QuEChERS結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同步測(cè)定魚(yú)肉制品中24種磺胺類抗生素

李 朔，張 璨，馬 玲，王 可,, ，楊莉麗，花中霞，張夢(mèng)妍

（1.河北師范大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，河北 石家莊 050024；2.石家莊市疾病預(yù)防控制中心，石家莊市化學(xué)毒物檢測(cè)及風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警技術(shù)創(chuàng)新中心，河北 石家莊 050011）

磺胺類抗生素是一類具有對(duì)位氨基苯磺酰胺結(jié)構(gòu)的抗生素總稱[1?2]，具有較強(qiáng)的抗菌能力，被廣泛應(yīng)用于預(yù)防和控制水產(chǎn)養(yǎng)殖過(guò)程中的各種動(dòng)物疾病，除此之外，還被認(rèn)為是一種飼料添加劑以促進(jìn)水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物生長(zhǎng)[3?4]。其作用原理是通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性阻抑葉酸循環(huán)過(guò)程中的對(duì)氨基苯甲酸來(lái)達(dá)到減少和殺滅細(xì)菌核蛋白的目的[5]。此類人工合成的抗生素具有價(jià)格低、抗菌范圍廣、高效、不易分解[6]等特點(diǎn)，但其在動(dòng)物體內(nèi)具有作用時(shí)間較長(zhǎng)、較慢代謝速率等問(wèn)題，一部分會(huì)在動(dòng)物體內(nèi)殘留，另一部分會(huì)隨排泄物以原型或代謝物的形式排出體外[7?8]。過(guò)量使用磺胺類抗生素會(huì)對(duì)環(huán)境造成一定程度的污染，進(jìn)而通過(guò)食物鏈在人體內(nèi)蓄積從而對(duì)人體健康造成潛在威脅[9]?；前奉惪股亻L(zhǎng)期存在于人類體內(nèi)會(huì)引起急性或慢性中毒，還會(huì)影響機(jī)體的泌尿、免疫系統(tǒng)，破壞人體的造血系統(tǒng)或產(chǎn)生耐藥性等[10?11]。針對(duì)動(dòng)物組織及牛奶中的磺胺類抗生素，歐盟規(guī)定其最大殘留量為100 μg/kg[12]。我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 31650-2019制訂了在動(dòng)物性食品中磺胺二甲嘧啶的限量為25～100 μg/kg，其他磺胺類抗生素殘留總和為100 μg/kg[13]。

目前，對(duì)魚(yú)肉中磺胺類抗生素的檢測(cè)多為其中一種或幾種，同時(shí)對(duì)20種以上磺胺類抗生素的檢測(cè)報(bào)道較少。而且與文獻(xiàn)報(bào)道的檢測(cè)魚(yú)肉中磺胺類抗生素的液液萃取法[14]、加速溶劑萃取法[4]、固相萃取法[15?17]等前處理技術(shù)相比，QuEChERS法具有操作簡(jiǎn)便、無(wú)需昂貴的儀器、試驗(yàn)成本低、應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)。近年來(lái)，磺胺類抗生素的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法（HPLC）[18?20]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LCMS/MS）[21?24]、毛細(xì)管電泳法[24?25]等。其中，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法具有靈敏度高、準(zhǔn)確度好、能同時(shí)分析多種痕量物質(zhì)等優(yōu)點(diǎn)[26]，適用于多種磺胺類抗生素的檢測(cè)。如：HOFF等[27]基于液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)發(fā)展了一種測(cè)定牛肝中6種磺胺類抗生素的新方法；WANG等[28]建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法分析了畜禽糞便中17種磺胺類抗生素；MARTINS等[29]發(fā)展了液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定牛奶中11種磺胺類抗生素的檢測(cè)新方法。

魚(yú)作為營(yíng)養(yǎng)豐富、價(jià)格低廉的水產(chǎn)品之一，其組織中磺胺類抗生素的殘留檢測(cè)方法已有報(bào)道，而關(guān)于基質(zhì)更加復(fù)雜的魚(yú)肉制品中磺胺類抗生素的檢測(cè)卻鮮有報(bào)道，因此本文開(kāi)展魚(yú)肉制品中磺胺類抗生素的檢測(cè)研究，對(duì)完善食品安全監(jiān)測(cè)體系具有重要意義。為此，本研究通過(guò)優(yōu)化QuEChERS前處理方法、色譜和質(zhì)譜條件，開(kāi)發(fā)了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）測(cè)定魚(yú)肉制品中24種磺胺類抗生素的檢測(cè)方法，為開(kāi)展魚(yú)肉制品中磺胺類抗生素的殘留監(jiān)測(cè)及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

磺胺脒 純度>99.0%，美國(guó)International Laboratory公司；其余磺胺類抗生素標(biāo)準(zhǔn)品 純度>97.0%，德國(guó)Dr. Ehrenstorfer Gmb H公司；甲酸、乙酸銨 色譜純，美國(guó)Dikma公司；甲醇 色譜純，美國(guó)Fisher公司；乙腈 色譜純，德國(guó)Merck公司；N-丙基乙二胺（PSA） 美國(guó)Dikma公司；C18（40～50 μm） 美國(guó)Welch公司；無(wú)水硫酸鎂、氯化鈉分析純，天津永大化學(xué)試劑有限公司；ZORBAX Eclispse XDB-C18（4.6×100 mm，1.8 μm）、ZORBAX SB-Aq（2.1×150 mm，3.5 μm）、ZORBAX Eclispse Plus C18（2.1×100 mm，1.8 μm） 美國(guó)Agilent公司；魚(yú)肉罐頭、魚(yú)豆腐、魚(yú)腸、魚(yú)丸和魚(yú)皮等魚(yú)肉制品當(dāng)?shù)爻小?/p>

AB SCIEX Exion超高效液相色譜儀、TRIPLE QUAD 5500三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（配電噴霧源（ESI）及AB SCIEX數(shù)據(jù)處理軟件） 美國(guó)AB SCIEX公司；EVAP-12氮吹儀 美國(guó)Organomation公司；VXMNAL渦旋振蕩器 美國(guó)OHAUS公司；T-460/H超聲清洗器 德國(guó)Elma公司；Milli-Q超純水機(jī) 美國(guó)Millipore公司；CR21N高速冷凍離心機(jī) 日本日立公司；AE240（精度1/105）電子天平瑞士Mettler Toledo公司；GM 200研磨機(jī) 德國(guó)Retsch公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 稱取適量的磺胺類抗生素標(biāo)準(zhǔn)品采用乙腈溶解，配制成1 g/L的單一標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于?20 ℃冰箱中密封儲(chǔ)存。取適量的各標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，以乙腈定容，得到1 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液[30]。采用魚(yú)肉罐頭空白溶液逐級(jí)稀釋配成各標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度均為0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50、100 μg/L的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.2.2 樣品前處理 準(zhǔn)確稱取粉碎后的樣品1.0 g（精確至0.01 g），放入50 mL離心管中，加入超純水2 mL和乙腈10 mL，充分渦旋混勻，超聲5 min后加入NaCl 1.5 g，渦旋30 s，以8000 r/min在4 ℃下離心5 min。移取7.5 mL上清液至盛有C180.3 g和無(wú)水MgSO40.4 g的離心管中，渦旋混勻30 s，以8000 r/min離心5 min，取上層乙腈5 mL，在40 ℃下氮吹濃縮至近干，用1.0 mL初始流動(dòng)相復(fù)溶，經(jīng)0.20 μm濾膜過(guò)濾，供UPLC-MS/MS測(cè)定。

1.2.3 液相色譜條件 ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱（4.6 mm × 100 mm，1.8 μm）；柱溫：40 ℃；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣量：2 μL；流動(dòng)相：A為0.1%甲酸水溶液，B為乙腈；梯度洗脫程序：0.0～7.5 min，21% B；7.5～7.6 min，21%～40% B；7.6～11.0 min，40%B；11.0～11.1 min，40%～75% B；11.1～15.0min，75%B；15.1～18.0min，21% B。

1.2.4 質(zhì)譜條件 離子源：電噴霧電離源（ESI）；掃描方式：正離子掃描；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；離子化電壓：5500 V；離子源溫度：550 ℃；氣簾氣：40 psi；噴霧氣：50 psi；輔助氣：50 psi。24種磺胺類抗生素的詳細(xì)質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 24種磺胺類抗生素的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectrometric (MS) parameters for 24 sulfonamides

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Analyst軟件1.6.3控制儀器、采集數(shù)據(jù)，MultiQuant 3.0.2軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和標(biāo)準(zhǔn)曲線建立?；厥章始靶旁氡炔捎肕icrosoft Office Excel 2007軟件計(jì)算。提取劑優(yōu)化和凈化劑優(yōu)化中的回收率的計(jì)算均采用兩個(gè)平行樣品取平均值計(jì)算，各個(gè)條件下回收率的比較采用Origin 2018軟件進(jìn)行分析。精密度選擇低、中、高三個(gè)濃度，每個(gè)濃度梯度取連續(xù)采集7針數(shù)據(jù)的峰面積進(jìn)行相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD值的計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

磺胺類抗生素的結(jié)構(gòu)中含有氨基，容易結(jié)合H+，因此，采用正離子模式，以針泵連續(xù)進(jìn)樣，首先得到24種磺胺類化合物的各個(gè)母離子，分別對(duì)其單標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液（50 ng/mL）進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜掃描（Q1 MS）得到其母離子，然后對(duì)其進(jìn)行子離子全掃描，選擇出兩個(gè)響應(yīng)信號(hào)較強(qiáng)的碎片離子，其中響應(yīng)值較高的為定量離子，另一個(gè)為定性離子，再將母離子和這兩個(gè)碎片離子組成檢測(cè)離子對(duì)，在MRM模式下優(yōu)化去簇電壓（DP）和碰撞能（CE），優(yōu)化結(jié)果如表1所示。

2.2 色譜條件優(yōu)化

2.2.1 色譜柱選擇 比較了ZORBAX Eclispse XDB-C18（4.6 mm×100 mm，1.8 μm）、ZORBAX SBAq（2.1 mm×150 mm，3.5 μm）、ZORBAX Eclispse Plus C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）3款色譜柱對(duì)24種目標(biāo)物的分離效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，24種磺胺類抗生素在ZORBAX Eclispse Plus C18和ZORBAX SB-Aq色譜柱上分離度較差；相比而言，在ZORBAX Eclispse XDB-C18色譜柱上具有較好的分離效果且峰形尖銳，因此，選擇ZORBAX Eclispse XDB-C18色譜柱分離24種磺胺類抗生素。

2.2.2 流動(dòng)相優(yōu)化 流動(dòng)相對(duì)目標(biāo)物的保留時(shí)間和峰形存在一定的影響?？疾炝擞袡C(jī)相為甲醇、乙腈，水相為水、0.1%甲酸水和2 mmol/L乙酸銨溶液（含0.1%甲酸）時(shí)的色譜分離效果。試驗(yàn)結(jié)果顯示，乙腈相對(duì)于甲醇而言具有較好的分離度。當(dāng)有機(jī)相和水相分別為乙腈、純水時(shí)，24種目標(biāo)物的出現(xiàn)分裂縫且峰形較寬；加入甲酸后，峰形改善且分裂峰減少；而引入乙酸銨后導(dǎo)致磺胺硝苯的響應(yīng)降低，因此，乙腈-0.1%甲酸水為最優(yōu)流動(dòng)相。圖1為24種磺胺類抗生素的總離子流色譜圖（TIC）。

圖1 24種磺胺類抗生素標(biāo)準(zhǔn)品的總離子流色譜圖（50 μg/L）Fig.1 Total ion chromatograms of 24 kinds of sulfonamides standards (50 μg/L)

2.3 前處理方法優(yōu)化

2.3.1 提取劑的優(yōu)化 由于樣品基質(zhì)的復(fù)雜性，提取劑應(yīng)滿足既能很好地溶解目標(biāo)化合物，又能減少對(duì)雜質(zhì)的萃取。乙腈和丙酮是QuEChERS法常用的提取劑，此外酸化乙腈對(duì)許多分析物具有良好的萃取效率[31]，因此，本實(shí)驗(yàn)考察了3種提取劑（乙腈、0.5%酸化乙腈和丙酮）對(duì)24種磺胺類抗生素的提取效率。由圖2可知，相比于其他兩種提取劑，乙腈對(duì)24種磺胺類抗生素的回收率均能達(dá)到75.5%以上，而且乙腈可以很好地分離蛋白質(zhì)和脂肪，降低雜質(zhì)的干擾，因此，最終選擇乙腈作為提取劑。

圖2 不同提取劑對(duì)24種磺胺類抗生素回收率的影響Fig.2 Effect of different extractant on the recoveries of 24 sulfonamide antibiotics

2.3.2 凈化劑的優(yōu)化 QuEChERS法是利用吸附劑填料與基質(zhì)中的雜質(zhì)相互作用，吸附雜質(zhì)從而達(dá)到除雜凈化的目的，其操作簡(jiǎn)便、效率高、試驗(yàn)成本低。QuEChERS法常用的凈化劑有PSA、C18、石墨化碳黑等。PSA可用于去除脂肪酸、糖類、有機(jī)酸和脂類等一些雜質(zhì)，而C18能有效去除脂類[32]。本文比較了0.3 g PSA、0.3 g C18、0.3 g無(wú)水MgSO4+0.3 g PSA、0.3 g無(wú)水MgSO4+0.3 g C18對(duì)樣品的凈化效果（見(jiàn)圖3）。試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，以PSA或無(wú)水MgSO4+PSA作為凈化劑凈化時(shí)，15種磺胺類抗生素的回收率低于70.0%，特別是苯甲?；前返幕厥章蕿?.3%，可能由于PSA對(duì)苯甲?；前酚休^強(qiáng)的吸附作用。而以C18為凈化劑時(shí)，24種磺胺類抗生素的回收率整體較高，且無(wú)水MgSO4的加入能使24種目標(biāo)物的回收率達(dá)到78%以上。在上述基礎(chǔ)上，進(jìn)一步優(yōu)化了C18和無(wú)水MgSO4的用量，當(dāng)無(wú)水MgSO4為0.3 g時(shí)，比較了C18為0.2、0.3、0.4 g時(shí)對(duì)目標(biāo)物回收率的影響。結(jié)果顯示，相比于其它用量，當(dāng)C18為0.3 g時(shí)，24種磺胺類抗生素回收率較好，在79.0%～112.8%之間。固定C18用量為0.3 g，考察了0.2、0.3、0.4、0.5 g無(wú)水MgSO4對(duì)目標(biāo)物回收率的影響。隨無(wú)水MgSO4用量的增加，24種磺胺類抗生素的回收率出現(xiàn)先升高再降低的趨勢(shì)，當(dāng)加入無(wú)水MgSO40.4 g時(shí)，24種目標(biāo)物的回收率最好。綜合上述結(jié)果，選擇0.3 g C18和0.4 g無(wú)水MgSO4作為凈化劑，24種磺胺類抗生素的回收率能達(dá)到84.2%～110.5%之間。

圖3 不同凈化劑對(duì)24種磺胺類抗生素回收率的影響Fig.3 Effect of different purification on the recoveries of 24 sulfonamide antibiotics

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

標(biāo)準(zhǔn)曲線分別以基質(zhì)空白和溶劑配制，根據(jù)基質(zhì)效應(yīng)計(jì)算公式：基質(zhì)效應(yīng)=基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率/溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率×100[33]，當(dāng)基質(zhì)效應(yīng)計(jì)算值在80.0%～120.0%時(shí)，可認(rèn)為基質(zhì)效應(yīng)較弱，可忽略。結(jié)果表明，磺胺脒、磺胺二甲基異嘧啶、甲氧芐啶、磺胺醋酰、磺胺甲氧噠嗪、磺胺地索辛、磺胺苯吡唑的基質(zhì)效應(yīng)為41.5%～77.6%，具有明顯的基質(zhì)抑制作用，而其它17種磺胺類抗生素的基質(zhì)效應(yīng)在82.0%～100.9%之間，基質(zhì)效應(yīng)較弱。為了能精準(zhǔn)的定量分析，標(biāo)準(zhǔn)曲線采用基質(zhì)空白提取液配制，以減少因基質(zhì)效應(yīng)引起的誤差。

2.5 方法學(xué)驗(yàn)證

2.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和定量限 在優(yōu)化的色譜和質(zhì)譜條件下測(cè)定前述1.2部分配制基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作液，標(biāo)準(zhǔn)曲線的橫坐標(biāo)為各目標(biāo)化合物的濃度，縱坐標(biāo)為定量離子對(duì)峰面積，得到線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)（r），檢出限（LOD）和定量限（LOQ）分別以3倍和10倍的信噪比計(jì)算，見(jiàn)表2。這24種磺胺類抗生素的相關(guān)系數(shù)（r）均在0.999以上，線性關(guān)系良好，LOD和LOQ分別為0.01～0.48 μg/kg和0.02～1.59 μg/kg，能夠滿足定量分析的要求。

表2 24種磺胺類抗生素的線性范圍、線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table 2 Linear ranges, regression equations, correlation coefficients, limits of detection (LOD) and limits of quantification (LOQ) for detection of 24 kinds of sulfonamides

2.5.2 加標(biāo)回收率和精密度 在3個(gè)加標(biāo)濃度分別為5、10和50 μg/kg下對(duì)空白樣品進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，結(jié)果列于表3。24種待測(cè)物的平均回收率在80.0%～116.4%范圍內(nèi)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.8%～9.4%，適用于魚(yú)肉制品中24種磺胺類抗生素殘留的同步快速檢測(cè)。

表3 24 種磺胺類抗生素的加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=7）Table 3 Spiked recoveries and RSD of 24 sulfonamides (n=7)

2.6 實(shí)際樣品測(cè)定

在市內(nèi)超市采集4份魚(yú)罐頭、2份魚(yú)腸、5份魚(yú)豆腐、4份魚(yú)丸、1份魚(yú)皮等16份實(shí)際樣品，利用本文所建立的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)上述樣品中24種磺胺類抗生素殘留進(jìn)行檢測(cè)，16份實(shí)際樣品均未檢出磺胺類抗生素。

3 結(jié)論

采用QuEChERS前處理技術(shù)，首次建立了魚(yú)肉制品中24種磺胺類抗生素的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)新方法。24種目標(biāo)物在各自線性范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0.999，在3個(gè)加標(biāo)濃度水平下的平均加標(biāo)回收率為80.0%～116.4%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.8%～9.4%，檢出限和定量限分別為0.01～0.48 μg/kg和0.02～1.59 μg/kg。本方法前處理簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確度和精密度高、靈敏度好，適用于魚(yú)肉制品中24種磺胺類抗生素的同步快速檢測(cè)，為開(kāi)展魚(yú)肉制品中磺胺類抗生素的監(jiān)測(cè)提供了技術(shù)支持，進(jìn)一步保障了魚(yú)肉制品的質(zhì)量。