鈣離子對亞麻籽膠-紫蘇分離蛋白負(fù)載DHA藻油乳液儲藏特性與遞送蝦青素效果的影響

孫夢嘉，全 雙，陳亞淑，陳洪建，彭登峰，鄧乾春

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部油料加工重點實驗室，油料脂質(zhì)化學(xué)與營養(yǎng)湖北省重點實驗室，武漢430062)

藻油是ω-3長鏈多不飽和脂肪酸(ω-3 LC-PUFA)DHA的重要來源，其不僅能夠促進(jìn)腦部發(fā)育，還有助于降低全身性疾病和慢性綜合征的風(fēng)險[1]。然而，DHA藻油的易氧化產(chǎn)生腥味和水溶性差等問題極大地限制了其在食品工業(yè)中的應(yīng)用。研究表明，使用蛋白質(zhì)-多糖制備雙層O/W乳液可通過在油滴表面形成致密且較厚的界面層，起到掩蓋或緩釋風(fēng)味物質(zhì)的作用[2]。紫蘇分離蛋白(PPI)作為一種油料作物來源的天然乳化劑，不僅可以提高食品的營養(yǎng)價值和感官品質(zhì)，而且對產(chǎn)品的食用和加工性能具有一定的改善作用[3]。亞麻籽膠(FG)作為一種天然多糖類物質(zhì)，表現(xiàn)出顯著的持水能力和流變特性，可作為增稠劑應(yīng)用于替代食品和非食品工業(yè)中[4]。此外，F(xiàn)G還可降低與糖尿病及心臟疾病相關(guān)疾病的風(fēng)險[5]。利用PPI與FG之間的靜電相互作用、氫鍵、疏水相互作用力等，采用逐層沉積技術(shù)(LBL)制備雙層乳液，可在一定程度上穩(wěn)定DHA藻油乳液，并掩蓋異味。然而PPI與FG穩(wěn)定的乳液體系仍然存在易分層和儲藏穩(wěn)定性不佳的問題，需要進(jìn)一步完善。鈣離子(Ca2+)可作為營養(yǎng)強(qiáng)化劑或微環(huán)境調(diào)節(jié)劑添加到液體食品中，其經(jīng)常被添加到乳液產(chǎn)品中以改善離子環(huán)境。同時，在多糖穩(wěn)定的乳液中添加Ca2+可以影響水溶液中多糖鏈的有序與無序狀態(tài)之間的平衡，從而影響乳液的流動一致性指數(shù)、穩(wěn)定性及消化特性[6]。目前已有研究將Ca2+作為交聯(lián)劑應(yīng)用于黃原膠及其他帶電荷的多糖中[7]。

若能實現(xiàn)乳液體系的穩(wěn)定調(diào)控，還可用來負(fù)載多種活性成分，以提升多營養(yǎng)組分的協(xié)同增效作用。蝦青素(AST)具有較強(qiáng)的抗氧化性，其單線態(tài)氧猝滅活性分別比β-胡蘿卜素與維生素E高40倍與1 000 倍[8]，但由于蝦青素的強(qiáng)疏水性與低口服生物利用度極大地限制了其在食品工業(yè)中的應(yīng)用，目前亟需研究設(shè)計不同口服遞送體系提高蝦青素的生物可及性。基于以上背景，本文采用高壓微射流技術(shù)與逐層沉積技術(shù)制備負(fù)載DHA藻油的FG-PPI雙層乳液，首先研究Ca2+添加量對FG-PPI包埋DHA藻油乳液儲藏穩(wěn)定性的影響，同時研究PPI-DHA藻油單層乳液、FG-PPI-DHA藻油雙層乳液、Ca2+-FG-PPI-DHA藻油雙層乳液中DHA的消化特性，以及上述3種乳液體系遞送蝦青素的效率，并監(jiān)測乳液粒徑、Zeta-電位、Turbiscan抗重力穩(wěn)定性指數(shù)(TSI)、微觀結(jié)構(gòu)、流變特性等以探究內(nèi)在機(jī)理，為相關(guān)富含ω-3 PUFA的雙層O/W乳液體系的構(gòu)建提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

DHA藻油，嘉必優(yōu)股份有限公司；亞麻籽，甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院；紫蘇分離蛋白(PPI，蛋白質(zhì)含量94.36%)，陜西瑞滋生物科技有限公司；蝦青素、黏蛋白、α-淀粉酶、胃蛋白酶、膽汁鹽、胰酶、脂肪酶，美國Sigma-Aldrich公司；氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)液；氯化鈣、磷酸二氫鉀、鹽酸、氫氧化鈉、尼羅紅等，均為分析純。

高速剪切均質(zhì)機(jī)，德國IKA公司；M-110E高壓微射流均質(zhì)機(jī)，美國MiFIC公司；Mastersizer 3000微米激光粒度儀、ZetaSizer Nano-ZS納米粒徑分析儀，英國馬爾文儀器公司；Turbiscan多重光散射儀，法國Formulaction公司；動態(tài)流變儀，美國TA儀器公司；激光共聚焦顯微鏡，日本尼康公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 亞麻籽膠(FG)的提取

稱取100 g亞麻籽，用去離子水洗滌除灰，再與900 mL去離子水混合，然后參考文獻(xiàn)[4]的方法，在60℃水浴中用磁力攪拌器以3 000 r/min的轉(zhuǎn)速攪拌2 h，再以4 500 r/min離心10 min，分離亞麻籽殼與不溶性雜質(zhì)，得到黏稠液體。將黏稠液體與95%乙醇按體積比1∶10混合，于4℃沉淀過夜，再于4℃、7 000 r/min條件下離心15 min，收集下層沉淀，冷凍干燥后研磨，得到FG粉末。

1.2.2 PPI-DHA藻油單層乳液的制備

采用5 mmol/L 磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7)配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的PPI溶液，于4℃攪拌過夜，使用前離心獲得上清液，作為乳化劑備用。分別將水相PPI溶液與油相DHA藻油以質(zhì)量比 9∶1 混合，使用高速剪切均質(zhì)機(jī)在10 000 r/min 轉(zhuǎn)速下分散 2 min 獲得粗乳液，再使用微射流均質(zhì)機(jī)在約69 MPa壓力下均質(zhì)循環(huán)4次，獲得PPI-DHA藻油單層乳液。

1.2.3 FG-PPI-DHA藻油雙層乳液的制備

按1.2.2的方法獲得PPI-DHA 藻油單層乳液，再使用 0.1 mol/L HCl 與1 mol/L HCl 將單層乳液的 pH 調(diào)至 5 后備用。采用5 mmol/L PBS (pH 5)配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.8%的FG溶液，使用磁力攪拌器在500 r/min下攪拌過夜備用。將單層乳液與FG溶液以質(zhì)量比1∶1混合，得到FG(質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.4%)-PPI-DHA藻油雙層乳液。

為了考察Ca2+對FG-PPI-DHA藻油雙層乳液的影響，對FG溶液配制過程稍作修改，在FG溶液中添加氯化鈣至Ca2+質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%，最終得到Ca2+質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的Ca2+-FG-PPI-DHA藻油雙層乳液。

1.2.4 乳液理化性質(zhì)的測定

1.2.4.1 流變學(xué)特性

根據(jù)Liu等[9]的方法使用動態(tài)流變儀對乳液進(jìn)行流變學(xué)特性的測定。測定條件：慣量夾具(20 mm的直徑，0°的平板)，溫度(25.0±0.1)℃。當(dāng)剪切速率從 0.01 s-1提高到 100 s-1時，測定溶液剪切黏彈性的儲能模量 (G′) 和損耗模量 (G″)，測量頻率范圍為0～200(°)/s。

1.2.4.2 粒徑及粒徑分布

以5 mmol/L PBS(pH 5)作為分散劑，使用微米激光粒度儀測定乳液的粒徑(D(4,3))及粒徑分布[10](油相DHA藻油的折射率為1.510，分散相水的折射率為1.330)。

1.2.4.3Zeta-電位

將乳液用5 mmol/L PBS(pH 5)以體積比1∶250的比例進(jìn)行稀釋，再使用納米粒徑分析儀測量乳液的Zeta-電位[11]。

1.2.4.4 Turbiscan抗重力穩(wěn)定性指數(shù) (TSI)

根據(jù)Raikos等[12]的方法，將乳液裝入特定的玻璃瓶中，使瓶身外部保持干凈、透光性良好，通過多重光散射儀測定乳液的TSI。該儀器通過掃描樣品的高度采集每次透射和反向散射數(shù)據(jù)，光源從上到下以 30 s 的間隔掃描一次樣品，在25℃下測量反射光與透射光的比率，最后使用Turbisoft 2.1軟件計算TSI以評估乳液的穩(wěn)定性。

1.2.5 負(fù)載蝦青素的DHA藻油乳液的制備及其體外模擬消化評價

1.2.5.1 乳液的制備

在油相 DHA 藻油中均添加0.5 mg/mL的蝦青素，分別按照1.2.2和1.2.3的方法制備負(fù)載蝦青素的PPI-DHA藻油單層乳液(簡記為SL)、FG-PPI-DHA藻油雙層乳液(簡記為DL)、Ca2+-FG-PPI-DHA藻油雙層乳液(簡記為CDL，Ca2+質(zhì)量分?jǐn)?shù)經(jīng)優(yōu)化獲得)。

1.2.5.2 體外模擬消化評價

參照文獻(xiàn)[13]的方法并稍作修改，對負(fù)載蝦青素的DHA 藻油乳液進(jìn)行體外模擬消化實驗(包括口腔、胃、小腸3個階段)。并在每一階段模擬消化完成后對樣品的粒徑及粒徑分布、Zeta-電位和激光共聚焦顯微鏡(CLSM)下的微觀形態(tài)進(jìn)行測定(將樣品用尼羅紅染色后在100倍油鏡下觀察并拍攝得到圖片)。

1.2.5.2.1 模擬口腔消化階段

按照Cheng等[14]的方法配制口腔模擬消化液(SSF)。取0.06 g黏蛋白于16 mL SSF中，攪拌均勻后于4℃冰箱中過夜，取出待恢復(fù)至室溫后，立刻與20 mL乳液(將樣品稀釋至油相含量為2.5%)混合均勻，再加入100 μL 0.3 mol/L氯化鈣溶液與2.875 μL去離子水，將混合溶液置于棕色具塞燒瓶中，于37℃恒溫空氣搖床以100 r/min的速率孵育2 min。

1.2.5.2.2 模擬胃消化階段

取2 g氯化鈉粉末和7 mL鹽酸于去離子水中溶解，并定容至1 L，得到胃模擬消化液(SGF)。將16 mL SGF與20 mL按1.2.5.2.1方法經(jīng)口腔消化后的溶液混合，用移液器加入1 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至3.0，并記錄 HCl 的使用量(以毫升計)，再加入1 mL胃蛋白酶液、10 μL 0.3 mol/L 氯化鈣溶液和去離子水 (加入量為2.99 mL-VHCl)，于37℃恒溫空氣搖床以100 r/min的速率孵育2 h。

1.2.5.2.3 模擬小腸消化階段

取3.5 g CaCl2·2H2O與32.87 g氯化鈉溶解于150 mL去離子水中，得到腸模擬消化液(SIF)。稱取0.187 5 g 膽汁鹽溶解于3.5 mL pH為7 的PBS中，制得膽汁鹽溶液，使用前恢復(fù)至室溫；另外將0.06 g脂肪酶溶解于2.5 mL pH為7的PBS中，攪拌均勻后立即使用。

取20 mL 按1.2.5.2.2方法經(jīng)胃消化后的溶液與8 mL SIF混合，加入5 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH 至7.0，并記錄NaOH的使用量(以毫升計)。隨后加入3 mL 膽汁鹽溶液、40 μL 氯化鈣溶液和去離子水(加入量為3.96 mL-VNaOH)。然后使用0.02 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至7.0，于37℃恒溫空氣搖床以100 r/min 的速率孵育2 h。孵育過程中，測定游離脂肪酸(FFA)釋放量。

1.2.6 FFA釋放量的測定

將樣品溶液用0.25 mol/L NaOH滴定至pH為 9.0。取30 mL混合溶液倒入消化杯中，開始滴定前立刻加入3 mL胰酶和2 mL脂肪酶溶液，磁力攪拌的同時使用0.15 mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液加入pH-stat 消化滴定儀開始滴定，記錄滴定至pH為7時所消耗的NaOH溶液的體積，滴定過程中自動調(diào)節(jié)溫度恒定在37℃。按式(1)計算FFA釋放量。

(1)

式中：Y1為FFA釋放量；V為消耗NaOH的體積，L；c為NaOH的濃度，mol/L；Mlipid為油脂的平均相對分子質(zhì)量，DHA 藻油為328；mlipid為消化液中油脂的質(zhì)量，g。

1.2.7 不同DHA 藻油乳液體系消化蝦青素生物可及性的測定

按照Salvia-Trujillo等[15]的方法并進(jìn)行了一些修改。將10 mL消化后的乳液在25℃下以716×g離心1 h，收集含有溶解在混合膠束中的蝦青素的上清液。在分析前，從膠束級分中丟棄未消化的上層油脂液體，得到含蝦青素的膠束級分。將5 mL未消化乳液或膠束級分與5 mL二氯甲烷-甲醇(體積比 2∶1)混合，在5℃下以137×g離心10 min，收集含蝦青素的底層，將頂層再次重復(fù)處理，合并含蝦青素的底層，用紫外分光光度計在480 nm處測量吸光度，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線方程(由蝦青素質(zhì)量濃度與吸光度繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得)計算樣品中蝦青素含量，再按式(2)計算蝦青素的生物可及性。

(2)

式中：Y2為蝦青素的生物可及性；CMicelle為膠束級分中蝦青素的含量；CRaw為原始乳液(未消化乳液)中蝦青素的含量。

1.2.8 數(shù)據(jù)分析

用Origin 8.5軟件繪制圖表，用SPSS 12.0 對數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析(p<0.05 時，表明具有顯著性差異)。所有實驗均做3個平行，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 Ca2+質(zhì)量分?jǐn)?shù)對FG-PPI-DHA藻油雙層乳液理化性質(zhì)的影響

單層乳液在制備后很快出現(xiàn)分層現(xiàn)象，而雙層乳液外觀未見明顯分層，因此探究Ca2+質(zhì)量分?jǐn)?shù)對FG-PPI-DHA藻油雙層乳液儲藏穩(wěn)定性的影響。

2.1.1 對流變學(xué)特性的影響

按1.2.4.1方法，測定不同Ca2+質(zhì)量分?jǐn)?shù)的FG-PPI-DHA藻油雙層乳液的流變學(xué)特性，結(jié)果見圖1。由圖1可見：相同Ca2+質(zhì)量分?jǐn)?shù)的雙層乳液的儲能模量(G′)均高于損耗模量(G″)，說明它們主要具有彈性行為特性；雙層乳液的黏彈性隨Ca2+質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加總體呈增大趨勢，這是由于隨著Ca2+質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，其與FG形成更加致密的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致FG的多糖分子之間纏結(jié)作用增強(qiáng)，流動阻力增大，使儲能模量比損耗模量增加趨勢更為顯著[16]。

圖1 Ca2+質(zhì)量分?jǐn)?shù)對FG-PPI-DHA藻油雙層乳液的流變學(xué)特性的影響

2.1.2 對儲藏穩(wěn)定性的影響

2.1.2.1 乳液儲藏前后的粒徑及粒徑分布

分別測定不同Ca2+質(zhì)量分?jǐn)?shù)的FG-PPI-DHA藻油雙層乳液儲藏0 d及20 d的粒徑及粒徑分布，結(jié)果見圖2。由圖2可見，儲藏0 d時，未添加Ca2+的雙層乳液粒徑較小，隨著Ca2+質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，乳液粒徑呈先增大后減小的趨勢，推測可能是因為低濃度Ca2+先與FG發(fā)生相互作用，導(dǎo)致蛋白質(zhì)-多糖復(fù)合物包覆的液滴發(fā)生聚集，從而使乳液粒徑增大，但當(dāng)Ca2+質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高時，乳液中的蛋白質(zhì)-多糖-Ca2+發(fā)生相互作用形成更加致密的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[16]，有效防止了液滴的聚集，因此粒徑減小，粒徑分布呈現(xiàn)更為均勻的趨勢。而儲藏20 d后，Ca2+質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0%～0.3%的雙層乳液粒徑顯著下降(未添加Ca2+的雙層乳液粒徑由儲藏0 d時的10.4 μm降至儲藏20 d時的4.3 μm)，而Ca2+質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4%～0.5%的雙層乳液粒徑幾乎保持不變，結(jié)合流變學(xué)特性測定結(jié)果，推測可能是由于Ca2+結(jié)合到FG的鏈狀結(jié)構(gòu)中，使其形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)從而降低液滴聚集造成的粒徑增大現(xiàn)象。

2.1.2.2 乳液儲藏前后的Zeta-電位及外觀形貌

分別測定不同Ca2+質(zhì)量分?jǐn)?shù)的FG-PPI-DHA藻油雙層乳液儲藏0 d及20 d的Zeta-電位，結(jié)果見圖3。

圖3 Ca2+質(zhì)量分?jǐn)?shù)對FG-PPI-DHA藻油雙層乳液儲藏0 d與20 d的Zeta-電位的影響

由圖3可見，在儲藏0 d時，Ca2+質(zhì)量分?jǐn)?shù)對FG-PPI-DHA藻油雙層乳液所帶電荷的影響較小，結(jié)合外觀形貌觀察結(jié)果，雙層乳液均處于較為穩(wěn)定的狀態(tài)，這是因為Ca2+能夠與FG分子發(fā)生交聯(lián)作用形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，這種網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)能夠?qū)⒍嗵欠肿觾?nèi)部結(jié)構(gòu)排列得更加緊密，從而降低乳液分散相的流動性，產(chǎn)生較高的黏度來穩(wěn)定乳液體系。儲藏20 d后，Ca2+質(zhì)量分?jǐn)?shù)的差異對乳液電位影響較小，且仍能夠觀察到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4%～0.5%的Ca2+雙層乳液體系所帶電荷變化較小，表明高黏度且致密的水相能夠有效提高乳液的穩(wěn)定性。

2.1.2.3 乳液儲藏前后的TSI

TSI是乳液對相分離抵抗力的定量度量，TSI 值越高，越不穩(wěn)定，越容易相分離[17]。測定不同Ca2+質(zhì)量分?jǐn)?shù)的FG-PPI-DHA藻油雙層乳液儲藏0 d及20 d的TSI，結(jié)果見圖4。

由圖4可見， Ca2+對FG-PPI-DHA藻油雙層乳液的TSI具有顯著影響，無論是儲藏0 d或儲藏20 d的雙層乳液，其TSI均受Ca2+質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響，高質(zhì)量分?jǐn)?shù)(0.4%～0.5%)的Ca2+雙層乳液在儲藏20 d后依舊保持相對較好的穩(wěn)定狀態(tài)。隨著Ca2+質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，雙層乳液的TSI值整體呈逐漸降低趨勢。這種現(xiàn)象可歸因于：①由于Ca2+先加入到FG溶液中，增大了水相的黏度，與單層乳液混合后從而阻礙了乳滴的運動，防止液滴聚集的同時提高其穩(wěn)定性；②Ca2+-FG-PPI形成結(jié)構(gòu)更為致密的界面膜降低了液滴與水相之間的密度比，進(jìn)一步提高了乳液的穩(wěn)定性。

綜合上述實驗結(jié)果，選擇Ca2+質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4%的雙層乳液進(jìn)行后續(xù)實驗。

2.2 負(fù)載蝦青素的DHA藻油乳液的消化特性

負(fù)載蝦青素的DHA藻油乳液經(jīng)口腔、胃和小腸各階段模擬消化后乳液體系的粒徑及粒徑分布、電荷特性的測定結(jié)果如圖5所示。

2.2.1 模擬口腔消化階段

由圖5可見，與初始相比，3種乳液經(jīng)口腔消化后其粒徑均有一定程度的增大，其中SL的粒徑升高至68.13 μm。SL粒徑增長的原因可能是黏蛋白是一種帶電的糖蛋白，能夠促使乳液產(chǎn)生微小聚集現(xiàn)象，從而導(dǎo)致乳液的粒徑略有增大[18]。DL經(jīng)口腔消化后，與初始相比其粒徑升高至81.67 μm，乳滴產(chǎn)生較大程度的絮凝；而CDL經(jīng)口腔消化后，與初始相比其粒徑升高至59.47 μm，乳滴發(fā)生一定程度的聚集，可能是Ca2+的添加能夠使PPI形成“鹽橋”，產(chǎn)生的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)更加有效地保護(hù)乳液，減輕黏蛋白及礦質(zhì)鹽離子的影響。CLSM的觀測結(jié)果顯示，經(jīng)口腔消化后，SL沒有發(fā)生明顯的絮凝或聚集現(xiàn)象，而與DL相比，CDL的粒徑增大程度較小，乳液內(nèi)部形態(tài)保持較為良好。

由圖5可見，3種乳液經(jīng)口腔消化后其所帶電荷絕對值均顯著降低，推測原因是吸附到乳滴的油-水界面的部分陽離子導(dǎo)致乳液所帶電荷下降。

2.2.2 模擬胃消化階段

由圖5可見，經(jīng)胃消化后，SL的粒徑顯著增加至103.33 μm。CLSM的觀測結(jié)果顯示，經(jīng)胃消化后，SL有絮凝現(xiàn)象存在，且油滴分布不均勻，這是因為在強(qiáng)酸(pH 3.0)條件下(低于PPI等電點)胃蛋白酶水解PPI可能降低了乳滴聚集的穩(wěn)定性[19]，因此乳滴大量聚集，導(dǎo)致粒徑增大。經(jīng)胃消化后，DL的粒徑增大至72.73 μm(與初始相比)，這是由于胃液中的高離子強(qiáng)度降低了表面液滴之間的靜電排斥力，且一些被蛋白質(zhì)包裹的液滴可能會被體系中存在的其他表面分子所取代，導(dǎo)致乳滴聚集程度增加[18]。CDL經(jīng)胃消化后，粒徑增大至37.7 μm(與初始相比)，與SL和DL相比其粒徑增大程度較低，這可能是因為胃消化過程中Ca2+與FG形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)在一定程度上能保護(hù)部分乳液不受強(qiáng)酸性胃液環(huán)境的影響，但還是有部分乳液中一些被蛋白質(zhì)包裹的液滴可能會被體系中存在的其他表面分子所取代[18]。CLSM微觀形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，CDL經(jīng)胃消化后乳滴粒徑有一定程度的增大(與初始比)，但聚集或絮凝現(xiàn)象不明顯。

由于胃模擬消化過程在強(qiáng)酸(pH 3.0)條件下進(jìn)行，游離氫離子能夠吸附在乳滴界面，因此3種乳液體系的電位均帶正電荷(如圖5所示)。

2.2.3 模擬小腸消化階段

由圖5可見，SL經(jīng)小腸消化后，粒徑增大至75.40 μm(與初始相比)。CLSM微觀形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)SL體系存在較大的絮凝體，推測小腸消化后由于膽汁鹽造成乳液絮凝消化不完全(樣品濃度較低，粒徑測定不準(zhǔn)確，導(dǎo)致微觀結(jié)構(gòu)未能拍攝到較大粒徑的乳滴[20])；另一部分原因可能是脂質(zhì)的消化及胰酶的作用引起的脂肪消化產(chǎn)物(如FFA，單?；视秃投；视?的置換而引起液滴聚集[21]，脂質(zhì)消化所產(chǎn)生的FFA也會影響乳滴的分布狀態(tài)[22]。DL和CDL經(jīng)小腸消化后，粒徑分別為 45.27、44.23 μm，CLSM微觀形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，這兩種雙層乳液中均無明顯絮凝現(xiàn)象，推測乳液中大部分油脂已被脂肪酶消化，在小腸消化后粒徑分布僅表示蛋白質(zhì)的聚集或絮凝現(xiàn)象。

由圖5可見：經(jīng)小腸消化后，SL表面所帶的負(fù)電荷量顯著降低(與初始相比)，原因可能是脂質(zhì)的消化及胰酶的作用引起的脂肪消化產(chǎn)物的置換而引起乳滴聚集，這與Xu等[21]的研究結(jié)果一致；雙層乳液表面所帶的負(fù)電荷量均有增加趨勢(與初始相比)，推測原因是小腸模擬消化液中膽汁鹽和脂肪酶會顯著降低蛋白質(zhì)吸附到界面的能力，部分取代蛋白質(zhì)分子，且由于pH由3升至7，隨著陰離子膽汁鹽吸附在液滴表面從而造成乳液表面負(fù)電荷量的增大，同時表面活性成分FFA等吸附在界面，同樣造成負(fù)電荷的增加[23]。

小腸消化階段，3種負(fù)載蝦青素的乳液FFA釋放量如圖6所示。

圖6 負(fù)載蝦青素的SL、DL、CDL的FFA釋放量

由圖6可見，在初始的20 min內(nèi)，3種乳液體系中FFA均被快速釋放，20 min后隨著消化時間的延長，雙層乳液相對恒定釋放FFA，單層乳液FFA釋放速率更快，但到達(dá)平衡狀態(tài)較慢。該現(xiàn)象表明乳液體系中存在FG會影響脂肪的消化，這與Boonlao 等[8]的研究結(jié)果一致，即添加多糖可能會通過限制膽汁鹽和脂肪酶在脂質(zhì)液滴表面有效反應(yīng)的途徑來抑制脂質(zhì)的消化過程。對于雙層乳液，添加Ca2+的雙層乳液體系FFA釋放量均略低于未添加Ca2+的雙層乳液體系。研究發(fā)現(xiàn)，Ca2+濃度較高可能會改變FFA的離子化狀態(tài)與非離子化狀態(tài)之間的平衡[16]。未添加Ca2+的雙層乳液液滴在消化后聚集程度較高，脂肪酶與DHA 藻油的接觸面積降低，因此其FFA釋放量略低于添加Ca2+的雙層乳液體系。

3種DHA藻油乳液經(jīng)小腸消化后，按1.2.7方法離心，3種乳液體系均出現(xiàn)中間相，且為光學(xué)透明的淡橙色溶液，說明蝦青素被溶解在混合膠束中。3種乳液消化后蝦青素的生物可及性見表1。由表1可見，在SL與DL中，蝦青素的生物可及性分別為47.42%和12.54%，這與Boonlao等[8]的研究結(jié)果一致，即在WPI和WPI-XG兩種乳液體系中蝦青素的釋放程度分別為46.2%和12.6%。在DL中蝦青素的生物可及性較低，可能是由于FG的存在限制了膽汁鹽和脂肪酶在脂質(zhì)液滴界面反應(yīng)的途徑，從而抑制了膠束的形成，蝦青素仍然保留在未消化的液滴中，導(dǎo)致其在水相中的溶解度降低[24]，另一方面可能是因為FG與釋放的蝦青素結(jié)合，形成致密結(jié)構(gòu)的復(fù)合物分子[25-26]。在CDL中蝦青素生物可及性為9.66%，推測該消化物中蝦青素的位置發(fā)生了變化(因為蝦青素極性較強(qiáng))，造成在脂質(zhì)消化過程中包埋的蝦青素應(yīng)該從油滴中釋放出來，并溶解在由膽汁鹽和FFA形成的混合膠束中，但由于Ca2+的存在，膠束傾向于聚集并最終形成較大的顆粒，以使其沉降到樣品底部，乳液中不溶性鈣鹽進(jìn)入到負(fù)載蝦青素的混合膠束中，導(dǎo)致其生物可及性降低。綜上所述，蝦青素的生物可及性對小腸中存在的鈣水平高度敏感，這在食品生產(chǎn)過程中具有重要的實際應(yīng)用價值。例如，攝入富含類胡蘿卜素的食物時其中富含的鈣可能會導(dǎo)致類胡蘿卜素的生物利用度下降，功能活性喪失等。

表1 3種乳液體系模擬消化后的蝦青素生物可及性

3 結(jié) 論

Ca2+對FG-PPI包埋DHA藻油乳液的粒徑及分布、電荷特性、流變特性、抗重力穩(wěn)定性指數(shù)與遞送蝦青素的效果均產(chǎn)生顯著影響。隨著Ca2+質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，F(xiàn)G-PPI-DHA藻油雙層乳液黏彈性總體呈現(xiàn)逐漸增大的趨勢，且乳液儲藏20 d后，Ca2+質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4%的雙層乳液體系粒徑無明顯變化，乳滴分布呈均勻的狀態(tài)，同時乳液表面電荷也未發(fā)生顯著變化，外觀呈現(xiàn)穩(wěn)定且均勻的狀態(tài)。添加Ca2+會在乳液消化過程中產(chǎn)生不溶性鈣鹽進(jìn)入到負(fù)載蝦青素的混合膠束中引起膠束沉淀，降低蝦青素生物可及性，可能會導(dǎo)致FFA釋放量下降，產(chǎn)生一定緩釋效果。研究結(jié)果可為ω-3 PUFA遞送體系的食品生產(chǎn)提供一定的參考價值，為設(shè)計多營養(yǎng)素遞送LC-PUFA與類胡蘿卜素體系的構(gòu)建提供理論基礎(chǔ)。