堿發(fā)溫度對(duì)毛肚膠原蛋白結(jié)構(gòu)的影響

王立宇，夏楊毅,2, ，趙 鸞

（1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400700；2.重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心，重慶 400700）

毛肚口感獨(dú)特，作為火鍋特色菜品發(fā)展?jié)摿薮?。新鮮毛肚通常采用食用堿或蛋白酶進(jìn)行漲發(fā)加工，其中食品級(jí)NaOH漲發(fā)是最適合發(fā)制毛肚的方法[1]，經(jīng)過(guò)處理后口感脆嫩化渣。目前，關(guān)于毛肚的研究主要集中在漲發(fā)過(guò)程中的不同工藝和條件優(yōu)化等方面[2]，其中研究表明漲發(fā)溫度對(duì)毛肚產(chǎn)品品質(zhì)有很大影響，如堿處理毛肚在25 ℃可以獲得最大增重比[3]，碳酸鈉處理毛肚在43 ℃時(shí)獲得最佳感官評(píng)價(jià)[4]，但是關(guān)于毛肚蛋白在漲發(fā)過(guò)程中的性質(zhì)變化卻鮮有報(bào)道。

蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和理化特性對(duì)肉制品品質(zhì)有重要影響，而熱處理溫度等條件會(huì)改變蛋白結(jié)構(gòu)從而影響蛋白質(zhì)性能。研究表明，不同加工溫度處理手段下蛋白的結(jié)構(gòu)存在明顯差異[5]，升高加工溫度會(huì)導(dǎo)致魚(yú)鱗膠原蛋白中無(wú)規(guī)則卷曲部分占比增大[6]；肌原纖維蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)隨溫度升高發(fā)生改變甚至變性和聚集[7]；升高溫度時(shí)肌原纖維蛋白的表面疏水性則先增大后減小，蛋白質(zhì)的變性程度逐漸加深[8]，是導(dǎo)致刺身蛋白結(jié)構(gòu)變化的主要原因[9]。

毛肚富含膠原蛋白，因此膠原蛋白的結(jié)構(gòu)特性對(duì)毛肚品質(zhì)有重要影響[10]。鹽漬處理對(duì)新鮮毛肚膠原蛋白結(jié)構(gòu)具有顯著影響[11]，但漲發(fā)條件尤其是漲發(fā)溫度對(duì)毛肚膠原蛋白結(jié)構(gòu)變化研究仍為空白。為進(jìn)一步探究堿發(fā)溫度對(duì)毛肚膠原蛋白的影響，本文選取毛肚為原料，采用NaOH堿發(fā)工藝，探究不同漲發(fā)溫度對(duì)膠原蛋白結(jié)構(gòu)的影響，以期為毛肚安全加工和批量生產(chǎn)提供理論依據(jù)和科學(xué)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃牛毛肚 購(gòu)于重慶市南岸區(qū)水產(chǎn)批發(fā)市場(chǎng)，低溫保藏運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室后立即處理。置于?20 ℃貯藏備用，使用前于4 ℃的冰箱中解凍；氯化鈉、鹽酸、氫氧化鈉、甲醇、冰醋酸 重慶市鈦新化工有限公司；胃蛋白酶（1:10000） 范德生物科技有限公司；EDTA、二水磷酸二氫鈉、溴酚藍(lán)、四水酒石酸鉀鈉 上海源葉生物科技有限公司；五水硫酸銅Aladdin公司；甘氨酸 Macklin公司；乙二胺四乙酸Biosharp公司；疊氮化鈉 成都市科龍化工試劑廠(chǎng)；以上皆為分析純。尼羅藍(lán) Adamas公司；熒光白 上海阿拉丁試劑公司；Tris biotopped公司；溴酚藍(lán) coolaber公司；牛血清蛋白 Biofroxx公司；SDSPAGE凝膠制備試劑盒 北京索來(lái)寶科技有限公司；考馬斯亮藍(lán)R250 上海拓旸生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 漲發(fā)溫度對(duì)毛肚膠原蛋白結(jié)構(gòu)的影響 選取清洗處理后毛肚為原料，在料液比（w/v）為1:3.6，食品級(jí)NaOH溶液濃度為5 mg/mL，時(shí)間為30 min條件下，設(shè)置不同溫度處理組（40、45、50、55、60 ℃），室溫為未處理組，研究不同漲發(fā)溫度對(duì)毛肚膠原蛋白結(jié)構(gòu)的影響。

1.2.2 毛肚膠原蛋白的提取 參考曲文娟等[12?14]的做法，并略作修改。去除新鮮毛肚的表面異物后清洗干凈。200 g毛肚切碎后按照1:10（w/v）的固液比添加0.1 mol/L氫氧化鈉溶液，浸泡72 h除去色素和雜質(zhì)蛋白。用超純水洗至中性pH。按照1:10（w/v）的固液比添加10%的正丁醇溶液，浸泡48 h除去多余的脂肪，用超純水清洗。按照1:10（w/v）的固液比添加含有胃蛋白酶（酶活力1:10000）的0.1 mol/L醋酸溶液，攪拌72 h。將濾液收集起來(lái)合并后用透析袋（分子截留量為8000～14000 kDa）透析脫鹽24 h，真空冷凍干燥、封口包裝，并將樣品置于?20 ℃的冰箱中，供測(cè)定指標(biāo)使用。將處理后的膠原溶液調(diào)節(jié)pH至7.0左右，透析、真空冷凍干燥。以上所有操作均在低溫下進(jìn)行。

1.2.3 紫外光譜的測(cè)定 采用0.1 mol/L冰醋酸溶液溶解不同漲發(fā)溫度處理后凍干的毛肚的膠原蛋白，制備成0.5 mg/mL膠原蛋白溶液，測(cè)量毛肚的膠原蛋白紫外吸收光譜（190～400 nm）。

1.2.4 紅外光譜的測(cè)定 參考Noorzai等[15]的方法，略作修改。取1 mg經(jīng)過(guò)冷凍干燥后的樣品，加入100 mg KBr于研缽中研磨均勻，在500～4000 cm?1下掃描。利用測(cè)試軟件對(duì)毛肚膠原蛋白的紅外光譜進(jìn)行自動(dòng)基線(xiàn)校正、平滑、標(biāo)準(zhǔn)化處理后，導(dǎo)出原數(shù)據(jù)。再利用Peakfit 4.12處理，毛肚膠原蛋白酰胺I區(qū)（1600～1700 cm?1），依次進(jìn)行相關(guān)基線(xiàn)校正、Gaussian去卷積、二階導(dǎo)數(shù)擬合，分別分析毛肚的膠原蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)組成的變化。

1.2.5 熒光光譜的測(cè)定 采用0.1 mol/L冰醋酸溶液溶解不同漲發(fā)溫度處理后凍干的毛肚的膠原蛋白，制備成0.5 mg/mL膠原蛋白溶液，測(cè)量毛肚的膠原蛋白熒光光譜（310～400 nm）。

1.2.6 表面疏水性的測(cè)定 采用0.1 mol/L冰醋酸溶液溶解制作不同加工溫度處理組鹽漬毛肚的1.0 mg/mL膠原蛋白溶液，取1 mL上述膠原溶液和200 μL 1.0 mg/mL溴酚藍(lán)溶液加入離心管中，漩渦保持10 min，離心10 min（8000×g），取0.4 mL離心上清液，加入3.6 mL 0.1 mol/L醋酸溶液，振蕩混勻，在595 nm處測(cè)定不同溫度處理組膠原溶液的吸光值（A樣品），同時(shí)使用0.1 mol/L醋酸溶液作為空白組（A空白）。膠原蛋白的表面疏水性采用如下公式計(jì)算：

1.2.7 巰基含量的測(cè)定 采用 Disimplicio[16]的方法，略作修改。使用0.1 mol/L冰醋酸溶液溶解不同漲發(fā)溫度處理組的膠原蛋白，配制1.0 mg/mL的蛋白溶液。加入9.0 mL Tris-甘氨酸溶液（0.086 mol/L Tris，0.09 mol/L甘氨酸，4 mmol/L EDTA，pH8.0），離心15 min（10000×g），取4.5 mL上清液加0.5 mL Ellman試劑（4 mg 5,5'-二硫基雙-2-硝基苯甲酸溶解于1.0 mL的Tris-甘氨酸緩沖液），振蕩混勻后，25 ℃條件保持30 min，同時(shí)使用0.1 mol/L醋酸溶液作為對(duì)照組，在412 nm下測(cè)定吸光度。公式為：

式中：13600為摩爾消光系數(shù)（L·cm/mol），ρ表示膠原質(zhì)量濃度（mg/mL）。

建議一個(gè)孩子從小學(xué)到高中畢業(yè)閱讀的課外書(shū)最低應(yīng)該在500本之上，最好在1000本以上。其中包括100本以上各行各業(yè)的人物傳記，來(lái)奠定孩子人生觀(guān)、價(jià)值觀(guān)、世界觀(guān)的基礎(chǔ)。同時(shí)注意不但要閱讀，也要寫(xiě)讀書(shū)筆記或者書(shū)評(píng)。

1.2.8 掃描電鏡分析 分別將凍干的毛肚膠原蛋白固定噴金，設(shè)置加速電壓為10 V，使用掃描電鏡觀(guān)察毛肚的膠原蛋白微觀(guān)結(jié)構(gòu)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)處理；采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)；采用Origin 2018進(jìn)行圖像處理。所有試驗(yàn)均做3次重復(fù)測(cè)定，試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差形式表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 毛肚膠原蛋白的紫外可見(jiàn)光譜分析

如圖1所示，毛肚膠原蛋白在228 nm 處出現(xiàn)最大吸收波長(zhǎng)，與報(bào)道一致[17?18]。不同溫度處理組的毛肚膠原蛋白的吸光度強(qiáng)度均低于未處理組，且不同漲發(fā)溫度毛肚膠原蛋白的吸光度不同。隨著加工溫度的升高，最大吸收峰強(qiáng)度先降低再升高后又降低，毛肚膠原蛋白280 nm附近最大吸收峰波長(zhǎng)的變化趨勢(shì)與230 nm波段保持一致。說(shuō)明不同漲發(fā)溫度使毛肚膠原骨架發(fā)生了明顯變化，這是由于蛋白展開(kāi)過(guò)程中一些疏水性殘基通過(guò)加熱產(chǎn)生三重螺旋[19]，膠原氨基酸的殘基所處環(huán)境發(fā)生了改變。

圖1 不同漲發(fā)溫度處理毛肚膠原蛋白紫外可見(jiàn)光譜圖Fig.1 UV absorbance spectrum of tripe collagen at different temperatures during the lye macerating

2.2 毛肚膠原蛋白的紅外光譜分析

如圖2及表1所示，酰胺A區(qū)與N-H的伸縮振動(dòng)相關(guān)，當(dāng)N-H參與生成氫鍵時(shí)其吸收峰發(fā)生藍(lán)移[20]。與未處理組相比，處理組酰胺A區(qū)最大吸收波長(zhǎng)紅移。45 ℃處理組紅移至3410.64 cm?1，明顯高于其他各處理組。隨著加工溫度的升高，酰胺A區(qū)的最大吸收波長(zhǎng)先紅移后藍(lán)移再紅移，說(shuō)明漲發(fā)處理會(huì)破壞毛肚膠原蛋白內(nèi)部的氫鍵數(shù)量，且溫度不同、破壞膠原蛋白內(nèi)部氫鍵數(shù)量不一樣[21]。酰胺I、II和III區(qū)的范圍能夠影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，酰胺I區(qū)與肽鏈內(nèi)羰基（C=O）的拉伸振動(dòng)相關(guān)，是研究蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的重要區(qū)帶[22]。與未處理組相比，處理組酰胺I區(qū)最大吸收波長(zhǎng)藍(lán)移。酰胺I區(qū)最大吸收波長(zhǎng)隨溫度升高先升高后降低，與酰胺A區(qū)變化趨勢(shì)相反，可能是由于升高漲發(fā)溫度導(dǎo)致毛肚膠原蛋白內(nèi)部的氫鍵平衡狀態(tài)被破壞[23]。酰胺II區(qū)與C-N拉伸耦合及N-H伸縮振動(dòng)相關(guān)，酰胺III區(qū)參與生成膠原蛋白的三螺旋結(jié)構(gòu)，可以反映膠原蛋白特性[15]。

表1 不同漲發(fā)溫度處理毛肚膠原蛋白的酰胺帶峰位Table 1 The amide band peak of tripe collagen at different processing temperatures

圖2 不同漲發(fā)溫度處理毛肚膠原蛋白紅外光譜圖Fig.2 Infrared spectra of tripe collagen treated at different temperatures during the lye macerating

采用Peakfit 4.12處理毛肚膠原蛋白酰胺I區(qū)（1600～1700 cm?1），依次進(jìn)行相關(guān)基線(xiàn)校正、Gaussian去卷積、二階導(dǎo)數(shù)擬合，得到不同漲發(fā)溫度處理后的毛肚膠原蛋白分峰圖譜。未處理組含有11個(gè)峰，不同溫度處理組則含有10個(gè)峰，如圖3所示。毛肚膠原蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)組成的變化如圖4所示。

圖3 不同漲發(fā)溫度處理毛肚膠原蛋白酰胺I帶擬合圖Fig.3 Fitting diagram of amide I band treated at different temperatures during the lye macerating

圖4 不同漲發(fā)溫度處理毛肚膠原蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)組成Fig.4 Composition of secondary structure of tripe collagen treated with different temperatures during the lye macerating

由圖4可知，不同漲發(fā)溫度處理組β-折疊、α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角相對(duì)含量均高于未處理組（P<0.05），而無(wú)規(guī)則卷曲相對(duì)含量低于未處理組（P<0.05）。在膠原蛋白內(nèi)部，β-折疊作為一種不穩(wěn)定的中間產(chǎn)物，在外界條件影響下極易發(fā)生轉(zhuǎn)變[24]。在升溫初期（40→45 ℃），α-螺旋與β-折疊相對(duì)含量變化趨勢(shì)相反，可能是由于毛肚膠原蛋白α-螺旋轉(zhuǎn)變?yōu)棣?折疊所導(dǎo)致的[25]。當(dāng)漲發(fā)溫度高于50 ℃時(shí)膠原蛋白由于亞基不斷暴露，膠原蛋白結(jié)構(gòu)松散，α-螺旋結(jié)構(gòu)和無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)含量無(wú)明顯變化。隨著溫度升高，β-折疊結(jié)構(gòu)含量先升高后降低，β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)含量先降低后升高，說(shuō)明二者之間可能存在轉(zhuǎn)化關(guān)系。研究表明，膠原蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)中，β-折疊和α-螺旋易被外界環(huán)境影響，一方面α-螺旋不斷轉(zhuǎn)變?yōu)棣?折疊，另一方面亞基的降解會(huì)導(dǎo)致α-螺旋相對(duì)含量增加[26]；這與本研究得到的結(jié)果一致。

2.3 毛肚膠原蛋白的熒光光譜分析

由圖5可知，與未處理組相比，不同溫度處理組的最大發(fā)射波長(zhǎng)隨漲發(fā)溫度的升高均發(fā)生紅移，說(shuō)明膠原蛋白發(fā)生變性導(dǎo)致部分芳香族氨基酸暴露在蛋白溶液中，極性逐漸增加[27]。隨著溫度的升高，由于膠原蛋白變性加劇，聚集程度加深掩蓋了部分暴露在膠原溶液中疏水基團(tuán)，毛肚膠原溶液表面疏水性降低，膠原溶液的極性減小[8]。隨著溫度的升高，不同溫度處理組的熒光強(qiáng)度逐漸降低，說(shuō)明膠原蛋白的變性過(guò)程中發(fā)生了不可逆轉(zhuǎn)的聚集生成大膠原分子，減少了膠原溶液中疏水性氨基酸殘基數(shù)量，致使熒光強(qiáng)度逐漸降低。

圖5 不同漲發(fā)溫度處理毛肚膠原蛋白熒光光譜圖Fig.5 Fluorescence spectra of tripe collagen treated at different temperatures during the lye macerating

2.4 毛肚膠原蛋白表面疏水性分析

由圖6可知，與未處理組相比，處理組的表面疏水性顯著降低（P<0.05）。隨著加工溫度的升高，處理組表面疏水性先顯著性升高再顯著性降低（P<0.05）。這說(shuō)明在升溫過(guò)程中，膠原發(fā)生不可逆的變性，聚集程度較深，導(dǎo)致表面疏水性明顯降低。此外，隨著加工溫度的升高，降低了維持膠原結(jié)構(gòu)的作用力，二硫鍵、氫鍵、范德華力等作用力受到損害，膠原蛋白發(fā)生變性，膠原三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，疏水基團(tuán)逐漸暴露在膠原溶液中，致使膠原溶液環(huán)境的表面疏水性不斷升高[28]；當(dāng)加工溫度高于60 ℃時(shí)，因膠原蛋白的聚集程度加深掩蓋了部分暴露在膠原溶液中疏水基團(tuán)，毛肚膠原溶液表面疏水性顯著降低（P<0.05）。

圖6 不同漲發(fā)溫度處理下膠原表面疏水性Fig.6 Collagen surface hydrophobicity at different temperatures during the lye macerating

2.5 毛肚膠原蛋白巰基含量分析

由圖7可知，不同漲發(fā)溫度處理組膠原溶液中巰基含量隨溫度升高逐漸增加（P<0.05），說(shuō)明升溫會(huì)導(dǎo)致毛肚膠原蛋白發(fā)生變性，膠原蛋白結(jié)構(gòu)展開(kāi)，暴露出更多巰基[29]。巰基是蛋白中活性最強(qiáng)的功能性基團(tuán)，分布在蛋白表面的巰基易氧化生成穩(wěn)定的二硫鍵，通過(guò)測(cè)定蛋白活性巰基和總巰基含量可以反映蛋白結(jié)構(gòu)的變化及蛋白間的相互作用。

圖7 不同漲發(fā)溫度處理毛肚膠原蛋白巰基含量Fig.7 The content of sulfhydryl groups in tripe collagen treated at different temperatures during the lye macerating

2.6 毛肚膠原蛋白的掃描電鏡分析

不同漲發(fā)溫度處理下毛肚膠原蛋白的掃描電鏡圖譜如圖8所示。與未處理組相比，不同漲發(fā)溫度處理組毛肚膠原微觀(guān)結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化，部分膠原由破碎的葉片狀向球棒狀結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變，變性的膠原纖維向明膠結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變，但基本保留了部分碎片狀的膠原分子。隨著漲發(fā)溫度的升高，膠原分子開(kāi)始收縮，逐漸卷曲，加快凝集，縫隙減小，片狀膠原破碎。其中，55 ℃和60 ℃處理組葉片狀膠原破碎效果明顯，并且球棒狀膠原開(kāi)始斷裂，膠原聚集程度加深，膠原發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)變性。

圖8 不同漲發(fā)溫度處理毛肚膠原蛋白掃描電鏡圖Fig.8 Scanning electron microscopy of tripe collagen treated at different temperatures during the lye macerating

3 結(jié)論

本文研究不同溫度（40～60 ℃）的NaOH漲發(fā)對(duì)毛肚膠原蛋白結(jié)構(gòu)的影響，發(fā)現(xiàn)NaOH漲發(fā)處理會(huì)導(dǎo)致毛肚膠原蛋白最大吸收波長(zhǎng)發(fā)生明顯偏移，二級(jí)結(jié)構(gòu)被破壞，膠原蛋白與其他分子的相互作用力（如氫鍵、疏水相互作用力等）發(fā)生改變。NaOH堿發(fā)處理對(duì)膠原蛋白微觀(guān)結(jié)構(gòu)的影響顯著，膠原分子隨溫度升高開(kāi)始收縮并逐漸卷曲，縫隙減小，片狀膠原破碎。當(dāng)溫度達(dá)到50 ℃時(shí)球棒狀膠原開(kāi)始斷裂，膠原聚集程度加深，膠原發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)變性。在今后的研究中可以進(jìn)一步探究NaOH堿發(fā)濃度、時(shí)間以及各種酶法處理對(duì)毛肚膠原蛋白結(jié)構(gòu)和功能特性的影響，為毛肚加工品質(zhì)形成機(jī)理和工業(yè)化生產(chǎn)提供理論支持。