收、轉(zhuǎn)化和固定等，在修復(fù)的同時改善生態(tài)環(huán)境[2]。微生物修復(fù)是通過細菌、真菌、藻類等微生物對土壤中的重金屬進行吸附與轉(zhuǎn)化[3]。植物-微生物聯(lián)合修復(fù)是在單一植物修復(fù)基礎(chǔ)上，將與植物共生或非共生微生物聯(lián)合起來，形成聯(lián)合修復(fù)體對受重金屬污染土壤進行修復(fù)，從而減輕土壤的重金屬污染[4-5]。植物-微生物聯(lián)合修復(fù)是目前生物修復(fù)重金屬污染土壤的一種有效方法。張勝爽[6]通過試驗發(fā)現(xiàn)黑麥草與擬青霉菌、嗜麥芽窄食單胞菌聯(lián)合作用，可以修復(fù)被重金屬污染的耕地土壤,黑麥草對鉛的富集主要集中在根部,種植接種菌株的黑麥草可達到修復(fù)土壤污染的目的。江春玉等[7]從土壤樣品中篩選出一株鉛鎘抗性細菌，接種該菌株能使印度芥菜和油菜的生物量及植株內(nèi)的鉛鎘總含量均顯著增加。通過接種重金屬抗性菌株，增強了不同植物對重金屬的富集作用，證明了植物與重金屬抗性菌株聯(lián)合作用可以降低土壤中重金屬的含量，減少土壤重金屬污染。

選取袖珍椰子和鳳尾蕨兩種景觀植物分別與寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonaspavanii)協(xié)同修復(fù)重金屬鉛污染的土壤，研究袖珍椰子和鳳尾蕨兩種植物的株高、葉綠素、重金屬鉛含量和酶活。根據(jù)結(jié)果分析植物—耐鉛微生物聯(lián)合修復(fù)對土壤中鉛去除效果的影響，試圖進一步發(fā)現(xiàn)植物在聯(lián)合修復(fù)體系中所起的作用，為今后研究植物—微生物聯(lián)合修復(fù)土壤重金屬污染提供技術(shù)支撐與積累。

1 材料與方法

1.1 供試細菌、植物及土壤

試驗菌株篩選樣品采自某工廠處理水的剩余污泥，從污泥樣品中用含鉛培養(yǎng)基篩選出多株微生物菌株，經(jīng)篩選鑒定后最終選出一株抗性最好的菌株，為寡養(yǎng)單胞菌屬，文中該菌株用W表示[8]。

供試植物選取袖珍椰子(ChamaedoreaelegansMart)和鳳尾蕨(PteriscreticaL.var.nervosa)，均購自合肥花鳥市場。試驗土壤為安徽建筑大學(xué)南校區(qū)綠化土壤，土壤基本理化參數(shù)為：pH值為7.32，有機質(zhì)含量為6.43 %，總氮濃度為405.41 mg/kg，速效磷濃度為10.33 mg/kg、速效鉀濃度為26.67 mg/kg，重金屬鉛濃度為0.113 mg/kg。

1.2 試驗設(shè)計

稱取Pb(NO3)2溶于蒸餾水，制備Pb2+濃度分別為0、200、400、800、1 500、2 000 mg/L的溶液。在30 d內(nèi)分別用500 mL不同濃度的Pb溶液每3 d澆灌一次試驗土壤，各濃度土壤充分混合后老化30 d。盆栽試驗設(shè)計采用同上6種濃度梯度的Pb溶液，將長勢一致的袖珍椰子和鳳尾蕨分別栽種至不同Pb濃度的花盆中，每一濃度均設(shè)置平行樣。每種植物在不同濃度下的試驗均設(shè)計不接種菌株的空白對照組和接種W菌株的試驗組，接種菌株采用接觸生長法，將制備好的相同濃度的菌液投加到相應(yīng)的不同鉛濃度花盆的植物根系附近[9]，每隔7 d用Hoagland營養(yǎng)液澆灌一次，待植物生長60 d后，取其進行相關(guān)指標測定。

1.3 植物生理指標、鉛含量及酶活的測定試驗

1.3.1 植物生物量測定

待植物生長60 d后，將其從不同Pb2+濃度的盆中連根挖出。在離子水將植物洗滌干凈后，用吸水紙將水分充分吸干，量出袖珍椰子和鳳尾蕨在不同濃度下的株高，判斷其生長情況。

1.3.2 植物葉綠素測定

剪取植物葉片中間部分，稱0.25 g葉片，加蒸餾水研磨。吸取研磨勻漿加蒸餾水至體積為5 mL。吸取1 mL樣品，加丙酮4 mL，離心機離心(6 000 r/min，10 min)，取上清液。以80%丙酮作為空白對照，分別測OD663和OD645，按下列公式計算植物葉片中葉綠素含量[10]：

Ca=12.72×OD663-2.59×OD645，

Cb=22.88×OD645-4.67×OD663，

C總=Ca+Cb=8.05×OD663+20.29×OD645,

其中:Ca為葉綠素a的含量;Cb為葉綠素b的含量;C總為葉綠素的總含量。

1.3.3 植物鉛含量測定

植物體內(nèi)Pb2+含量的測定采用硝酸-高氯酸消解法，將植物樣品在160 ℃下用密閉的聚四氟乙烯罐消煮至澄清。消煮后的溶液用稀硝酸洗至容量瓶中并用蒸餾水定容至100 mL，樣品液經(jīng)稀釋過濾后用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(Optima 8 000，Perkinlimer)測定Pb2+濃度[11]。

1.3.4 植物酶活測定

植物過氧化氫酶(CAT)采用紫外吸收法進行測定[12]，過氧化物酶(POD)采用愈創(chuàng)木酚比色法[12]進行測定，植物超氧化物歧化酶(SOD)采用氯化硝基四氮唑藍光化還原法[12]進行測定，對各指標進行三次測定后取其平均值。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同Pb2+濃度處理下接種W菌株對植物株高的影響

土壤中重金屬鉛污染脅迫對植物的影響最直觀地表現(xiàn)在植物生長指標上。在不同鉛濃度脅迫下分別測定袖珍椰子和鳳尾蕨的株高，結(jié)果如圖1所示。

(a)袖珍椰子株高

60 d生長周期后，在低鉛濃度(0～400 mg/L)時袖珍椰子和鳳尾蕨的株高均有所增加，而在Pb2+濃度超過400 mg/L時其株高逐漸減少。袖珍椰子和鳳尾蕨對鉛具有一定的耐受性，但超過一定程度，會抑制植物的生長。當土壤中鉛濃度較高時，植物根系吸收土壤中的鉛，Pb2+以沉淀和絡(luò)合物形式存在，當植物體內(nèi)的Pb2+到達臨界狀態(tài)后，高濃度鉛會對植物產(chǎn)生一定的毒害作用，進而抑制了植物生長。

與空白對照組相比，接種W菌株提高了兩種植物的株高，對植物的生長具有一定的促進作用。在0～800 mg/L的Pb2+濃度下，袖珍椰子的株高明顯高于對照組，在Pb2+濃度為200～400 mg/L時，株高分別增加了3.31%、2.77%。鳳尾蕨接W菌后在Pb2+濃度為0～200 mg/L時其株高分別增加了3.32%、2.53%，由此可以得出，在Pb2+脅迫作用下，接種W菌株的袖珍椰子和鳳尾蕨的生長指標受到重金屬鉛的毒害作用會降低，但接種W菌株促進植物生長的最優(yōu)條件不同，接菌對袖珍椰子的促進作用較鳳尾蕨更明顯。

2.2 不同Pb2+濃度處理下接種W菌株對植物葉綠素影響

植物葉綠素是反映植物吸收、轉(zhuǎn)化營養(yǎng)元素的重要指標。植物接種W菌株后，不同鉛濃度的脅迫對植物葉綠素的影響不同。由圖2可知，隨著土壤Pb2+濃度的增加，兩種植物的葉綠素含量均先上升后下降，說明袖珍椰子和鳳尾蕨在低濃度(0～400 mg/L)范圍通過植物體內(nèi)自我保護系統(tǒng)能減少重金屬Pb毒害作用，但超過這個濃度范圍植物的自我保護系統(tǒng)就可能減弱。

(a)袖珍椰子葉綠素

接種W菌株后的袖珍椰子和鳳尾蕨在不同Pb2+濃度下，植物葉片中葉綠素含量明顯高于不接菌的對照組。接菌后，袖珍椰子在Pb2+濃度為400 mg/L時,其葉片中葉綠素含量比空白組高5.91%，鳳尾蕨在Pb2+濃度為0 mg/L時,其葉片中葉綠素含量比空白組高3.97 %，與鳳尾蕨相比接種W菌株對袖珍椰子的促進作用更明顯。通過對植物葉片葉綠素含量分析得出，接種W菌株增加了袖珍椰子和鳳尾蕨葉片的葉綠素含量，有利于植物光合作用。

2.3 不同Pb2+濃度下接種W菌株對植物重金屬Pb含量的影響

將袖珍椰子和鳳尾蕨在不同Pb2+濃度下進行脅迫處理，經(jīng)60 d的周期培養(yǎng)后，植物地上和地下部分的Pb含量如圖3、圖4所示。

(a)地上部分鉛含量

(a)地上部分鉛含量

隨著土壤中Pb2+濃度增加，袖珍椰子和鳳尾蕨地上和地下部分的Pb含量均逐漸增加，說明兩種植物對Pb有明顯的吸收。在相同Pb2+濃度脅迫下，袖珍椰子和鳳尾蕨的地下部分Pb濃度均明顯高于地上部分，說明根部是袖珍椰子和鳳尾蕨富集重金屬Pb的主要器官。植物地下部分鉛濃度較高，其原因可能是由于根部細胞對Pb的富集，不斷積聚Pb2+，進行金屬離子的絡(luò)合和其他配位反應(yīng)，使重金屬的移動性能降低，進一步抑制Pb轉(zhuǎn)移至地上部分，從而緩解Pb脅迫的毒害[13]。

接種W菌株后與對照組相比，袖珍椰子和鳳尾蕨的地上部分在Pb2+濃度為2 000 mg/L時鉛含量分別增加了112.61%和12.87%，地下部分在Pb2+濃度為200 mg/L時鉛含量分別增加了108.99 %和113.01 %，說明在高鉛濃度(800～2 000 mg/L)環(huán)境下接種W菌株促進了袖珍椰子地上部分對Pb的富集，而二者的根系均在低鉛環(huán)境(0～400 mg/L)中對鉛的吸收能力更好。與對照組相比，接種W菌株加強了袖珍椰子和鳳尾蕨對鉛的富集，在耐鉛微生物作用下促進了植物對重金屬Pb的吸收，加強了袖珍椰子和鳳尾蕨的呼吸作用，有利于促進植物對重金屬的富集，增強了植物的耐受性。

2.4 不同Pb2+濃度處理下接種W菌株對植物酶活影響

CAT酶又稱觸酶，是植物中最重要的抗氧化酶之一，能催化細胞內(nèi)過氧化氫發(fā)生反應(yīng)，以降低植物細胞受到過氧化氫的危害，抑制植物細胞膜脂質(zhì)過氧化[14]。從圖5明顯看出，隨著土壤中Pb2+濃度的增加，袖珍椰子和鳳尾蕨的CAT酶活性先上升后下降，其中空白對照組的袖珍椰子CAT酶活性在800 mg/L鉛濃度時酶活明顯下降。在未接種菌株的對照組中，在鉛濃度為400～2 000 mg/L時袖珍椰子CAT酶活比鳳尾蕨CAT酶活的耐鉛能力更好。

(a)袖珍椰子CAT酶活

對比空白對照和接種菌株后的植物CAT酶活，可以看出接種菌株后其酶活總體上較對照組有增加，尤其鳳尾蕨接菌后在800～2 000 mg/L CAT酶活性顯著增加。當Pb2+濃度為200 mg/L時，袖珍椰子、鳳尾蕨的CAT酶活性均達到最大值，約為對照組的1.33 倍和1.03 倍，說明在重金屬鉛的脅迫反應(yīng)中接種菌株增強了植物的CAT酶活性，對植物生長有一定促進作用。

植物在高濃度范圍出現(xiàn)CAT酶活性降低的現(xiàn)象，可能是植物在低濃度鉛(0～400 mg/L)時對Pb的耐受性較好，高濃度鉛(800～2 000 mg/L)脅迫會造成植物體內(nèi)的多種功能膜及酶系統(tǒng)受到一定程度的破壞，影響植物的正常生長。不同濃度對二者的促進作用不同，接種W菌株后袖珍椰子在低鉛濃度時CAT酶活性較對照組明顯增加而鳳尾蕨則是在高濃度鉛時酶活增加最明顯。

POD酶是植物體內(nèi)的一種氧化還原酶，在抑制植物細胞膜脂質(zhì)過氧化、清除超氧自由基和減少活性氧傷害等方面發(fā)揮著重要作用[14]。從圖6看出，隨著土壤中Pb2+濃度的增加，接W菌后的袖珍椰子和鳳尾蕨中POD酶活性先升高后下降。與對照組相比,接種W菌株增強了植物POD酶的活性，接菌后袖珍椰子POD酶活性在Pb2+濃度為800 mg/L時到達了酶活性的最大值，約為對照組的1.07 倍。接菌后的鳳尾蕨POD酶活性Pb2+濃度為400 mg/L時達到了酶活性的最大值，約為對照組的2.64 倍,其原因可能是高濃度(800～2 000 mg/L)Pb脅迫會使植物體內(nèi)的酶系統(tǒng)受到一定程度的破壞，影響植物的正常生長。接種W菌株后在低鉛濃度時鳳尾蕨POD酶活性的促進作用比袖珍椰子明顯，袖珍椰子在高鉛濃度時接種菌株的促進作用更顯著。

(a)袖珍椰子POD酶活

SOD酶是存在于植物體內(nèi)起關(guān)鍵作用的一種防御酶，能減少氧自由基，在植物細胞受氧化傷害方面起重要保護作用[14]。由圖7可知，隨著Pb2+濃度的升高，袖珍椰子和鳳尾蕨的SOD酶活性一直持續(xù)下降且下降速度較快，其原因可能是重金屬鉛脅迫對植物SOD酶活性有較強的抑制作用，Pb2+在植物體內(nèi)不斷累積導(dǎo)致了大量的自由基產(chǎn)生，自由基的積累水平超過了SOD的清除能力，植物的SOD酶活性受到一定影響。

(a)袖珍椰子SOD酶活

袖珍椰子接種W菌株在Pb2+濃度為400 mg/L時SOD酶活性較對照組明顯提高，約為對照組的1.53倍。而鳳尾蕨在整個鉛脅迫過程中其SOD酶活均高于對照組，鳳尾蕨在Pb2+濃度為800 mg/L時SOD酶活性約為對照組的1.09倍。接種W菌株明顯促進了鳳尾蕨的SOD酶活性，袖珍椰子接種W菌株后其SOD酶活在Pb2+濃度為0～400 mg/L時明顯提高。

在鉛脅迫條件下，W菌株與植物聯(lián)合修復(fù)，提高了植物CAT酶、POD酶及SOD酶的活性，減輕了鉛脅迫的毒害作用，增強了植物對鉛的耐受性。但植物的種類和Pb2+濃度的不同，接種耐鉛微生物對植物酶活的促進效應(yīng)也不相同。在所有植物酶活試驗處理中，與對照組相比接種耐鉛菌株在低鉛濃度時袖珍椰子CAT、鳳尾蕨的POD酶活、袖珍椰子SOD酶活明顯增加；而在高濃度鉛環(huán)境下鳳尾蕨CAT酶活、袖珍椰子POD酶活、鳳尾蕨SOD酶活增加更明顯。

在重金屬Pb的脅迫下，耐鉛微生物與植物聯(lián)合修復(fù)重金屬鉛污染土壤，結(jié)果表明：通過耐鉛微生物和植物的協(xié)同修復(fù)機制，強化了微生物在植物中的作用，微生物可通過自身作用吸收Pb2+，降低了土壤中重金屬Pb的毒害程度，從而對植物生長起到促生作用，植物抵抗重金屬Pb毒害的同時也提高了微生物的抗重金屬能力，促進了袖珍椰子和鳳尾蕨的生長[15-16]；另一方面,接種耐鉛微生物對重金屬Pb污染土壤的修復(fù)有一定的促進作用，微生物在植物—耐鉛微生物聯(lián)合修復(fù)的過程中發(fā)揮重要作用，產(chǎn)生了有機酸，活化了土壤中的Pb2+，增強了植物的酶活[17];同時,微生物代謝過程中會分泌物如有機酸、鐵載體、表面活性劑、螯合劑等可改變土壤中重金屬Pb的存在形態(tài)，富集土壤中的營養(yǎng)物質(zhì)，促進袖珍椰子和鳳尾蕨的生長和對重金屬Pb2+的吸收和轉(zhuǎn)運，進而提高了聯(lián)合修復(fù)對重金屬鉛污染土壤的修復(fù)效率[15-17]。

3 結(jié)論

試驗研究了植物—耐鉛微生物聯(lián)合修復(fù)重金屬鉛污染土壤的效果，結(jié)果表明接種耐鉛微生物緩解了重金屬Pb對植物的毒害作用，利用植物的提取作用將重金屬Pb大量積累在植物根部，降低了土壤中重金屬Pb對植物的毒害程度,具體試驗結(jié)論如下：

1)未接種耐鉛微生物的袖珍椰子和鳳尾蕨隨著土壤中Pb2+濃度的增加，其株高的變化趨勢為先增加后下降，說明高濃度鉛抑制了植物的生長。在Pb2+脅迫作用下，接種耐鉛菌株均提高了袖珍椰子和鳳尾蕨的株高，促進了袖珍椰子和鳳尾蕨的生長，其對袖珍椰子的促進作用更明顯。植物生長受Pb脅迫的影響降低，接種菌株后其代謝與生存改善了土壤內(nèi)部環(huán)境，有利于袖珍椰子和鳳尾蕨在鉛脅迫環(huán)境下進行光合作用。

2)袖珍椰子和鳳尾蕨在經(jīng)歷60 d的生長周期后由于根部細胞不斷積聚Pb2+，進行金屬離子的絡(luò)合和其他配位反應(yīng)，使Pb的移動性能降低，抑制了Pb從植物根際轉(zhuǎn)移至地上部分，從而緩解Pb脅迫對植物的毒害。接種耐鉛微生物均促進了袖珍椰子和鳳尾蕨對土壤中重金屬鉛的富集作用，由于微生物的代謝活動，增加了植物對Pb的耐受能力，促進植物的生長。

3)在鉛脅迫條件下，通過耐鉛微生物的作用增強了袖珍椰子和鳳尾蕨的CAT酶、POD酶及SOD酶活性，減輕了鉛脅迫對植物的毒害作用，增強了植物對鉛的耐受性。植物酶活性與植物的種類、鉛的脅迫程度有關(guān)，不同植物對Pb的耐受性存在差異，同種植物對不同程度Pb脅迫的反應(yīng)機制也不相同。所有植物酶活實驗處理中，與對照組比較在低鉛濃度環(huán)境下接種耐鉛菌株對鳳尾蕨的POD酶活、袖珍椰子的CAT和SOD酶活的促進效果明顯；而在高濃度鉛環(huán)境下接種菌株對袖珍椰子的POD酶活、鳳尾蕨CAT和SOD酶活的增加更明顯。