長鏈脂酰輔酶A合成酶4調(diào)控環(huán)氧合酶2促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制研究

林佳敏 楊娜 張?zhí)O蘋 徐邦牢

華南理工大學(xué)附屬第二醫(yī)院檢驗(yàn)科（廣州510180）

2020年我國新增乳腺癌確診病例占全球24%，癌癥相關(guān)死亡病例占全球30%，女性癌癥患者乳腺癌的發(fā)病率已居首位［1］。研究表明，乳腺癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移相關(guān)的并發(fā)癥是乳腺癌患者死亡的主要原因［2］。脂質(zhì)代謝異常是癌細(xì)胞的重要標(biāo)志之一，脂質(zhì)代謝重編程為腫瘤轉(zhuǎn)移提供了新的選擇性優(yōu)勢［3-4］。游離脂肪酸在代謝之前必須經(jīng)過酰基輔酶A 合成酶激活成?；o酶A 酯，長鏈脂酰輔酶A合成酶（ACSLs）家族的失調(diào)會(huì)改變細(xì)胞內(nèi)游離脂肪酸的分布、種類和數(shù)量［5］，從而導(dǎo)致癌癥和其他代謝疾病，目前乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移過程中關(guān)鍵代謝酶的調(diào)控機(jī)制仍有待闡明。

長鏈脂酰輔酶A 合成酶4（ACSL4）是催化長鏈脂酸代謝的重要限速酶，屬于ACSLs 家族中的一員。ACSL4 對長鏈多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids，PUFA）如花生四烯酸（arachidonic acid，AA）的親和力較高［6］，AA 的代謝產(chǎn)物尤其是前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）與多種生物過程有關(guān)［7］。環(huán)氧合酶2（cyclooxygenase-2，COX2）是AA 催化產(chǎn)生PGE2 重要的限速酶［8］。ACSL4 在侵襲性三陰乳腺癌表達(dá)更高，抑制ACSL4 可以減少細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移［9］。雖然有研究顯示ACSL4 和COX2 對腫瘤增殖的影響［10］，但其是否促進(jìn)腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移，仍有待進(jìn)一步闡明。本研究旨在探討ACSL4 是否通過調(diào)控COX2 促進(jìn)乳腺癌轉(zhuǎn)移，研究代謝關(guān)鍵酶ACSL4 調(diào)控脂酸代謝促進(jìn)乳腺癌轉(zhuǎn)移的作用，對開發(fā)乳腺癌轉(zhuǎn)移的治療新策略具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料 人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231、MCF-7 細(xì)胞株由本實(shí)驗(yàn)室保存；DMEM 高糖培養(yǎng)基（Gibco公司，美國）、胎牛血清（BI 公司，英國）；新霉素和嘌呤霉素（索萊寶，中國）、0.25%胰蛋白酶（索萊寶，中國）；Trizol（Invertrogen，美國）；Transwell 小室（Corning 公司，美國）；ACSL4 兔來源一抗（Abcam 公司，美國），COX2 兔來源一抗（CST，美國）；VIMENTIN 兔來源一抗（CST，美國）；GAPDH 鼠來源一抗（Proteintech，中國）；PGE2 Elisa 檢測試劑盒（Elabscience，中國）；定量PCR 試劑（賽默飛，美國）；逆轉(zhuǎn)錄酶（Takara，日本）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) MDA-MB-231 和MCF-7 乳腺癌細(xì)胞，用含10%胎牛血清、1%雙抗DMEM 高糖培養(yǎng)基，在37 ℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞。

1.2.2 小干擾RAN（siRNA）轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定細(xì)胞系建立 轉(zhuǎn)染siRNA 由上海吉瑪生物公司合成，siACSL4：sense5′-GAGGCUUCCUAUCUGAUUATT-3′，antisense5′ - UAAUCAGAUAGGAAGCCUCTT - 3′ ；MDA-MB-231 細(xì)胞轉(zhuǎn)染按lipo-2000 的說明書進(jìn)行。過表達(dá)ACSL4 慢病毒購于漢恒生物公司，按照公司說明書感染MCF-7 乳腺癌細(xì)胞，用1 mg/mL嘌呤霉素篩選。轉(zhuǎn)染48 h，提取RNA 和蛋白質(zhì)，分析基因水平和蛋白水平的變化。

1.2.3 RT-PCR 檢測mRNA 表達(dá) Trizol 法提取細(xì)胞的總RNA，調(diào)節(jié)RNA 濃度為1 000 ng/μL，按照Takara RNA 逆轉(zhuǎn)試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA。采用SYBR Green PCR master mix 試劑盒進(jìn)行qRT-PCR。根據(jù)2-ΔΔct值計(jì)算相對表達(dá)量。

1.2.4 Western blot 提取細(xì)胞總蛋白，加入5×loading buffer 后100 ℃水浴使蛋白變性，配置10%的SDS-PAGE分離膠和5%濃縮膠，分離蛋白（60 V，30 min 后換100 V，1 h），轉(zhuǎn)膜（冰浴，100 V，1 h），封閉（5%脫脂奶粉，室溫，1.5 h），使用一抗稀釋液稀釋ACSL4（1∶10 000）、COX2（1∶1 000）、VIMENTIN（1∶1 000）、GAPDH（1∶10 000）一抗，4 ℃過夜。二抗（1∶1 000）常溫1.5 h，TBST洗膜后ECL顯影。

1.2.5 ELISA PGE2 檢測參照Elabscience 公司ELISA 試劑盒說明進(jìn)行。

1.2.6 遷移實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞生長到80%融合度時(shí)，用0.25%的胰酶消化，細(xì)胞消化后用無血清DMEM高糖培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5 × 104個(gè)/mL。吸取200 μL 細(xì)胞懸液加入Transwell 小室上室，下室加入含10%血清的DMEM 完全培養(yǎng)基700 μL。24 h 后取出小室，去除培養(yǎng)基，4%多聚甲醛固定10 min 后，擦去小室上層的細(xì)胞，下層細(xì)胞用結(jié)晶紫染色30 min，在顯微鏡下拍照。

1.2.7 劃痕實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞生長到90%融合度時(shí)，用0.25%的胰酶消化，用完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，鋪板12 孔板，每個(gè)重復(fù)3 次，當(dāng)24 h 細(xì)胞達(dá)到80% ～90%融合度時(shí)，使用10 μL 的槍頭劃痕，分別在0 h和24 h，顯微鏡下記錄細(xì)胞遷移的面積。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用GraphPad 8.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量結(jié)果以（）表示，計(jì)量資料兩組對比采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ACSL4 對乳腺癌轉(zhuǎn)移的影響 通過劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，利用siRNA 瞬時(shí)敲低高侵襲性的MDA-MB-231 乳腺癌細(xì)胞ACSL4 表達(dá)后，其轉(zhuǎn)移能力被顯著抑制（P＜0.05，圖1A-B）。在低侵襲性的MCF-7 細(xì)胞中過表達(dá)ACSL4 后，其轉(zhuǎn)移能力顯著增強(qiáng)（P＜0.05，圖1C-D）。由此可見，內(nèi)源性敲低或升高ACSL4 可以相應(yīng)的降低或升高細(xì)胞的侵襲能力。

圖1 ACSL4 對乳腺癌轉(zhuǎn)移的影響Fig.1 Effect of ACSL4 on breast cancer metastasis

2.2 生物信息學(xué)分析 GEPIA 在線分析TCGA 數(shù)據(jù)庫里，ACSL4 與COX2 表達(dá)呈正相關(guān)（r= 0.15，P＜0.05，圖2）。

圖2 TCGA 乳腺癌組織ACSL4 與COX2 基因表達(dá)相關(guān)性Fig.2 Correlation between ACSL4 and COX2 gene expression in TCGA breast cancer tissues

2.3 ACSL4 對乳腺癌細(xì)胞COX2 表達(dá)的影響 敲低高侵襲性的MDA-MB-231 乳腺癌細(xì)胞的ACSL4后，環(huán)氧合酶2（COX2）和波形蛋白（Vimentin）的基因表達(dá)水平和蛋白水平降低。過表達(dá)低侵襲性的MCF-7 細(xì)胞ACSL4 后，COX2 和波形蛋白表達(dá)水平升高（圖3）。

圖3 ACSL4 對乳腺癌細(xì)胞COX2 表達(dá)的影響Fig.3 Effect of ACSL4 on COX2 expression in breast cancer cells

2.4 ACSL4 對乳腺癌細(xì)胞PGE2 分泌水平的影響 敲低高侵襲性的MDA-MB-231 細(xì)胞的ACSL4后，通過ELISA 檢測細(xì)胞分泌的PGE2 的含量，PGE2的分泌量下降了29.8%（圖4A），在低侵襲性的MCF-7 乳腺癌細(xì)胞里過表達(dá)ACSL4，細(xì)胞分泌的PGE2 的含量升高29.5%，P＜0.05（圖4B）。

圖4 ACSL4 對乳腺癌細(xì)胞PGE2 分泌水平的影響Fig.4 Effect of ACSL4 on PGE2 secretion level of breast cancer cells

3 討論

ACSLs 家族是長鏈脂肪酸活化必需的酶（12 ～20 個(gè)碳原子），在哺乳動(dòng)物中ACSLs 有五種亞型，即ACSL1、ACSL3、ACSL4、ACSL5 和ACSL6，它們在長鏈脂肪酸的激活中具有相似又特定的作用［11］。ACSL4 的偏好底物為二十碳多不飽和脂肪酸（PUFA），如花生四烯酸（AA）和二十碳五烯酸（EPA）［12］，ACSL4 表達(dá)會(huì)增加游離AA 向PGE2 轉(zhuǎn)化［13］。ACSL4 表達(dá)與乳腺癌細(xì)胞中的侵襲性表型相關(guān)，在侵襲性三陰乳腺癌中表達(dá)更多。17 β-雌二醇增加ACSL4 表達(dá)并促進(jìn)AA 和EPA 的吸收。ASCL4 沉默阻止了17β-雌二醇誘導(dǎo)的p-Akt 和p-GSK3β 的上調(diào)和E-cadherin 的減少，從而減弱了癌細(xì)胞的侵襲能力［14］。雖然有研究表明，在乳腺癌侵襲性表型中，抑制ACSL4-LOX-COX2 通路可以顯著降低腫瘤生長，但ACSL4 促進(jìn)乳腺癌轉(zhuǎn)移的具體機(jī)制還有待闡明［10］。本研究顯示ACSL4能明顯增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞系的遷移和侵襲能力。內(nèi)源性ACSL4 的缺失或升高，可以分別抑制或提高M(jìn)DA-MB-231 和MCF-7 細(xì)胞的侵襲能力，提示ACSL4 是乳腺癌細(xì)胞侵襲促進(jìn)因子，為乳腺癌的治療提供了新的治療靶標(biāo)。

AA 通過三種不同酶催化的途徑產(chǎn)生不同的生物活性產(chǎn)物：環(huán)氧合酶（COX）、脂肪氧化酶（LOX）和細(xì)胞色素P450（CYP）通路［15］。COX 家族成員，包括COX1 和COX2，介導(dǎo)AA 轉(zhuǎn)化為PGH2，PGH2 隨后代謝為PGD2、PGE2、PGF2α、PGI2，和血栓素A2（TXA2）［16］。源自COX2 的PGE2 可以激活結(jié)腸癌中雷帕霉素復(fù)合物1（mechanistic target of rapamycin complex 1，mTORC1）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的機(jī)制靶點(diǎn)，從而促進(jìn)VEGF 的表達(dá)和釋放，引起細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)和血管生成［17］。另一項(xiàng)研究表明，PGE2激活EP1R，從而通過涉及蛋白激酶C（PKC）、NF-κB和叉頭盒蛋白C2（FoxC2）的信號傳導(dǎo)增加β1-整聯(lián)蛋白的表達(dá)，誘導(dǎo)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移［18］。本研究通過生物信息學(xué)分析了ACSL4 與COX2 存在正相關(guān)關(guān)系，在MDA-MB-231 細(xì)胞中敲低ACSL4，可以在mRNA 水平和蛋白水平上降低COX2 的表達(dá)，同時(shí)，通過ELISA 檢測細(xì)胞分泌的PGE2 的水平減低，在MCF-7 細(xì)胞中過表達(dá)ACSL4，可以在蛋白水平上提高COX2，通過ELISA 檢測細(xì)胞分泌的PGE2的水平升高，與生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果一致，進(jìn)一步提示ACSL4 通過調(diào)控COX2 的表達(dá)，催化AA 生成PGE2，增加PGE2 的生成。

波形蛋白是間充質(zhì)細(xì)胞中的一種Ⅲ型中間絲蛋白，主要在成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和淋巴細(xì)胞中表達(dá)［19］，在細(xì)胞水平上，波形蛋白參與細(xì)胞遷移、分化、增殖、粘附和侵襲［20］。有研究表明，波形蛋白高表達(dá)與乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有一定的相關(guān)性，是影響乳腺癌預(yù)后的潛在因素［21］。本研究結(jié)果顯示在MDA-MB-231 細(xì)胞中敲低ACSL4，可以在mRNA 和蛋白水平降低波形蛋白的表達(dá)，在MCF-7細(xì)胞中過表達(dá)ACSL4，可以在蛋白水平上升高波形蛋白的表達(dá)。進(jìn)一步提示了ACSL4 與乳腺癌轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，ACSL4 可能是通過調(diào)節(jié)COX2 促進(jìn)PGE2 的分泌，增強(qiáng)了乳腺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移的能力，這可能是乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制之一。

綜上所述，本研究目前在細(xì)胞水平揭示了ACSL4 可以促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，其主要通過調(diào)節(jié)COX2 促進(jìn)PGE2 分泌發(fā)揮作用。下一步需要在動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證ACSL4-COX2 在乳腺癌轉(zhuǎn)移過程中的作用，深入研究ACSL4 調(diào)節(jié)COX2 的分子機(jī)制以及代謝產(chǎn)物PGE2 涉及的信號通路對乳腺癌發(fā)生發(fā)展的影響，以期開發(fā)針對乳腺癌轉(zhuǎn)移的治療新策略。