固相萃取中的常見問題和解決辦法

朱學(xué)多,楊義勇,于 佳,陳 明,蘭苗宇,陸書來

（1中國石油ABS技術(shù)中心,吉林省吉林市 132021；2中國石油吉林石化公司合成樹脂廠，吉林省吉林市 132021）

對(duì)分析檢測(cè)人員來說，樣品前處理是至關(guān)重要的一環(huán)，其占整個(gè)分析過程的60%以上的時(shí)間，主要的分析誤差也來自樣品前處理環(huán)節(jié)。固相萃?。⊿olid Phase Extraction，簡稱SPE）作為樣品前處理的技術(shù)之一，得到了越來越廣泛的應(yīng)用，并在此基礎(chǔ)上，發(fā)展出了固相微萃?。⊿PME）、基質(zhì)固相分散萃?。∕SPDE）、免疫親和（IAC）固相萃取、分散固相萃?。―SPE）和分子印跡固相萃?。∕ISPE）等新型樣品前處理技術(shù)［1］。

本文介紹了固相萃取技術(shù)的定義、分類、用途、特點(diǎn)和應(yīng)用，總結(jié)了常見問題及其解決方法，以期為使用固相萃取技術(shù)的工作者提供幫助。

1 固相萃取簡介

固相萃取由液固萃取柱和液相色譜技術(shù)相結(jié)合發(fā)展而來，利用固體吸附劑將液體樣品中的目標(biāo)化合物吸附，與樣品的基體和干擾化合物分離，然后再用洗脫液洗脫或加熱解吸附，達(dá)到分離和富集目標(biāo)化合物的一種樣品前處理技術(shù)。根據(jù)使用固相萃取的目的，可以將固相萃取分為兩類：目標(biāo)化合物吸附模式固相萃取和雜質(zhì)吸附模式固相萃取。固相萃取具有分離、凈化、濃縮及轉(zhuǎn)換溶劑等作用。

2 固相萃取的特點(diǎn)

2.1 固相萃取與液-液萃取的比較

液-液萃?。↙LE）雖然是目前使用最廣泛的樣品前處理技術(shù)之一，但其在實(shí)際操作中還存在一些問題。例如：萃取結(jié)果嚴(yán)重依賴操作人員的熟練程度；大量使用有機(jī)溶劑；乳化層中的目標(biāo)化合物難于分離；勞動(dòng)強(qiáng)度大；費(fèi)時(shí)間；難以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化操作［2］。

相對(duì)于液-液萃取，固相萃取正好彌補(bǔ)了上述不足，具有如下優(yōu)點(diǎn)：(1)給定一個(gè)固相萃取方法，操作人員比較容易重現(xiàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。(2)在固相萃取中，有機(jī)溶劑的使用量比經(jīng)典的液-液萃取少得多。(3)固相萃取中沒有乳化問題。(4)目前固相萃取填料有許多不同的種類，可以選擇性地分離萃取某類指定的目標(biāo)化合物。(5)已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了自動(dòng)化操作。

2.2 固相萃取與高效液相色譜的比較

雖然固相萃取和高效液相色譜（HPLC）都是通過液體中的目標(biāo)化合物在固體填料上進(jìn)行的吸附及脫附達(dá)到分離目的，但兩者之間還是有區(qū)別。首先，兩者的目的不同。HPLC的主要目的是在盡可能短的時(shí)間里實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品的定性或者定量分析。而固相萃取的主要目的是為了在其他分析設(shè)備上實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品的定性或者定量分析而對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行分離、凈化或者濃縮。其次，化合物在兩種柱上的行為不同。在HPLC中，樣品進(jìn)入色譜柱后首先在柱頭聚集，隨著流動(dòng)相連續(xù)不斷地進(jìn)入，化合物在色譜柱上連續(xù)不斷地在固相與液相之間分配以達(dá)到分離的目的，這個(gè)過程直到化合物流出色譜柱才停止。而化合物在SPE柱上的行為則不同，樣品基質(zhì)就是流動(dòng)相。由于SPE柱的填料高度一般都很短，化合物在SPE柱上幾乎沒有分離，要么被吸附，要么隨基質(zhì)流過。因此，固相萃取是無法分別將混合物中的各組份分離開的。但在某種條件下，固相萃取可以將不同類別的混合物分離。SPE與HPLC的主要區(qū)別見表1［2］。

表1 固相萃取與高效液相色譜的對(duì)比Table 1 Comparison of solid phase extraction and high performance liquid chromatography

2.3 固相萃取的局限性

每種樣品前處理方法都有一定的局限性，固相萃取也不例外。對(duì)于固相萃取，樣品必須呈液態(tài)或氣態(tài)，否則，樣品無法通過固相萃取柱，只能通過一定的方法，將目標(biāo)化合物轉(zhuǎn)移至液體中，然后才能進(jìn)行固相萃取。

3 固相萃取的應(yīng)用

固相萃取技術(shù)發(fā)展到現(xiàn)在，已經(jīng)在環(huán)保分析、食品分析、生命科學(xué)和司法鑒定等領(lǐng)域得到應(yīng)用。

黃思靜等［3］采用超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜法（UPLC-HRMS）同時(shí)測(cè)定水體中7種青霉素殘留。水樣經(jīng)Oasis HLB固相萃取小柱富集和凈化后，用反向C18色譜柱分離，以0.1%的甲酸水溶液和乙腈溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，采用電噴霧離子源正離子模式進(jìn)行檢測(cè)。7種青霉素類化合物在1.0~20.0 μg/L的線性范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)r均大于0.99，檢出限為1~10 ng/L。實(shí)際水樣加標(biāo)回收率為91.15%~106.36%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.30%~8.47%，均小于10%。羅斌等［4］采用固相萃取-氣相色譜質(zhì)譜法測(cè)定地表水中硝基氯苯殘留量，并通過萃取條件優(yōu)化，選擇HLB柱為固相萃取柱，正己烷：丙酮（體積比3：2）溶液為洗脫劑。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法具有實(shí)用性強(qiáng)、操作簡便快捷、重復(fù)性好、靈敏度高、定性定量結(jié)果準(zhǔn)確可靠等優(yōu)點(diǎn)，滿足了地表水中硝基氯苯類物質(zhì)殘留量的檢測(cè)需要。

楊俊等［5］通過優(yōu)化固相萃取柱和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法的分離條件，建立了一種氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)表明，在0.2~10 μg/mL線性范圍內(nèi)，9種COPs的相關(guān)系數(shù)(R2)均大于0.998，方法檢出限低于0.00015mg/kg。3個(gè)加標(biāo)水平(0.5、1、5 mg/kg)的回收率在79.6%和101%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)低于5%(n=3)。該法具有較高的靈敏度和準(zhǔn)確性，可成功應(yīng)用于食品中9種COPs的含量檢測(cè)。張家華等［6］將雞肉、豬肉組織樣品通過甲醇-乙腈（體積比1：1）提取和C18固相萃取柱凈化處理后，進(jìn)行梯度洗脫，電噴霧電離，在正離子、多反應(yīng)檢測(cè)模式下進(jìn)行檢測(cè)分析，建立了用于豬肉、雞肉中睪酮、甲睪酮、黃體酮等11種同化激素殘留量檢測(cè)的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。結(jié)果表明，11種目標(biāo)分析物在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.99；在10、20、50 μg/kg濃度水平下，豬肉中11種同化激素的平均回收率為74.3%~101.1%，雞肉中11種同化激素的平均回收率為70.1%~97.4%。11種同化激素在豬肉、雞肉中檢測(cè)限和定量限分別為0.1~0.5 μg/kg和0.3~1 μg/kg，變異系數(shù)均小于15%。所建立的方法靈敏度高、特異性強(qiáng)，可用于豬肉、雞肉中睪酮等11種同化激素的殘留檢測(cè)分析。

藍(lán)月［7］采用固相萃取技術(shù)，以二氧化硅納米粒子為DNA分離純化的新型固相吸附劑，建立了一種快速、高效的DNA分離純化方法，實(shí)現(xiàn)了全血中DNA的自動(dòng)化在線萃取。陳貝貝［8］開發(fā)了適合于元素形態(tài)分析的新型樣品前處理技術(shù)，建立了新型混合涂層改性中空纖維膜管內(nèi)固相微萃取及磁固相萃取與HPLC-ICP-MS聯(lián)用新方法，并成功用于生物樣品中元素形態(tài)分析。提出了芯片磁固相微萃取技術(shù)與ETV-ICP-MS聯(lián)用新方法，并成功應(yīng)用于細(xì)胞分析及蛋白質(zhì)定量，為金屬組學(xué)研究提供了新的技術(shù)平臺(tái)。

張春水等［9］對(duì)吸食過量海洛因死亡者的尿液進(jìn)行固相萃取處理后，用GC/MS分析，成功從尿液中檢測(cè)出海洛因合成副產(chǎn)物單乙酰可待因和海洛因代謝產(chǎn)物嗎啡，這兩種物質(zhì)同時(shí)存在于尿液中，基本認(rèn)定被測(cè)者吸食了海洛因毒品。Strayer K E等［10］采用固相萃取法凈化富集了血液中24中芬太尼類物質(zhì)，回收率為60.0%~95.0%。固相萃取法是生物樣品中芬太尼類物質(zhì)提取和富集最常用的前處理方法。

4 固相萃取常見問題與解決辦法

固相萃取中常見的問題主要有以下四個(gè)方面：流速問題、回收率問題、污染問題和非萃取問題。

4.1 流速問題

穩(wěn)定的流速對(duì)SPE來說十分重要，尤其在樣品過柱和洗脫步驟，直接影響目標(biāo)化合物的回收率。流速過快會(huì)降低目標(biāo)化合物的回收率；流速過慢會(huì)增加分析時(shí)間，降低工作效率。

影響流速的因素主要有以下幾個(gè)方面：

（1）隔片。SPE柱上下兩個(gè)隔片的作用是固定填料。隔片的孔徑大小不一或者大小不合適，會(huì)對(duì)流速產(chǎn)生負(fù)面影響。如果其邊緣切割的不好，液體就會(huì)沿著隔片邊緣沿著柱子內(nèi)壁流過，而不是通過填料；在運(yùn)輸或使用過程中也可能會(huì)出現(xiàn)填料流失的現(xiàn)象。隔片本身材質(zhì)的親水性或疏水性對(duì)流速也有影響。

（2）裝柱過程。萃取柱的填料裝填過密會(huì)限制流速，裝填過松則會(huì)導(dǎo)致流速過快，造成回收率和選擇性方面出現(xiàn)問題。

（3）外力。外力不穩(wěn)定會(huì)造成液體過柱流速的不穩(wěn)定。

（4）樣品本身。樣品本身的黏度和顆粒數(shù)量都對(duì)流速有影響。黏度大或者樣品中的顆粒較多都會(huì)造成隔片微孔的部分或者全部堵塞，進(jìn)而影響液體過柱的流速。對(duì)于黏度大的樣品，可對(duì)其稀釋來解決。需要注意的是，稀釋液本身不能含有大量與目標(biāo)化合物競(jìng)爭的成分，通常選用適當(dāng)?shù)木彌_溶液對(duì)樣品進(jìn)行稀釋，并注意緩沖溶液的用量。對(duì)于存在大量顆粒的樣品，可采用過濾和離心的方法去除。

4.2 回收率問題

在SPE中，流速能夠直接影響最終的結(jié)果，因此，要適當(dāng)注意流速問題，尤其是樣品過柱和溶劑洗脫時(shí)的流速。除此之外，還應(yīng)注意具體操作中出現(xiàn)的影響因素。

經(jīng)典的SPE方法包括以下五個(gè)步驟：萃取柱預(yù)處理；樣品過柱；萃取柱洗滌；萃取柱干燥和目標(biāo)物洗脫。這五個(gè)步驟中的每一步都可能影響方法的回收率和結(jié)果的重現(xiàn)性。

（1）萃取柱預(yù)處理。在這個(gè)步驟中，要選擇適當(dāng)?shù)娜軇?，以便有效地活化SPE柱。溶劑的用量不能過少，用量過少可能導(dǎo)致萃取柱未能充分活化。溶劑流速過快，會(huì)形成“溝壑效應(yīng)”，降低吸附劑與樣品接觸的表面積，導(dǎo)致吸附劑容量的明顯下降，進(jìn)而導(dǎo)致回收率降低。如果填料已經(jīng)形成了“溝壑效應(yīng)”，最好棄用。萃取環(huán)境的pH值和離子強(qiáng)度對(duì)目標(biāo)化合物從樣品基質(zhì)中轉(zhuǎn)移到萃取吸附劑上也十分重要。通常SPE柱預(yù)處理的pH值應(yīng)該與樣品的pH值相同。

（2）樣品過柱。在這一步驟中，最常見的問題是“柱穿透”，即目標(biāo)化合物沒有被SPE柱的填料保留，而是隨著樣品基質(zhì)一起流過SPE柱。這樣勢(shì)必造成回收率降低。造成柱穿透的因素主要有：樣品流速過快；萃取柱預(yù)處理?xiàng)l件不合適；加入不合適的溶劑（離子強(qiáng)度、有機(jī)強(qiáng)度等）；體積超載，保留弱的目標(biāo)化合物隨基質(zhì)流失；質(zhì)量超載，柱容量不夠（目標(biāo)化合物+基質(zhì)）；萃取填料不適合目標(biāo)化合物的保留。其中，樣品過柱的流速影響是最大的。過快的流速導(dǎo)致柱穿透。但樣品過柱的流速并非越慢越好，流速過慢可能會(huì)導(dǎo)致樣品基質(zhì)中的其他成分被保留，從而導(dǎo)致干擾物增加，回收率降低。

（3）萃取柱洗滌。在這個(gè)步驟中，容易出現(xiàn)目標(biāo)化合物流失的問題，造成這一問題的主要原因有兩個(gè)：目標(biāo)化合物在萃取柱上的保留不夠強(qiáng)，洗滌時(shí)，部分目標(biāo)化合物隨溶劑流出萃取柱；所選用的洗滌溶劑對(duì)目標(biāo)化合物的洗脫能力太強(qiáng)，在洗滌干擾物的同時(shí)，也洗脫了目標(biāo)化合物。

（4）萃取柱干燥。干燥的目的是去除殘留的水分和水溶性干擾物。但要注意，過分干燥可能造成目標(biāo)化合物的流失。

（5）目標(biāo)物洗脫。洗脫溶劑的洗脫強(qiáng)度應(yīng)該是以能夠完全破壞目標(biāo)化合物與填料之間的鍵合為基準(zhǔn)。這一步驟中，流速的控制也很重要，必須保證有足夠的時(shí)間讓洗脫溶劑與目標(biāo)化合物進(jìn)行作用，將目標(biāo)化合物從吸附劑的官能團(tuán)中釋放出來。要注意洗脫條件是否恰當(dāng)，例如pH值、極性、溶解度等。

4.3 污染問題

SPE柱的污染在很大程度上取決于目標(biāo)化合物的濃度范圍和所使用的檢測(cè)手段。SPE柱本身最常見的污染來源于萃取柱的聚乙烯針筒、聚乙烯隔片以及填料中的各種聚合物殘留和鄰苯二甲酸酯。這些干擾物可能干擾對(duì)目標(biāo)化合物的檢測(cè)，應(yīng)該對(duì)SPE柱進(jìn)行預(yù)清洗。

4.4 非萃取問題

當(dāng)回收率偏低時(shí)，要對(duì)包括樣品前處理在內(nèi)的每一步進(jìn)行分析，找出原因。在對(duì)萃取方法進(jìn)行檢查之前，首先要排除由于檢測(cè)方法或條件選擇的不正確引起的問題。其次要考慮的非萃取問題是濃縮蒸發(fā)，即目標(biāo)化合物在加熱條件下是否穩(wěn)定。如果目標(biāo)化合物在所溶解的溶劑中易揮發(fā)，可以降低濃縮溫度或加入沸點(diǎn)較高的溶劑。這些溶劑可以吸收熱量，防止低沸點(diǎn)化合物在濃縮蒸發(fā)過程中發(fā)生損失。

5 結(jié)論

本文綜述了固相萃取過程中的四類常見問題，在具體的操作過程中，應(yīng)注意避免這些干擾因素，發(fā)現(xiàn)問題，首先應(yīng)從這四方面考慮解決辦法。

(1)在流速方面，要注意隔片的孔徑大小和本身的親、疏水性；裝柱過程中萃取柱填料的松、密；外力是否穩(wěn)定；樣品本身的黏度和顆粒數(shù)量。

(2)在回收率方面，要注意選擇合適的溶劑及用量，避免“溝壑效應(yīng)”和“柱穿透”，避免出現(xiàn)目標(biāo)化合物流失，避免過分干燥，注意洗脫條件。

(3)在防污染方面，要注意對(duì)SPE柱進(jìn)行預(yù)清洗，杜絕污染源和聚合物殘留。

(4)其他方面，首先要排除檢測(cè)方法和條件選擇不當(dāng)?shù)膯栴}，其次要注意濃縮蒸發(fā)過程中發(fā)生損失。