2,4-表油菜素內(nèi)酯處理對不同溫度貯藏中小白菜品質(zhì)和生理生化的影響

王軍萍，宋留麗,2，郁志芳,

（1.南京農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，江蘇 南京 210095；2.安徽師范大學生命科學學院，安徽 蕪湖 241003）

小白菜（Brassica chinensisL.）為十字花科蕓薹屬綠葉蔬菜，其含水量高、組織脆嫩、呼吸旺盛、水分蒸發(fā)快，貯藏期間易發(fā)生萎蔫、黃化等情況，品質(zhì)劣變迅速，貯藏時間短。其中，黃化是小白菜采后衰老過程中最為顯著的外在表現(xiàn)，這一現(xiàn)象主要是源于葉綠素的快速降解。葉綠素降解的主要途徑是脫鎂葉綠酸a單加氧酶（Pheophorbide a monooxygenase，PaO）途徑[1]和氧化漂白途徑[2]。參與PaO途徑的主要酶有葉綠素酶（chlorophyllase，CLH）、脫鎂螯合酶（Mg-dechelatase，MDCase）和脫鎂葉綠素水解酶（pheophytin pheophorbide hydrolase，PPH）[3]。過氧化物酶（peroxidase，POD）和脂氧合酶（lipoxygenase,LOX）是氧化漂白途徑中的主要酶，參與活性氧的生成。果蔬在衰老或受到脅迫時，大量自由基在葉綠體、線粒體和過氧化物酶體中產(chǎn)生，如超氧陰離子（superoxide anion，O2-·）和過氧化氫（hydrogen peroxide，H2O2）[4]。自由基會直接攻擊DNA、蛋白質(zhì)和脂類，引發(fā)氧化應激，造成細胞膜脂過氧化，生成丙二醛（malondialdehyde，MDA）[5]。MDA的積累增加了細胞膜的通透性，不僅會造成葉綠體和線粒體等細胞器的損傷，而且加大了葉綠素降解酶與葉綠素相互接觸的機會，最終加速葉綠素的降解[6]。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase， CAT）和抗壞血酸過氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）等抗氧化酶能清除活性氧，減輕其對細胞的損傷。

目前，延緩小白菜葉綠素降解、維持其品質(zhì)的主要方法有采后的1-甲基環(huán)丙烯[7]和硫化氫[8]處理，貯前真空預冷[9]、貯藏期間的光照處理[10]、超聲波和氣調(diào)貯藏[11]等。油菜素內(nèi)酯（brassinolide，BR）作為一種天然的甾體類植物激素，具有安全、無害、高效、附加成本低等優(yōu)點[12]。2,4-表油菜素內(nèi)酯（2,4-epibrassinolide, EBR）是其中的一種人工合成類似物，近年來在園藝產(chǎn)品中得到了一定的研究。EBR通過誘導烏菜抗氧化酶活性減緩其品質(zhì)下降，延長貯藏時間[13]。EBR可以抑制黃花菜體內(nèi)H2O2的積累，減輕膜脂過氧化作用，保持膜的完整性，進而延緩果實的衰老進程[14]。研究還表明，低濃度EBR通過抑制乙烯合成途徑中相關(guān)酶以及葉綠素降解酶的活性，有效抑制了西蘭花葉綠素的降解和黃化，而高濃度處理則促進黃化[15]。然而，目前有關(guān)采后EBR處理對小白菜保鮮效果的研究還未見報道。

本文以‘上海青’為材料，研究采后EBR處理對2 ℃和20 ℃貯藏條件下小白菜品質(zhì)和生理生化的影響，探討EBR處理對不同溫度下小白菜的保鮮效果和調(diào)控機制，旨在為綠色果蔬在實際生產(chǎn)中的貯藏保鮮應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

小白菜 品種為南京地產(chǎn)‘上海青’，于2020年11月1日購自江蘇南京眾彩批發(fā)市場，1 h內(nèi)運回實驗室。挑選成熟度一致、大小相近、無黃葉、無機械損傷的小白菜用于實驗；2,4-表油菜素內(nèi)酯（EBR，純度≥95%）、氮藍四唑（NBT） 上海瑞永生物科技有限公司；無水乙醇、氫氧化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、氯化鉀、甲醇、磷酸二氫鈉 華大；碳酸鈣、氯化羥胺、乙二胺四乙酸二鈉（EDTANa2） 西隴科學股份有限公司；三氯乙酸、硫代巴比妥酸（TBA）、乙酸鈉、愈創(chuàng)木酚、對氨基苯磺酸、H2O2滬試；硼酸、硼酸鈉 上海凌峰化學試劑有限公司；吐溫-20、蛋氨酸（Met） 北京索萊寶科技有限公司；亞油酸鈉、核黃素、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、正己烷、ASA、Triton X-100、α-萘胺 麥克林；三羥甲基氨基甲烷（Tris） 北京博奧拓科技有限公司；葉綠素ab混合物（10%，BR） 上海源葉生物科技有限公司；以上試劑無特殊說明均為分析純。

DJ300精密電子天平 北京賽多利斯系統(tǒng)有限公司；CR-400 CHROMA METER色差儀 日本柯尼卡美能達有限公司；Dansensor CheckMate3臺式頂空分析儀 丹麥PBI Dansensor公司；Alpha-1860A紫外可見分光光度計 上海譜元儀器有限公司；H1750R臺式高速冷凍離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司；XW-80A微型渦旋混合儀 上海滬西儀器廠有限公司；A11分析用研磨機 德國IKA；FE30實驗室電導率儀 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；4000LX日光燈 日本松下電器（中國）有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品處理與貯藏 將挑選好的小白菜隨機分成兩組，一組以1.0 mg/L的EBR溶液以100 mL/kg的量對小白菜進行噴灑處理，另一組作為對照（control，CK），用等量的蒸餾水進行噴灑處理。處理完成后，將小白菜表面水分晾干，用樣品筐進行分裝，并用黑色聚乙烯薄膜袋挽口套裝，分別置于2 ℃和20 ℃條件下貯藏。貯藏期間，2 ℃下的小白菜在第0、3、7、12、18 d取樣，20 ℃下的小白菜在第0、1、3、5、7 d取樣。取樣部位為小白菜由外向內(nèi)第二層葉片，并避開主葉脈與葉片邊緣。同時，用液氮速凍部分樣品，置于?20 ℃冰箱。每個取樣點設(shè)置三個生物學重復。

1.2.2 色差和葉綠素含量 色差利用手持式CR-400色差儀對樣品的L*、C*、H值進行測定。每個處理選取15顆小白菜，每顆小白菜選取兩個葉片，每個葉片選擇中上部對稱的兩個點進行測定，并計算平均值。

葉綠素含量參考劉紅艷[16]的方法并略加改動。稱取0.5 g樣品，加入0.1 g碳酸鈣粉末及10 mL體積分數(shù)為95%的乙醇，充分研磨，避光浸提至組織變白，在4 ℃、12000×g下離心20 min，取上清液并定容，測定上清液在470、649、665 nm處的吸光值。按下列公式計算，最終結(jié)果表示為mg/g。

式中，Ca表示葉綠素a濃度，mg/g；Cb表示葉綠素b濃度，mg/g；Cchl表示總?cè)~綠素含量，mg/g；A665nm表示在665 nm處的吸光值；A649nm表示在649 nm處的吸光值；V表示提取液總體積，mL；m表示樣品質(zhì)量，g。

1.2.3 呼吸強度 采用臺式頂空分析儀測定呼吸強度。挑選3顆大小均一的小白菜，放入3 L的密閉玻璃罐中在20 ℃條件下放置2 h，各處理及平行樣品的質(zhì)量基本保持相近。按下列公式計算，最終結(jié)果表示為CO2mg·kg?1·h?1。

式中，1.96×103g/L為CO2密度；A%為呼吸儀測定的CO2數(shù)值；V為呼吸罐體積，L；t為測定時間，h；m為樣品質(zhì)量，kg。

1.2.4 葉綠素降解相關(guān)酶活性 粗酶液制備及酶活性測定參考FUNAMOTO等[17]方法并略有改動。準確稱取1.0 g樣品，加入6 mL預冷丙酮后充分勻漿，置于?20 ℃下20 min，于4 ℃、12000×g離心20 min，去除上清液，重復數(shù)次，直至沉淀無綠色為止。向沉淀中加入6 mL磷酸緩沖液（5 mmol/L，pH7.0，包括50 mmol/L KCl，0.24% Triton-X100），30 ℃抽提1 h，于4 ℃、12000×g離心20 min，取上清液為粗酶液用于酶活性的測定。

按照FUKASAWA等[18]方法制備100 μg/mL葉綠素a-丙酮、100 μmol/L葉綠酸a和10 μmol/L脫鎂葉綠素a。

1.2.4.1 葉綠素酶（CLH）活性 取0.5 mL粗酶液，加入1.5 mL磷酸緩沖液（0.1 mol/L，pH7.5），0.7 mL 1.44%Triton-X100，0.3 mL 100 μg/mL的葉綠素a-丙酮溶液，混合液在30 ℃黑暗反應40 min后加入3 mL預冷丙酮終止反應，再加入3 mL正己烷萃取脫植基葉綠素a，劇烈搖動，4 ℃下12000×g離心10 min，以不加酶液作為對照。取丙酮層測定667 nm處吸光值。以每分鐘內(nèi)吸光度變化0.01為1個酶活力單位，單位記為U g?1FW。

1.2.4.2 脫鎂螯合酶（MDCase）活性 取0.5 mL粗酶液，加入0.2 mL 1% TritonX-100，0.7 mL Tris-HCl緩沖液（50 mmol/L，pH8.0），0.3 mL 100 μmol/L葉綠酸a。混合液在30 ℃黑暗反應40 min后，于686 nm處測定吸光值。以每分鐘內(nèi)吸光度變化0.01為1個酶活力單位，單位記為U g?1FW。

1.2.4.3 脫鎂葉綠素水解酶（PPH）活性 取0.5 mL酶液，加入75 μL 2% Triton X-100，0.1 mL 10 μmol/L脫鎂葉綠素a，0.7 mL Tris-HCl（50 mmol/L，pH8.0），于暗處30 ℃反應60 min，加入3 mL丙酮終止反應。向其中加入3 mL正己烷萃取脫植基葉綠素a，劇烈搖動，4 ℃下12000×g離心10 min。取丙酮層測定535 nm處吸光值。以每分鐘內(nèi)吸光度變化0.01為1個酶活力單位，單位記為U g?1FW。

1.2.5 SOD、CAT、APX、POD和LOX活性測定

1.2.5.1 SOD活性 SOD測定采用NBT法[19]。稱取0.5 g樣品，加入6 mL磷酸鈉緩沖液（50 mmol/L，pH7.8），勻漿，于4 ℃、12000×g離心20 min，收集上清液即為粗酶液。試管中加入0.1 mL粗酶液、1.5 mL磷酸鈉緩沖液、0.3 mL Met、0.3 mL NBT、0.3 mL EDTA-Na2、0.3 mL核黃素、0.5 mL蒸餾水。暗中對照管加入核黃素后立即避光，全部試劑加完后搖勻。將測定管與光下對照管放在4000 LX日光燈下顯色反應60 min。反應結(jié)束后用黑布遮蓋終止反應。以暗中對照管作為調(diào)零管，取上清液測定在560 nm下光下對照管與測定管的吸光度。將抑制NBT光還原的50%為1個酶活性單位，結(jié)果表示為U g?1FW。

1.2.5.2 CAT活性 CAT活性測定參考曹建康等[19]并略有改動。稱取0.5 g樣品，加入6 mL磷酸鈉緩沖液（50 mmol/L，pH7.0），于4 ℃、12000×g離心20 min，收集上清液即為粗酶液。反應體系中加入1.7 mL蒸餾水、1.0 mL Tris-HCl（pH7.0）、0.2 mL H2O2（200 mmol/L）、最后加入0.2 mL上清液啟動反應，立即測定240 nm處吸光值的變化，以每克樣品每分鐘吸光度變化0.01為1個酶活性單位，結(jié)果表示為U g?1FW。

1.2.5.3 APX活性 APX活性測定粗酶液提取同CAT[19]。反應體系中加入0.1 mL酶液，1.4 mL APX反應液（50 mmol/L K2HPO4-KH2PO4緩沖液，pH7.0，內(nèi) 含0.1 mmol/L EDTA-Na2，0.3 mmol/L ASA，0.06 mmol/L H2O2），立即測定290 nm處吸光值，以每克樣品每分鐘吸光度變化0.01為1個酶活性單位，結(jié)果表示為U g?1FW。

1.2.5.4 POD活性 POD活性的測定采用愈創(chuàng)木酚法[19]。稱取0.5 g樣品，加入5 mL磷酸鈉緩沖液（100 mmol/L，pH6.0），勻漿，于4 ℃、12000×g離心20 min，收集上清液即為粗酶液。取酶液0.05 mL，加入3 mL POD反應混合液（含磷酸緩沖液，愈創(chuàng)木酚和H2O2）啟動反應，每隔1 min記錄470 nm處的吸光值，連續(xù)記錄6 min。POD以每克樣品每分鐘內(nèi)吸光值變化0.01為1個酶活力單位，結(jié)果表示為U g?1FW。

1.2.5.5 LOX活性 LOX活性測定參考曹建康等[19]并略有改動。取1.0 g樣品，加入6 mL預冷的磷酸緩沖液（0.1 mol/L，pH7.5），勻漿，于4 ℃、12000×g離心20 min，上清液即為粗酶液。取0.1 mL粗酶液，加入4.75 mL乙酸鈉緩沖液和0.15 mL亞油酸鈉底物，于234 nm處測定吸光值。以每克樣品每分鐘吸光度變化0.01為1個酶活性單位，結(jié)果表示為U g?1FW。

1.2.6 O2-·、H2O2和MDA含量測定

1.2.6.1 O2-·含量 O2-·含量參考曹建康等[19]并略有改動。稱取1.0 g樣品，加入4 mL磷酸鈉緩沖液（pH7.8，65 mmol/L），混勻后靜置提取10 min，4 ℃、12000×g離心20 min。取3 mL上清液，加入1 mL pH7.8、65 mmol/L磷酸緩沖液和10 mmol/L鹽酸羥胺1 mL，于25 ℃保溫20 min。取出后再依次加入17 mmol/L的對氨基苯磺酸1 mL和7 mmol/L的α-萘胺溶液1 mL，在25 ℃下反應30 min，反應后測定530 nm處吸光值。標準曲線通過亞硝酸鉀來制定，以超氧陰離子物質(zhì)的量為橫坐標，吸光值為縱坐標，標準曲線方程為：y=3.5879x+0.0014，R2=0.9998。最終的O2?·含量表示為nmol min?1g?1FW。

式中，n表示從標準曲線查得的超氧陰離子的量，μmol；V表示提取液總體積，mL；VS表示測定用樣品液體積，mL；m表示樣品質(zhì)量，g；t表示樣品與羥胺反應的時間，min。

1.2.6.2 H2O2含量 H2O2含量參考曹建康等[19]并略有改動。稱取1.0 g樣品，加入5 mL預冷丙酮，4 ℃、12000 ×g離心20 min。吸取1 mL上清液，加入0.1 mL 20%硫酸鈦和0.2 mL濃氨水，25 ℃反應10 min后離心，去上清液，沉淀中加入2 mL丙酮進行洗脫，離心，去上清，重復兩次，沉淀中加入2 mol/L的硫酸3 mL，等沉淀完全溶解后測定415 nm處吸光值，按同樣的方法制作H2O2標準曲線，以H2O2物質(zhì)的量為橫坐標，吸光值為縱坐標，標準曲線方程為：y=1.6871x?0.0063，R2=0.9998。最終的H2O2含量表示為μmol g?1FW。計算公式如下：

式中，n表示標準曲線上查得樣品中H2O2的量，μmol；V表示樣品提取液總體積，mL；VS表示測定時用樣品提取液的體積，mL；m表示樣品質(zhì)量，g。

1.2.6.3 MDA含量 MDA含量采用硫代巴比妥酸法[19]。稱取2.0 g樣品，加入5 mL 10%的TCA溶液，勻漿，于4 ℃、12000×g離心20 min，收集上清液。取2 mL上清液，加入2 mL 0.67%的TBA溶液，混勻，煮沸30 min，冷卻之后測定532 nm和600 nm波長處的吸光值，按以下公式計算MDA含量。

式中，V表示提取液總體積，mL；0.155表示消光系數(shù)155 μmol?1cm?1，為1 μmol丙二醛在532 nm處的吸光值；VS表示測定用樣品液體積，mL；m表示樣品質(zhì)量，g。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2013 進行基礎(chǔ)數(shù)據(jù)整理，所有數(shù)據(jù)均為三生物學樣品的平均值；應用IBM SPSS Statistics 25軟件進行差異顯著性分析，并將P<0.05定義為具有顯著性差異；應用Origin 2021進行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 采后EBR處理對小白菜2 ℃和20 ℃貯藏期間色澤、葉綠素含量和外觀的影響

新鮮的小白菜隨著貯藏時間的延長，葉片逐漸褪綠黃化。如圖1A、B 所示，2 ℃和20 ℃貯藏期間，EBR處理和對照的小白菜L*值均持續(xù)上升，H值不斷下降，其中，2 ℃條件下二個指標的變化速率較20 ℃條件下的變化速率更為平緩，表明低溫較常溫更能有效延緩小白菜色澤變化。EBR處理在2 ℃和20 ℃條件下均有效抑制L*值的上升和H值的下降，且20 ℃條件下EBR對二者抑制程度更顯著。

由圖1C～圖1E可知，小白菜總?cè)~綠素、葉綠素a和葉綠素b含量整體上隨貯藏時間的延長而逐漸下降。20 ℃貯藏期間，各指標含量下降迅速，而2 ℃貯藏各指標下降緩慢。EBR處理在不同溫度下延緩小白菜中葉綠素含量下降的程度有所不同。20 ℃貯藏期間，經(jīng)EBR處理的小白菜總?cè)~綠素、葉綠素a和葉綠素b含量均顯著高于對照小白菜（P<0.05），貯藏結(jié)束時它們的含量均是對照小白菜的1.45倍以上。而在2 ℃條件下，EBR處理僅在貯藏后期可顯著延緩葉綠素含量的下降（P<0.05）。表明EBR處理在2 ℃和20 ℃貯藏條件下均能延緩總?cè)~綠素、葉綠素a和葉綠素b含量的下降，且在20 ℃下效果更明顯。

圖1 2 ℃和20 ℃貯藏期間EBR處理對小白菜L*值、H值和葉綠素含量的影響Fig.1 Effect of EBR on the lightness value, hue angle value, chlorophyll content of pakchoi during storage at 2 ℃ and 20 ℃

由圖2可見，小白菜貯藏于2 ℃與20 ℃條件下，隨貯藏時間延長，外觀品質(zhì)明顯下降，出現(xiàn)黃化、腐爛、失水等現(xiàn)象，兩溫度下貯藏，其品質(zhì)變化差異較大。20 ℃條件下，對照組在第5 d出現(xiàn)黃化，葉柄基部失水并有輕微腐爛跡象，第7 d葉片黃化和腐爛加重；EBR處理小白菜第5 d時仍保持良好的外觀性狀，第7 d黃化癥狀開始出現(xiàn)。2 ℃條件下，小白菜黃化速度明顯減慢，在第18 d對照組出現(xiàn)輕微黃化，EBR處理小白菜仍保持良好的外觀性狀。由此可見，EBR處理在2 ℃和20 ℃貯藏條件下均能不同程度地延緩小白菜外觀品質(zhì)的下降，其中，20 ℃條件下保鮮效果更明顯。

圖2 2 ℃和20 ℃貯藏期間EBR處理對小白菜外觀品質(zhì)的影響Fig.2 Effect of EBR on the appearance quality of pakchoi during storage at 2 ℃ and 20 ℃

綜上可見，與常溫20 ℃貯藏相比，低溫2 ℃貯藏更能使小白菜保持較好的色澤指標（低L*值，高H值），較高的總?cè)~綠素、葉綠素a和葉綠素b含量，以及較好的外觀品質(zhì)。此外，EBR處理可有效延緩2 ℃和20 ℃貯藏期間小白菜L*值的上升，H值的下降，總?cè)~綠素、葉綠素a和葉綠素b的降解，以及外觀品質(zhì)的劣變，其中，對20 ℃貯藏條件小白菜各指標的影響更明顯。

2.2 采后EBR處理對小白菜2 ℃和20 ℃貯藏期間呼吸強度的影響

由圖3可見，2 ℃條件下，兩組小白菜呼吸強度先下降后上升，且EBR處理的小白菜呼吸強度在第7 d后顯著低于對照小白菜呼吸強度（P<0.05）。20 ℃貯藏期間，兩組小白菜呼吸強度整體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在第3 d達到峰值。經(jīng)EBR處理的小白菜在貯藏過程中呼吸強度均顯著低于對照小白菜（P<0.05），貯藏第7 d，對照小白菜呼吸強度是EBR處理小白菜的1.29倍。圖3還顯示，20 ℃貯藏期間小白菜的呼吸強度始終顯著的大于2 ℃的呼吸強度（P<0.05）。結(jié)果表明，低溫貯藏比常溫貯藏更能維持小白菜較低的呼吸強度，且EBR處理可以顯著降低2 ℃和20 ℃下小白菜的呼吸強度，其中，對20 ℃貯藏的小白菜呼吸強度的抑制效果更為明顯。

圖3 2 ℃和20 ℃貯藏期間EBR處理對小白菜呼吸強度的影響Fig.3 Effect of EBR on the respiration intensity of pakchoi during storage at 2 ℃ and 20 ℃

2.3 采后EBR處理對小白菜2 ℃和20 ℃貯藏期間葉綠素降解酶活性的影響

由圖4可知，2 ℃和20 ℃貯藏期間，小白菜CLH、MDCase和PPH活性整體呈先上升后下降的趨勢。2 ℃貯藏前期CLH活性較低，說明低溫能夠有效降低CLH活性（圖4A）。

20 ℃貯藏期間，兩組小白菜CLH活性均在第5 d達到峰值，此時EBR處理小白菜CLH活性低于對照小白菜31.58%。2 ℃和20 ℃下，EBR處理小白菜MDCase活性均顯著低于對照小白菜（P<0.05），且在第3 d時，其MDCase活性分別低于對照小白菜31.17%和33.82%（圖4B）。在2 ℃和20 ℃貯藏過程中，EBR處理的小白菜PPH活性分別低于同時期對照小白菜（圖4C）。綜上，低溫貯藏比常溫貯藏更能維持小白菜較低的CLH、MDCase和PPH活性，且EBR處理可以有效降低2 ℃和20 ℃貯藏條件下小白菜葉綠素降解相關(guān)酶的活性，其中對20 ℃貯藏的小白菜葉綠素降解酶的抑制效果更為顯著。

圖4 2 ℃和20 ℃貯藏期間EBR處理對小白菜CLH、MDCase和PPH活性的影響Fig.4 Effect of EBR on the CLH，MDCase and PPH activity of pakchoi during storage at 2 ℃ and 20 ℃

2.4 采后EBR處理對小白菜2 ℃和20 ℃貯藏期間SOD、CAT、APX、 POD和LOX活性的影響

SOD、CAT和APX是具有清除活性氧作用的抗氧化酶。如圖5（A）顯示，2 ℃和20 ℃貯藏期間，小白菜SOD活性均先上升后下降。2 ℃貯藏3 d后，EBR處理的小白菜SOD活性顯著高于對照小白菜（P<0.05）；20 ℃貯藏過程中，EBR處理的小白菜SOD活性始終大于對照，在第5 d時，EBR處理的小白菜SOD活性是對照小白菜的1.62倍。圖5（B）所示，2 ℃下CAT活性不斷上升直至貯藏結(jié)束；而20 ℃下CAT活性先上升后下降，第3 d達到最大值。在兩溫度下，經(jīng)EBR處理的小白菜CAT活性均顯著高于對照小白菜（P<0.05）。

圖5 2 ℃和20 ℃貯藏期間EBR處理對小白菜SOD、CAT、APX、POD和LOX活性的影響Fig.5 Effect of EBR on the SOD, CAT, APX, POD and LOX activity of pakchoi during storage at 2 ℃ and 20 ℃

圖5（C）可見，2 ℃貯藏下，小白菜APX活性呈現(xiàn)波動變化；而20 ℃貯藏下，APX先上升后下降，且整體活性低于2 ℃下的APX活性。兩貯藏溫度下，EBR處理均能顯著提高小白菜APX活性（P<0.05）。

圖5（D）所示，2 ℃貯藏期間，小白菜POD活性整體呈現(xiàn)上升的趨勢，EBR處理在貯藏后期顯著降低小白菜的POD活性（P<0.05）。20 ℃貯藏期間，小白菜POD先上升后下降，EBR處理的小白菜POD活性顯著低于對照小白菜（P<0.05），在第5 d達到峰值時，對照小白菜POD活性為7720 U g?1FW，EBR處理小白菜僅為6400 U g?1FW。由圖5（E）可見，2 ℃和20 ℃貯藏期間，小白菜LOX活性持續(xù)上升，且以20 ℃上升較為迅速，低溫可有效降低LOX活性。EBR處理在20 ℃和2 ℃貯藏后期均可以顯著抑制小白菜LOX活性的上升（P<0.05）。

綜上可見，與常溫20 ℃貯藏相比，低溫2 ℃貯藏更能使小白菜保持較高的SOD、CAT和APX活性，以及較低的POD和LOX活性。此外，EBR處理均可有效提高2 ℃和20 ℃貯藏期間小白菜SOD、CAT和APX的活性，抑制POD和LOX活性，從而提高小白菜的抗氧化能力，減輕膜脂過氧化作用，降低活性氧對細胞的損害。

圖6（A～B）顯示，2 ℃貯藏期間，小白菜O2?·和H2O2含量逐漸增加，EBR處理可以顯著抑制兩個指標的上升（P<0.05）。20 ℃貯藏期間，小白菜O2?·和H2O2含量先上升后下降，EBR處理顯著抑制了小白菜O2?·和H2O2含量的增加（P<0.05）。圖6（C）可見，2 ℃貯藏期間，小白菜MDA含量變化平緩且始終處于較低水平；20 ℃貯藏過程中，小白菜MDA含量迅速增加；EBR處理均能顯著抑制2 ℃和20 ℃貯藏期間小白菜的MDA含量（P<0.05）。結(jié)果表明，2 ℃貯藏比20 ℃貯藏更能維持小白菜較低的O2?·和H2O2含量，EBR處理可有效抑制小白菜在2 ℃和20 ℃貯藏下O2?·和H2O2的產(chǎn)生，減少MDA積累，保持細胞膜的完整性。

圖6 2 ℃和20 ℃貯藏期間EBR對小白菜O2?·、H2O2和MDA含量的影響Fig.6 Effect of EBR on the O2?·、H2O2 and MDA content of pakchoi during storage at 2 ℃ and 20 ℃

3 討論與結(jié)論

小白菜作為一種典型的綠色葉菜，在采后貯藏和運輸過程中很快發(fā)生萎蔫、黃化、脫幫和腐爛等問題，貯藏時間只有2～3 d，采后損耗十分嚴重。色澤是消費者判斷蔬菜新鮮程度的重要指標，也是制約貯藏和運輸?shù)闹匾蛩?。本實驗中?.0 mg/L EBR采后處理小白菜可以使其保持較高的葉綠素含量及良好的外觀品質(zhì)，降低2 ℃和20 ℃貯藏期間小白菜呼吸強度，這與0.9 mg/L的EBR處理杏果實的研究結(jié)果一致[20]。

參與葉綠素降解的主要酶是CLH、MDCase和PPH，這些酶活性變化會影響葉綠素含量的高低。本研究發(fā)現(xiàn)，與20 ℃貯藏相比，2 ℃貯藏更能維持小白菜較低的CLH、MDCase和PPH的活性；同時EBR處理可以有效降低2 ℃和20 ℃貯藏條件下小白菜葉綠素降解相關(guān)酶的活性。以上結(jié)果表明，采后1.0 mg/L EBR可能通過抑制CLH、MDCase和PPH活性的上升，進而減緩葉綠素降解。已有相關(guān)的研究證明了這一點，EBR通過下調(diào)青花菜BoPPH和BoPaO等葉綠素降解基因的表達，抑制PPH和PaO活性，從而延緩青花菜黃化[15]。小麥中發(fā)現(xiàn)葉綠素酶和脫鎂葉綠素水解酶是葉綠素降解途徑關(guān)鍵酶[21]，在油麥菜中葉綠素過氧化物酶是葉綠素降解的關(guān)鍵酶[22]，本文的研究表明CLH而非PPH是小白菜葉綠素降解的關(guān)鍵酶。

本文研究表明POD和LOX也參與葉綠素的降解，這與以往的研究結(jié)論一致。菠菜[23]和西蘭花[24]在黃化過程中均伴隨著葉綠素含量的下降和POD活性的上升。LOX可以啟動膜脂過氧化反應，催化不飽和脂肪酸氧化形成自由基而攻擊分解葉綠素，同時，膜脂過氧化反應的產(chǎn)物MDA會損傷葉綠體膜，引發(fā)葉綠素的酶促反應，加速葉綠素降解[24?26]。因此，保持較低的POD和LOX活性有利于延緩植物葉綠素的降解。ZHAI等[27]研究發(fā)現(xiàn)，褪黑素處理通過降低梨果實中LOX活性，延緩了其葉綠素含量的下降。SOD、CAT和APX等抗氧化酶能清除活性氧，減輕對細胞的損傷。研究表明[28]，EBR能通過上調(diào)植物抗性相關(guān)基因的表達提高抗氧化能力，減輕細胞受損的程度。張瑞杰[20]在用EBR處理杏果實時發(fā)現(xiàn)EBR能較好地保持杏果實葉綠體的完整性。李進等[29]通過外源噴施EBR提高了棉花的抗氧化酶活性，減少了自由基對葉綠體的破壞，使葉綠素和類胡蘿卜素含量保持在較高的水平。本研究中，EBR處理均有效減少2 ℃和20 ℃貯藏期間小白菜抗氧化酶活性的下降，抑制POD和LOX活性上升，O2?·和H2O2的產(chǎn)生，MDA含量的積累，與前人研究結(jié)果一致。由此可推測，采后1.0 mg/L EBR可能通過維持SOD、CAT和APX活性，抑制POD和LOX活性上升，減少膜脂氧化，進而降低了O2?·、H2O2和MDA的積累，最終減少了葉綠素的降解，維持小白菜良好的生理指標。

本研究表明，與常溫20 ℃貯藏相比，低溫2 ℃貯藏更能保持小白菜較好的色澤指標和外觀品質(zhì)，較高的總?cè)~綠素、葉綠素a和葉綠素b含量，較低的呼吸強度，O2?·、H2O2和MDA含量，以及葉綠素降解酶和膜脂過氧化酶活性，較高的抗氧化酶活性。1.0 mg/L EBR處理可以通過抑制2 ℃和20 ℃貯藏期間小白菜葉綠素降解相關(guān)酶活性上升,從而減少葉綠素的降解，同時通過維持小白菜較低的膜脂過氧化酶活性和較高的抗氧化酶活性，保持細胞膜結(jié)構(gòu)完整性，進而減少小白菜貯藏期間品質(zhì)和生理的下降，其中對20 ℃貯藏條件小白菜各指標的影響更為明顯。以上的研究結(jié)果對EBR應用于綠色果蔬尤其是葉菜類的保鮮提供了理論依據(jù)，今后可進一步明確EBR在分子層面對小白菜品質(zhì)和生理生化的調(diào)控機制。