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    EDC-NHS交聯(lián)的骨骼肌脫細(xì)胞支架對心肌細(xì)胞生物功能性的影響

    2022-04-26 02:51:50劉淑茵方展鴻鄒小明
    實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志 2022年5期
    關(guān)鍵詞:支架

    劉淑茵 方展鴻 鄒小明

    南方醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院(廣州510000)

    心血管疾?。–VD)已成為全世界病死率和發(fā)生率第二高的疾?。?-2],其中心肌梗死是導(dǎo)致心功能不全和心力衰竭的重要原因之一[3]。心肌梗死主要表現(xiàn)為心肌細(xì)胞壞死、瘢痕組織形成和心臟收縮受限[4]。傳統(tǒng)的心梗治療方法雖有一定的修復(fù)效果,但是由于心肌細(xì)胞的再生能力有限、藥物和手術(shù)費(fèi)用較高等限制了其廣泛運(yùn)用。目前利用組織工程技術(shù)構(gòu)建的工程化心肌補(bǔ)片被認(rèn)為是修復(fù)梗死心肌組織的一種有效策略[5-6]。

    工程化心肌補(bǔ)片是由支架和/或治療細(xì)胞組成,能夠構(gòu)建心肌再生微環(huán)境從而促進(jìn)心肌梗死組織修復(fù)和再生。其中脫細(xì)胞支架的天然細(xì)胞外基質(zhì)不僅能為細(xì)胞提供一個(gè)仿生的三維支持載體,還能促進(jìn)宿主細(xì)胞的遷移、增殖、分化等,從而促進(jìn)梗死區(qū)組織再生和修復(fù)[7]。一些研究者曾用豬心臟組織進(jìn)行脫細(xì)胞制成心肌補(bǔ)片并能有效修復(fù)心梗組織[8-9]。但心肌組織占比較少,來源有限,在大規(guī)模制備和應(yīng)用中受限。因此,研究者們考慮開發(fā)其他組織的脫細(xì)胞支架來作為工程化心肌補(bǔ)片的支架材料來源。

    目前骨骼肌脫細(xì)胞支架主要應(yīng)用于神經(jīng)修復(fù)、肌肉再生和脂肪再生等領(lǐng)域[10-12],大部分骨骼肌脫細(xì)胞支架以混合水凝膠制作特定功能工程化補(bǔ)片為主[13]。天然的骨骼肌脫細(xì)胞支架主要成分為膠原,膠原間連接松散且排列雜亂,力學(xué)強(qiáng)度低[14]。而工程化心肌補(bǔ)片需要仿生的力學(xué)強(qiáng)度來抑制心肌梗死后的心臟擴(kuò)張。本研究擬利用大鼠腹直肌組織進(jìn)行脫細(xì)胞處理形成骨骼肌脫細(xì)胞基質(zhì)(rectus abdominis decellularized matrix,RADCM),交聯(lián)修飾后形成機(jī)械性能較好的脫細(xì)胞支架(rectus abdominis decellularized matrix/EDC,RADCM/EDC)。對骨骼肌中的腹直肌脫細(xì)胞支架進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)處理來提高其力學(xué)強(qiáng)度并制備工程化心肌補(bǔ)片,心肌細(xì)胞種植在交聯(lián)后的脫細(xì)胞支架上以制備工程化心肌補(bǔ)片。通過腹直肌脫細(xì)胞支架與心肌細(xì)胞共培養(yǎng),研究其促心肌細(xì)胞成熟的作用;并通過腹直肌脫細(xì)胞支架與人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng),研究其對血管生成的作用。

    1 材料和方法

    1.1 主要材料與試劑 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物來源于南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒(雷根,中國)、Masso 三色染色試劑盒(Solarbio/索萊寶,中國)、DAPI 染色液(雷根,中國)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽EDC(麥克林,中國)、N-羥基琥珀酰亞胺(HOSu)-NHS(麥克林,中國)、Live&Dead Viability試劑盒(Everbright,美國)、F-actin(abcam,英國)、兔抗CX-43(Affinity,中國)、鼠抗α-actinin(Abcam,英國)、488 donkey anti-mouse(invitrogen,美國)、568 donkey anti-rabbit(invitrogen,美國)、cDNA 合成試劑盒(GeneCopoeia,美國)、2x All-in-One qPCR 試劑盒(GeneCopoeia,美國)。

    1.2 方法

    1.2.1 制備脫細(xì)胞支架 取SD 大鼠腹直肌肌肉組織,反復(fù)凍融三次后浸入到烷基糖苷溶液中,常溫下振蕩12 h;再加入含DNA 酶和RNA 酶的0.05 mol/L MgCl2溶液中,在37 ℃下振蕩24 h 得到。對樣品采取HE 染色、MASSON 染色以及DAPI 染色,并在顯微鏡下觀察。

    1.2.2 腹直肌脫細(xì)胞支架化學(xué)交聯(lián) 將腹直肌脫細(xì)胞支架分別浸入0.5/1/2 mol/L 的EDC 溶液中,將NHS 按nEDC∶nNHS 為4∶1(w/w)的量加入,以嗎啉乙磺酸為緩沖劑調(diào)節(jié)pH 值至5.5,4 ℃下放置24 h,再用0.1 mol/L 的Na2HPO4溶液浸泡1 h 得到。腹直肌脫細(xì)胞后不同EDC-NHS 濃度交聯(lián)后分為4 組,分別為腹直肌單純脫細(xì)胞組(RADCM)、腹直肌脫細(xì)胞后與0.5 mol/L EDC 交聯(lián)組(RADCM/EDC 0.5)、腹直肌脫細(xì)胞后與1 mol/L EDC 交聯(lián)組(RADCM/EDC 1)、腹直肌脫細(xì)胞后與2 mol/L EDC交聯(lián)組(RADCM/EDC 2)。

    1.2.3 形貌觀察 將4 組脫細(xì)胞支架凍干后用導(dǎo)電膠黏附于銅臺(tái)上,噴金后在掃描電子顯微鏡下觀察膠的情況。

    1.2.4 力學(xué)測試 將4 組脫細(xì)胞支架用材料試驗(yàn)機(jī)(Instron 5980)進(jìn)行拉伸力學(xué)測試。

    1.2.5 生物相容性研究 支架上種植H9C2 細(xì)胞(1.5 × 104/cm2),用Live&Dead Viability 試劑盒進(jìn)行避光染色觀察;用F-actin 和DAPI 進(jìn)行染色觀察;并用Image J 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

    1.2.6 免疫組化染色進(jìn)行脫細(xì)胞支架功能分析 種植原代心肌細(xì)胞(1.5×104/cm2)。第7天進(jìn)行免疫組化染色,一抗CX-43(1∶250)和α-actinin(1∶250)4 ℃孵育過夜,488 donkey anti-mouse(1∶200)和568 donkey anti-rabbit(1∶200)二抗中避光孵育2 h,DAPI 染色。在支架上種植HUVECs(1.5×104/cm2),用F-actin 和DAPI染色液進(jìn)行染色,在共聚焦顯微鏡下觀察。

    1.2.7 qRT-PCR 檢測血管特異性基因 從細(xì)胞中提取總RNA,用qPCR cDNA合成試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA,用2x All-in-One qPCR 試劑盒按標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行擴(kuò)增;用2-ΔΔCT方法對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和比較。對照組的倍數(shù)變化歸一化為GAPDH mRNA的表達(dá)。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用軟件SPSS 20.0 進(jìn)行分析,計(jì)量資料用()表示,組間比較采用單因素方差分析,若方差齊則采用LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較,若方差不齊則采用Dunnett′s T3 檢驗(yàn),P<0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 利用不同染色方法觀察腹直肌組織脫細(xì)胞效果 由HE 染色、MASSON 染色和DAPI 染色可見,脫細(xì)胞前可見明顯細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)(圖1A);脫細(xì)胞后基本未見細(xì)胞核,可見松散的膠原纖維(圖1B),說明所用脫細(xì)胞方法有效。

    2.2 4 組腹直肌脫細(xì)胞支架的掃描電鏡和Elisa 檢測VEGF 含量 脫細(xì)胞后腹直肌各組支架無明顯區(qū)別(圖2A);掃描電鏡可見RADCM 組膠原結(jié)構(gòu)排列整齊但松散;交聯(lián)后腹直肌脫細(xì)胞支架膠原方向由縱向轉(zhuǎn)為網(wǎng)狀,RADCM/EDC 0.5 組網(wǎng)孔直徑約(15±5)μm,網(wǎng)孔較規(guī)則,其余交聯(lián)組網(wǎng)孔較大且不規(guī)則(圖2B)。ELISA 檢測可見各組材料上均存在VEGF,RADCM/EDC 0.5 組在交聯(lián)劑組中VEGF 的含量最高(圖2C)。

    圖2 4 組腹直肌組織脫細(xì)胞支架掃描電鏡圖Fig.2 SEM images of 4 groups decellularized scaffold of rectus abdominis tissue

    2.3 腹直肌組織脫細(xì)胞支架力學(xué)表征 脫細(xì)胞支架的應(yīng)力應(yīng)變曲線和彈性模量隨著交聯(lián)劑的濃度上升,各組彈性模量均在工程化心肌補(bǔ)片范圍內(nèi)(P<0.01)。見圖3。

    圖3 4 組腹直肌組織脫細(xì)胞支架力學(xué)表征Fig.3 Mechanical property characterization of decellular scaffold of rectus abdominis tissue

    2.4 腹直肌脫細(xì)胞支架的細(xì)胞相容性 H9C2細(xì)胞在支架上活死染色3 次檢測各組活細(xì)胞率均大于80%,表明各組均具有良好的生物相容性(圖4A)。第3 天4 組活細(xì)胞面積占比約在(45 ± 15)%;第7 天RADCM 和RADCM/EDC 0.5 組 大于80%,而RADCM/EDC 2 組只見零星細(xì)胞。RADCM/EDC 0.5組活細(xì)胞面積占比最高,交聯(lián)劑濃度越高細(xì)胞面積占比明顯減少,說明0.5 mol/L EDC/NHS 交聯(lián)產(chǎn)生的支架最適合用于進(jìn)一步構(gòu)建工程化心肌補(bǔ)片(P<0.01,圖4B)。

    圖4 單純腹直肌組織脫細(xì)胞支架與不同濃度EDC-NHS 交聯(lián)后腹直肌組織脫細(xì)胞支架的生物相容性Fig.4 Biocompatibility of decellular scaffold of rectus abdominis tissue without and with EDC-NHS crosslinking treated

    2.5 心肌細(xì)胞在不同脫細(xì)胞支架材料上的形態(tài)和心肌特異性蛋白表達(dá)情況 通過F-actin 和DAPI 染色,觀察其細(xì)胞伸展情況(圖5A)。在第7天F-actin表達(dá)面積占比:RADCM/EDC 0.5 組最大,可見明顯細(xì)胞伸展且細(xì)胞狀態(tài)良好。RADCM/EDC 2 組約(7.7±2)%,細(xì)胞明顯不伸展。觀察心肌細(xì)胞肌節(jié)生長情況(圖5B),可見0.5 mol/L EDC/NHS 交聯(lián)組肌節(jié)形成和CX-43 表達(dá)最高(P<0.001,圖5)。

    圖5 腹直肌組織不同脫細(xì)胞支架上心肌細(xì)胞的形態(tài)和心肌特異性蛋白表達(dá)情況Fig.5 The morphological and cardiac-specific proteins of cardiomyocytes in different decellularizad scaffold of rectus abdominis tissue

    2.6 HUVECs 在不同脫細(xì)胞支架材料上的血管生成情況 爬片上可見密集分布的HUVECs,但未見血管樣管腔形成。未交聯(lián)組和0.5 mol/L 交聯(lián)組均可見血管樣管腔形成,且0.5 mol/L 組形成的血管樣管腔更多且管腔內(nèi)徑更大(P<0.01,圖6)。qRT-PCR檢測血管形成相關(guān)的VEGF 和eNOS 的基因表達(dá)(圖6C),結(jié)果顯示:RADCM/EDC 0.5組VEGF和eNOS的基因表達(dá)量最高,這和前面的結(jié)果是一致的。

    圖6 腹直肌組織不同脫細(xì)胞支架上HUVECs 骨架、血管形成相關(guān)基因和VEGF 表達(dá)情況Fig.6 The morphological、angiogenesis related genes and VEGF of HUVECs in different decellularized scaffold of rectus abdominis tissue

    3 討論

    工程化心臟補(bǔ)片(ECP)是一種新興的心肌梗死(MI)治療方法,而脫細(xì)胞材料的引入是構(gòu)建低免疫性補(bǔ)片的有效方法[15-16]。本文采用的溫和脫細(xì)胞方法,盡可能地保留其膠原的排列和連接,同時(shí)降低其免疫原性。骨骼肌細(xì)胞外基質(zhì)不僅擁有與心肌細(xì)胞外基質(zhì)相似的生物活性成分,而且骨骼肌組織也具有良好的收縮性,其細(xì)胞外基質(zhì)Ⅰ、Ⅳ膠原及各種生長因子等含量豐富。此外,骨骼肌來源廣泛,因此選取骨骼肌脫細(xì)胞支架制備工程化心肌補(bǔ)片。

    脫細(xì)胞后組織的膠原間連接松散且排列雜亂、易發(fā)生收縮形變以及力學(xué)強(qiáng)度低機(jī)械性能不足等缺點(diǎn)[17]。而工程化心肌補(bǔ)片需要仿生的力學(xué)強(qiáng)度來抑制心肌梗死后的心臟擴(kuò)張,因此本研究對脫細(xì)胞支架進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)。EDC 溶液是個(gè)可溶于水的碳二亞胺,幫助膠原分子間的羧基和氨基之間反應(yīng)形成酰胺鍵,而試劑EDC 和NHS 本身并沒有成為實(shí)際交聯(lián)的一部分,可以消除并被清洗掉。通過與EDC、NHS 溶液交聯(lián),掃描電鏡可見膠原從縱向結(jié)構(gòu)變成了交錯(cuò)的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),其與天然心肌組織的肌肉方向相似,并且其有效提高了材料的力學(xué)強(qiáng)度,0.5 mol/L EDC/NHS 交聯(lián)組的力學(xué)強(qiáng)度更接近人體天然心室肌力學(xué)強(qiáng)度[18]。天然的細(xì)胞外基質(zhì)中細(xì)胞因子含量豐富,在調(diào)節(jié)細(xì)胞行為和血管肌肉再生方面起著關(guān)鍵作用。已知血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)在心臟修復(fù)時(shí)可促進(jìn)血管生成并改善心梗后心臟功能[19-20],而本研究制備的各組骨骼肌脫細(xì)胞材料上ELISA 檢測均有骨骼肌組織原有的VEGF,這可能對后續(xù)促進(jìn)血管化有利,而其他脫細(xì)胞工程化心肌補(bǔ)片基本無天然細(xì)胞因子殘留。

    此外,由于EDC和NHS的交聯(lián)形成的膠原網(wǎng)絡(luò)細(xì)胞存活率高,細(xì)胞存活面積占比RADCM/EDC 0.5組最高,其更加適合細(xì)胞的生長,并用于進(jìn)一步構(gòu)建工程化心肌補(bǔ)片。在共聚焦顯微鏡下觀察,RADCM 組很多死細(xì)胞卡在膠原間隙中,可能因?yàn)槠淇v行結(jié)構(gòu)不利于細(xì)胞黏附,而RADCM/EDC 2 組細(xì)胞到7 d 時(shí)細(xì)胞數(shù)量明顯減少,可能是由于過高濃度的交聯(lián)劑雖然可以有效提高力學(xué)強(qiáng)度,但過高濃度交聯(lián)使得支架表面孔隙減少,細(xì)胞不利于黏附生長,這也進(jìn)一步證明通過低濃度交聯(lián)增加膠原間連接是有利的。

    在原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)中,RADCM/EDC 0.5 組種植的CMS之間形成了明顯的肌節(jié)和CX-43,表明0.5 mol/L 交聯(lián)可以促進(jìn)心肌細(xì)胞的成熟和功能化,這可能是因?yàn)?.5 mol/L 交聯(lián)組的力學(xué)強(qiáng)度和結(jié)構(gòu)更接近天然心室肌。種植的HUVECs 經(jīng)F-actin 染色,未交聯(lián)組和0.5 mol/L 交聯(lián)組均可見血管樣管腔形成。血管形成通過qRT-PCR 驗(yàn)證,RADCM/EDC 0.5 組支架的VEGF 和eNOS 含量最高,其對血管的生成具有促進(jìn)作用。因此,骨骼肌脫細(xì)胞支架制備的工程化心肌補(bǔ)片可以為細(xì)胞提供合適的三維微環(huán)境,促進(jìn)外源性CMS 和HUVECs 的成熟和功能化。由此推測RADCM/EDC 0.5 工程化心肌補(bǔ)片可能對心梗修復(fù)血管化有一定促進(jìn)作用,因此具有心梗后心臟修復(fù)的潛能。

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