microRNA-7-5p在甲狀腺乳頭狀癌中的表達及機制

秦小靜 范會利 林旭 王冬梅 薛剛 吳靖芳

1河北北方學(xué)院形態(tài)學(xué)實驗室（河北張家口075000）；2河北中醫(yī)學(xué)院（石家莊050091）；3張家口市重點實驗室（河北張家口075000）

甲狀腺癌（thyroid carcinoma，TC）約占所有內(nèi)分泌腫瘤的95%，甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid cancer，PTC）在甲狀腺癌中占比較大［1］。盡管大多數(shù)PTC 患者預(yù)后良好，但容易發(fā)生淋巴結(jié)和遠處器官轉(zhuǎn)移，影響患者的存活率［2］。因此，探索影響PTC 進展的分子機制并尋找其潛在靶點意義深刻。microRNA（miRNA）是廣泛存在于真核細胞、高保守的非編碼單鏈小RNA 分子，主要通過誘導(dǎo)翻譯抑制或與靶mRNA 互補結(jié)合達到基因沉默的效果［3］。不同組織學(xué)類型、不同臨床分期的PTC中有許多miRNA發(fā)生異常改變，如PTC中miR-181b 上調(diào)促進TPC-1 的增殖［4-6］。miRNA-21 通過VHL/PI3K/AKT 通路促進細胞增殖和侵襲［7］。miR-7-5p通過下調(diào)許多生長促進靶標，抑制體內(nèi)和體外腫瘤的生長。如miR-7-5p 和miR-152-3p 聯(lián)合可通過Wnt/β-catenin 信號通路的活化抑制，阻礙乳腺癌MCF-7/TAX 細胞株EMT 進程［8］。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)三葉因子3（TFF3）可以通過MAPK信號通路影響PTC的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化；但miRNA-7-5p在PTC中的作用機制尚不明確。本研究旨在探討miRNA-7-5p在PTC臨床樣品和細胞系中的表達，探索miRNA-7-5p 對PTC 細胞增殖、遷移的影響及其相關(guān)分子機制，為PTC的臨床診斷與靶向治療提供新依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料 人正常甲狀腺上皮Nthy-ori 3-1 細胞系和PTC 細胞系（TPC-1、BCPAP、K1）購自中國科學(xué)院上海細胞所，胎牛血清和RMPI1640 培養(yǎng)基購自美國Gibco 公司，LipofectamineTM3000、TRIzol裂解液均購自Invitrogen 公司。miR-7-5p 模擬物（mimics-7-5p）及抑制劑（inhibitor-7-5p）及陰性對照（mimics-NC/NC-in）、miR-7-5p、內(nèi)參U6 引物、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及熒光定量PCR 試劑盒均來源于廣州銳博生物科技有限公司。雙熒光素酶報告檢測試劑盒、transwell 小室、基質(zhì)膠均購自美國Promega 公司；包含TFF3-3′UTR 野生型（WT-TFF3-3′UTR）和突變序列（MUT-TFF3-3′UTR）的雙熒光素報告基因質(zhì)粒由北京合生基因公司合成。鼠β-actin 單克隆抗體、超敏ExPlus ECL 化學(xué)發(fā)光檢測試劑購自康為世紀生物科技有限公司。TFF3 抗體購自博士德生物工程有限公司。

1.2 樣本來源 52 例甲狀腺乳頭狀癌組織及其配對的癌旁組織（距腫瘤邊緣≥2 cm）收集于2019年1月至2020年8月于河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院完成手術(shù)的PTC 患者，術(shù)后病理切片均經(jīng)病理檢測確診且術(shù)前均未接受放化療，并簽署知情同意書。本研究已經(jīng)河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院倫理委員會批準。所有組織標本均由術(shù)中獲取，并迅速保存于-80 ℃低溫冰箱。

1.3 方法

1.3.1 qRT-PCR 檢測TC 組織及細胞中相關(guān)基因表達 提取52 例PTC 及其癌旁組織、人正常甲狀腺上皮細胞Nthy-ori 3-1 及PTC 細胞株TPC-1、BCPAP、K1 中的總RNA，測定RNA 濃度。miR-7-5p 正向引物序列為5′-UGGAAGACUAGUGAUUUUGUUGUU-3′，反向引物序列為5′-AACAACAAAAUCACUAGUCUUCCA-3′；內(nèi)參U6 正向引物序列為5′-UUUGUACUACACAAAAGUACUG-3′，反向引物序列為5′-CAGUACUUUUGUGUAGUACAAA-3′。按照試劑盒說明書進行實時熒光定量PCR 分析，設(shè)置qRT-PCR 反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性30 s，40 個循環(huán)擴增反應(yīng)（95 ℃5 s，60 ℃20 s）。各組miR-7-5p的相對表達采用2-△△Ct法計算。

1.3.2 細胞培養(yǎng)和細胞轉(zhuǎn)染 37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)上述細胞，胰蛋白酶消化傳代。選取對數(shù)生長期的TPC-1 和K1 細胞分別接種于6 孔板上，待細胞融合度為70%左右時，利用LipofectamineTM3000進行轉(zhuǎn)染，細胞分為3 組：（1）空白對照組（TPC-1/K1 組）不做任何處理；（2）陰性對照組（mimics-NC/NC-in 組）轉(zhuǎn)染mimics-NC/NC-in；（3）實驗組（mimics-7-5p/inhibitor-7-5p 組）轉(zhuǎn)染miR-7-5p mimics 或miR-7-5p inhibitor。轉(zhuǎn)染6 h 后換液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集各組細胞，qRT-PCR 檢測轉(zhuǎn)染效果。

1.3.3 細胞增殖狀況 取轉(zhuǎn)染48 h 的3 組TPC-1、K1 細胞，0.25%胰蛋白酶消化后重懸，調(diào)整細胞濃度為1×107/L，接種到96 孔板，置于ZOOM40731 儀器中進行細胞培養(yǎng)并成像，待細胞長滿后，生成數(shù)據(jù)并繪制生長曲線。

1.3.4 Transwell小室侵襲實驗 Transwell小室上室預(yù)鋪基質(zhì)膠，放置過夜成膜。轉(zhuǎn)染細胞饑餓24 h后，以無血清培養(yǎng)基消化收集各組細胞并調(diào)整細胞濃度為1 × 107/L，在小室上室內(nèi)加入200 μL 細胞懸液，小室外加入500 μL 含有10%FBS 的1640培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h。取出Transwell 小室，PBS 沖洗小室，棉簽輕柔擦去小室底部未穿過的細胞和基質(zhì)膠，4%多聚甲醛固定后PBS 沖洗2 次，染色，鏡下隨機選取5 個高倍視野拍照觀察并計數(shù)。

1.3.5 劃痕實驗 消化收集轉(zhuǎn)染48 h 的各組細胞，接種于6 孔板，待細胞生長至單層貼壁狀態(tài)且融合度達到90%后，用10 μL 槍頭在孔板中央筆直劃痕，PBS 洗去脫落的細胞，置于培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。由ZOOM40731 監(jiān)測記錄0、12、24 h 的3 組細胞劃痕愈合的動態(tài)過程，計算劃痕兩側(cè)遷移距離，劃痕遷移率=（劃痕寬度0 h-劃痕寬度12 h 或24 h）/劃痕寬度0 h×100%。

1.3.6 生物信息法預(yù)測miR-7-5p 的靶基因及雙熒光素酶報告基因驗證 通過miRanda 和TargetScan數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-7-5p 的可能靶基因為TFF3，并分析miR-7-5p 與靶基因TFF3 的3′UTR 存在互補結(jié)合位點。構(gòu)建含有TFF33′UTR靶向結(jié)合序列的野生型載體質(zhì)粒（pZDonor-TFF3-3′UTR-WT）和突變型載體質(zhì)粒（pZDonor-TFF3-3′UTR-MT），將構(gòu)建好的載體質(zhì)粒分別與miR-7-5p mimics 共轉(zhuǎn)染至TPC-1細胞，24 h 后收集細胞，按照雙熒光素酶活性檢測試劑盒說明書操作后續(xù)實驗。相對熒光酶活性=螢火蟲熒光素酶活性值/海腎熒光素酶活性值。

1.3.7 Western blot 轉(zhuǎn)染后的各組細胞裂解，提取總蛋白質(zhì)并定量。進行10 % SDS-PAGE 電泳，以濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h后，加入兔抗人TFF3 和鼠抗人β-actin 一抗（工作濃度分別為1∶100 和1∶5 000）搖床孵育過夜；次日PBST 洗膜3 次后再分別加入HRP 標記羊抗兔和羊抗鼠IgG 二抗（工作濃度1∶1 000），室溫孵育2 h，PBST 洗膜3 次后加入顯影液顯影。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 實驗設(shè)置3 個平行組，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示。采用SPSS 21.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析。多組間比較采用單因素方差分析，組間差異兩兩比較采用LSD 法，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-7-5p在PTC組織中的表達 qRT-PCR結(jié)果顯示：miR-7-5p 在PTC 組織中的相對表達水平明顯低于癌旁組織［（0.62 ± 0.07）vs.（1.0 ± 0.1），P＜0.01］見圖1A。不同臨床分期、腫瘤大小和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的PTC 患者miR-7-5p 表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），不同年齡和性別PTC患者miR-7-5p表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。miR-7-5p 與PTC 患者的臨床病理特征的關(guān)系見表1。TPC-1、BCPAP、K1 和Nthy-ori 3-1 中miR-7-5p 的表達水平分別為（0.37±0.06）、（0.58±0.11）、（0.64±0.08）和（1.03±0.29），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，圖1B）。轉(zhuǎn)染48 h 后：TPC-1 細胞實驗組miR-7-5p 水平升高（P＜0.05，圖2A）；K1 細胞實驗組miR-7-5p 的表達水平降低（P＜0.01，圖2B）。

表1 miR-7-5p 表達與PTC 患者臨床病理特征的關(guān)系Tab.1 The relationship between miR-7-5p and clinicopathological characteristics of PTC patients 例

圖1 miR-7-5p 在PTC、癌旁組織及不同細胞系的表達情況Fig.1 The relative expression level of miR-7-5p in PTC and para-carcacinoma tissues and cells

圖2 轉(zhuǎn)染48 h 后不同組別細胞中miR-7-5p 的表達水平Fig.2 The relative expression of miR-7-5p in different groups of cells

2.2 miR-7-5p 能夠抑制TPC-1/K1 細胞的增殖活性 miR-7-5p 轉(zhuǎn)染48 h 時TPC-1 細胞空白對照組、陰性對照組和實驗組的細胞融合率分別是（31.04±1.32）%、（30.45±1.07）%和（15.73±1.26）%；96 h時分別為（83.47 ± 8.22）%、（77.10 ± 1.26）%和（54.64± 3.52）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，圖3）。TPC-1 細胞實驗組融合率明顯低于空白對照組和陰性對照組；K1 細胞實驗組融合率均明顯高于空白對照組和陰性對照組，不同時相匯合度見表2。

圖3 TPC-1 細胞轉(zhuǎn)染miRNA-7-5p 后24、48、72、96 h 各個時間節(jié)點匯合度Fig.3 The confluence of cells at 24，48，72，96 after transfected in each group

表2 轉(zhuǎn)染后甲狀腺癌K1 細胞的增殖變化Tab.2 Proliferation of thyroid cancer K1 cells after transfection ±s

表2 轉(zhuǎn)染后甲狀腺癌K1 細胞的增殖變化Tab.2 Proliferation of thyroid cancer K1 cells after transfection ±s

注：與空白對照組和陰性對照組相比較，***P ＜0.001

組別空白對照組陰性對照組實驗組K1細胞匯合度（%）24 h 4.86±0.44 5.14±1.20 12.03±0.49***48 h 13.90±1.14 12.25±1.32 24.41±2.94***72 h 32.29±0.73 33.30±1.57 58.09±2.04***96 h 50.29±1.33 48.75±1.61 83.17±2.49***

2.3 miR-7-5p 能夠抑制TPC-1/K1 細胞的遷移、侵襲 TPC-1 細胞中，實驗組細胞侵襲數(shù)量顯著降低（P＜0.01，圖4A、B）。劃痕實驗結(jié)果表明，與mimics-NC 組和TPC-1 組相比，mimics-7-5p 組細胞的24 h 遷移率顯著降低（P＜0.05，圖5）。而NC-in組和K1 組與inhibitor-7-5p 組細胞的24 h 遷移率分別為（18.89 ± 1.83）%、（17.87 ± 2.74）%、（42.63±5.24）%和侵襲數(shù)量分別為（41.00±4.36）、（37.33± 2.52）、（71.02 ± 6.56），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）。

圖4 Transwell 檢測miRNA-7-5p 干擾TPC-1 細胞后細胞侵襲能力Fig.4 Cell invasion capacity in each group by transwell invasion

圖5 miRNA-7-5p 干擾TPC-1 細胞后0、12、24 h 細胞遷移能力Fig.5 The cell migration ability after miRNA-7-5p interferes with TPC-1 cells

2.4 miR-7-5p 可靶向下調(diào)TFF3 的表達 通過miRDB 以及TargetScan 聯(lián)合預(yù)測顯示TFF3 可能是miR-7-5p的靶基因，miR-7-5p與TFF3的3′UTR區(qū)存在種子序列互補的結(jié)合位點（圖6A）。采用雙熒光素酶報告實驗檢測發(fā)現(xiàn)，miR-7-5p 能明顯抑制野生型WT-TFF3 3′UTR 載體的熒光強度（P＜0.001，圖6B-C），而無法影響突變型MT-TFF3 3′UTR 載體的熒光強度；而K1 細胞中，野生型WT-TFF3 3′UTR 載體與miR-7-5p inhibitor 共轉(zhuǎn)染后的熒光強度明顯升高，而無法影響突變型MT-TFF3 3′UTR載體與miR-7-5p inhibitor 共轉(zhuǎn)染后的熒光強度。Western Blot 檢測發(fā)現(xiàn)，TPC-1 細胞中mimics-7-5p組TFF3 蛋白的表達水平明顯低于空白對照組和陰性對照組；K1 細胞inhibitor-7-5p 組TFF3 蛋白的表達水平則高于空白對照組和陰性對照組，miR-7-5p mimics 可靶向下調(diào)TFF3 的表達，而miR-7-5p inhibitor 則上調(diào)了TFF3 的表達，表明miR-7-5p 可以靶調(diào)控TFF3 的表達（圖7）。

圖6 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CTFF3 與miR-7-5p 靶向結(jié)合Fig.6 Dual luciferase reporter gene experiment verifies the targeted binding of TFF3 to miR-7-5p

圖7 轉(zhuǎn)染miR-7-5p 對PTC 細胞TFF3 蛋白表達的影響Fig.7 Effect of miR-7-5p transfection on TFF3 protein expression in PTC cells

3 討論

miRNA 表達失調(diào)有可能成為各種疾病診斷和檢測復(fù)發(fā)的生物學(xué)標志物。許多研究認為miRNA可作為潛在的抗癌分子和預(yù)后評價指標。閔貝貝等［9］的研究表明，結(jié)直腸癌患者的血漿外泌體樣本中miR-23b 表達明顯降低，其低表達與腫瘤分化程度、浸潤深度和TNM 分期等相關(guān)，可作為評估患者預(yù)后的標志物。miR-424-5p 可通過靶向抑制抑癌基因去乙?；福╯irtuin 4，SIRT4）的表達促進腫瘤細胞的遷移和侵襲，參與胃癌的發(fā)生、發(fā)展，并成為胃癌治療的新靶點［10］。miR-7-5p 作為與惡性腫瘤密切相關(guān)miRNAs 分子，在多種惡性腫瘤中異常表達：miR-7-5p 在人結(jié)直腸癌、在炎癥性腸病中，通過抑制PI3K/Akt 信號傳導(dǎo)途徑靶向TFF3 抑制LS174T 細胞的增殖和遷移，保護腸上皮屏障完整性［11］。SHI 等［12］研究發(fā)現(xiàn)miRNA-7-5p 在乳腺癌過表達，抑制細胞增殖并誘導(dǎo)細胞凋亡。DUAN 等［13］表明，石蠟包埋的PTC 組織中的miR-7-5p 的表達水平明顯低于對照組，在PTC 發(fā)生過程起著抑癌基因的作用。本研究通過qRT-PCR 對52對PTC 及癌旁組織中miR-7-5p 的檢測，發(fā)現(xiàn)miR-7-5p 在PTC 組織中呈低表達，Ⅲ+Ⅳ期亞組中miR-7-5p 低表達率明顯高于Ⅰ+Ⅱ期，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中miR-7-5p 低表達率明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，說明miR-7-5p 低表達與PTC 的發(fā)展有關(guān)。

為了研究miR-7-5p 對PTC 細胞增殖、侵襲及遷移等生物學(xué)行為的影響，在體外細胞學(xué)實驗中轉(zhuǎn)染mimics-7-5p 成功上調(diào)TPC-1 細 胞miR-7-5p 的表達，細胞增殖活性明顯降低，侵襲及遷移能力明顯下降，進一步證實miR-7-5p 在PTC 中能夠抑制TPC-1 細胞的惡性生物學(xué)行為，起著抑癌基因的作用；而轉(zhuǎn)染了inhibitor-7-5p 及其陰性對照的K1 細胞中，實驗組細胞增殖能力、侵襲和遷移能力均顯著上升，反向證實了miR-7-5p 促進K1 細胞的惡性生物學(xué)行為。邵曉雯等［14］在宮頸癌中也證實miR-7-5p 通過調(diào)控TFF3 抑制腫瘤細胞的侵襲和遷移。BAO 等［15］研究表明，雄激素受體可通過下調(diào)肝細胞癌circRNA7/miRNA7-5p/VE-Cadherin/Notch4 信號傳導(dǎo)抑制HCC 血管生成擬態(tài)抑制腫瘤進展和轉(zhuǎn)移作用。另有研究證實了miR-7-5p 增強腫瘤神經(jīng)膠質(zhì)瘤A172、T98G，甲狀腺乳頭癌TPC-1 和宮頸癌HeLa 細胞對藥物的敏感性，通過促凋亡和下調(diào)編碼ABC 家族關(guān)鍵多藥耐藥性蛋白發(fā)揮抗癌作用［16］。MiR-7-5p 與化學(xué)療法并用是一種有前途的策略。MiR-7-5p 通過下調(diào)線粒體載鐵蛋白降低Fe2+濃度，作為臨床腫瘤放射抗性中的關(guān)鍵因子［17］?？梢?，miR-7-5p 通過作用于不同的靶蛋白而影響細胞增殖和侵襲功能并在腫瘤的治療中扮演重要的角色［18-19］。為了探索miR-7-5p 對TFF3 的具體調(diào)控機制，通過生物學(xué)信息學(xué)預(yù)測TFF3 基因3′UTR 區(qū)存在miR-7-5p 的種子序列，可能是miR-7-5p 的靶基因。課題組前期研究［20］表明TFF3 促進了TPC-1 細胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化進程。為了驗證miR-7-5p 在PTC 中靶向調(diào)控TFF3 的作用機制，過表達miR-7-5p 能夠明顯降低TPC-1 細胞TFF3 蛋白的表達，抑制TPC-1 的惡性生物學(xué)行為；抑制了miR-7-5p 后，K1 細胞的增殖、遷移和侵襲能力則顯著升高。

綜上所述，miR-7-5p 在甲狀腺癌組織和細胞中的表達降低，miR-7-5p 可以通過靶向TFF3 抑制TPC-1 和K1 細胞的惡性生物學(xué)行為，為甲狀腺癌診斷和靶向治療提供了新的靶點。后期將從體內(nèi)動物水平進一步探索miR-7-5p 對PTC 生物學(xué)行為的影響。