尿素包合法富集苦瓜籽油中α-桐酸的工藝優(yōu)化

帥曉艷，王惠玲，張 瑞，楊 寧，吳慕慈，葉樹芯，李玉保，何靜仁

(1.武漢輕工大學(xué) 硒科學(xué)與工程現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)學(xué)院，武漢 430023； 2.武漢輕工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，武漢 430023； 3.運(yùn)鴻集團(tuán)股份有限公司，湖北 武穴 435406)

苦瓜(MomordicacharantiaL，MC)，是葫蘆科(Cueurbitaeeae)苦瓜屬草本植物果實(shí)，作為一種藥食同源性瓜果，在我國(guó)已有上千年的栽培食用歷史，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值在所有葫蘆科植物中排名第一[1]，具有抗腫瘤、降低膽固醇等多種生物功效[2]。苦瓜籽仁中含有多糖、皂苷等生物活性成分，其蛋白質(zhì)含量高達(dá)39%～45%[3]?？喙献讶手泻写罅坑椭伎喙献芽傎|(zhì)量的25%以上[4]?？喙献延透缓曹梺喡樗?CLN)，尤其含有大量α-桐酸(CLN的一種)[5]。共軛亞麻酸是一組在C9,11,13位具有雙鍵的十八碳三烯酸的同分異構(gòu)體，其天然存在于極少數(shù)反芻動(dòng)物體內(nèi)和植物種子油中，且主要以甘油三酯的形式存在。近年來，許多研究表明共軛亞麻酸具有減肥[6]、抗癌[7]、抗糖尿病[8]和調(diào)節(jié)肝脂代謝[9]等多種生理功能?？喙献延妥鳛闉閿?shù)不多的富含α-桐酸的可食用植物油來源之一，具有良好的應(yīng)用開發(fā)價(jià)值。

當(dāng)前，對(duì)苦瓜及苦瓜籽中生物活性物質(zhì)的分離純化研究多集中于活性多肽、多糖和皂苷等成分，而對(duì)功能性脂肪酸分離方面的研究報(bào)道較少。脂肪酸分離純化方法主要包括蒸餾法、尿素包合法、低溫結(jié)晶法、高速逆流色譜法、脂肪酶輔助法、超臨界CO2萃取法、分子蒸餾法等[10]。與其他方法相比，尿素包合法操作簡(jiǎn)單，試驗(yàn)條件溫和，成本低且無污染。本試驗(yàn)以超臨界CO2萃取的苦瓜籽油為原料，采用皂化酸解法制得混合脂肪酸，再利用尿素包合法對(duì)α-桐酸進(jìn)行富集，分析富集前后的脂肪酸組成及含量，以期為苦瓜籽油的深度開發(fā)和綜合利用研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

苦瓜籽油(超臨界CO2萃取所得)，運(yùn)鴻集團(tuán)股份有限公司提供；氫氧化鉀、95%乙醇、石油醚(30～60℃)、鹽酸、無水硫酸鈉、尿素等，均為分析純；甲醇、正己烷，均為色譜級(jí)，美國(guó)Fisher公司；α-桐酸標(biāo)準(zhǔn)溶液(5 mg/mL)，上海甄準(zhǔn)生物公司。

PF-101T集熱式恒溫磁力攪拌器；R3旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，瑞士 Buchi 公司；YR-PTB真空泵；AL204電子分析天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；PCR-B-SF-10 超純水機(jī)；7890A-5975C氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)Agilent公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 苦瓜籽油理化指標(biāo)測(cè)定

相對(duì)密度，參照GB 5009.2—2016進(jìn)行測(cè)定；酸值，參照GB 5009.229—2016進(jìn)行測(cè)定；碘值，參照GB/T 5532—2008進(jìn)行測(cè)定；過氧化值，參照GB 5009.227—2016進(jìn)行測(cè)定；皂化值，參照GB/T 5534—2008進(jìn)行測(cè)定。

1.2.2 苦瓜籽油混合脂肪酸的制備

準(zhǔn)確稱取4 g左右苦瓜籽油于燒瓶中，加入0.5 mol/L氫氧化鉀乙醇溶液20 mL，于70℃下磁力攪拌回流1.5 h。冷卻至室溫，加入2 mL蒸餾水后用石油醚萃取3次，除去溶液中的不皂化物。底層溶液用2 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至2～3，用石油醚萃取3次后合并有機(jī)相，用無水硫酸鈉脫水，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去石油醚后得到苦瓜籽油混合脂肪酸。

1.2.3 尿素包合法富集α-桐酸

參照文獻(xiàn)[11-12]，尿素中加入一定量溶劑(95%甲醇或95%乙醇)，于75℃水浴下加熱回流并磁力攪拌至尿素溶解完全，然后加入一定量苦瓜籽油混合脂肪酸，在70℃水浴下加熱回流并磁力攪拌，直至溶液變?yōu)槌吻逋该骱?，室溫下冷卻，于一定溫度下包合一定時(shí)間。包合完成后減壓抽濾，濾液于40℃回收溶劑后加入2 mL蒸餾水并用2 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH為2～3，加石油醚萃取3次，合并有機(jī)相后用溫水洗至溶液呈中性，加入無水硫酸鈉進(jìn)行脫水，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收石油醚，即得較高含量的α-桐酸(產(chǎn)物)。產(chǎn)物收率為富集后α-桐酸質(zhì)量與混合脂肪酸質(zhì)量的比值。

1.2.4 脂肪酸組成的測(cè)定

參照GB 5009.168—2016，采用三氟化硼法對(duì)樣品進(jìn)行甲酯化，然后采用GC-MS測(cè)定脂肪酸組成。GC條件：HP-88色譜柱(100 m× 0.25 mm×0.20 μm)；載氣為99.999%高純氮?dú)?，恒流模式，柱流? mL/min；進(jìn)樣量1 μL，不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣口溫度250℃；升溫程序?yàn)?50℃保持0 min，以4℃/min升溫至190℃，保持5 min，再以2℃/min升溫至230℃，保持10 min。MS條件：離子化方式EI+，電子能量70 eV，接口溫度250℃，離子源溫度 200℃。

質(zhì)譜庫為NIST11.L。采用峰面積歸一化法對(duì)各脂肪酸進(jìn)行定量。

1.2.5α-桐酸純度的計(jì)算

先將1 mL 5 mg/mLα-桐酸標(biāo)準(zhǔn)品甲酯化。準(zhǔn)確吸取1 mLα-桐酸甲酯(α-桐酸質(zhì)量濃度2.5 mg/mL)于1 mL容量瓶中，作為α-桐酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。精密量取儲(chǔ)備液0.4、0.2、0.1、0.05、0.02 mL于1 mL容量瓶中，用正己烷定容，制得系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，經(jīng)GC-MS測(cè)定后，以峰面積(X)為橫坐標(biāo)，α-桐酸質(zhì)量濃度(Y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到α-桐酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=1.24×10-8X+0.166 5(R2=0.995 3)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程以及樣品甲酯化后經(jīng)GC-MS測(cè)定獲得的α-桐酸甲酯峰面積，按下式計(jì)算試樣的α-桐酸純度(Y0)。

(1)

式中：c為代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算所得α-桐酸質(zhì)量濃度，mg/mL；V為甲酯化稀釋體積，mL；m為甲酯化苦瓜籽油質(zhì)量，g。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用Origin 9.0 作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 苦瓜籽油的理化指標(biāo)(見表1)

表1 苦瓜籽油主要理化指標(biāo)

由表1可以看出，苦瓜籽油過氧化值相對(duì)較高，這與文獻(xiàn)[13-14]報(bào)道不一致，可能與苦瓜籽油放置時(shí)間、苦瓜種類、提取方法有關(guān)。另外，苦瓜籽油皂化值較低，可能是因?yàn)槠浜休^多的不皂化物。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 尿素包合溶劑種類對(duì)α-桐酸富集的影響

在混合脂肪酸與尿素質(zhì)量比1∶4、尿素與溶劑質(zhì)量比1∶4、包合溫度0℃、包合時(shí)間18 h條件下，考察溶劑(95%甲醇、95%乙醇)對(duì)α-桐酸富集效果的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 尿素包合溶劑種類對(duì)富集效果的影響

由圖1可以看出，95%甲醇、95%乙醇作為溶劑時(shí)，包合后得到的α-桐酸純度和產(chǎn)物收率差別不大，考慮到95%甲醇作溶劑可能會(huì)形成甲酯，甲酯具有一定的毒性[15]，影響α-桐酸后續(xù)在保健品等方面的應(yīng)用。因此，選擇95%乙醇作溶劑。

2.2.2 尿素與溶劑質(zhì)量比對(duì)α-桐酸富集的影響

在95%乙醇作溶劑、混合脂肪酸與尿素質(zhì)量比1∶4、包合溫度0℃、包合時(shí)間18 h條件下，考察尿素與乙醇質(zhì)量比對(duì)α-桐酸富集效果的影響，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可以看出，α-桐酸純度和產(chǎn)物收率隨著乙醇用量的增加均有較大幅度的提高，α-桐酸純度由29.67%提高到44.21%，產(chǎn)物收率由12.94%提高到26.92%。這是因?yàn)橐掖加昧康脑黾訒?huì)降低混合脂肪酸的濃度，尿素分子可以與脂肪酸充分接觸，單不飽和脂肪酸更容易被尿素包合。此外，受乙醇用量增加的影響，混合脂肪酸的黏度逐漸降低，進(jìn)一步減少了過濾過程中尿素包合晶體對(duì)多不飽和脂肪酸的吸附，從而使得濾液中α-桐酸的純度提高。在尿素與乙醇質(zhì)量比為1∶5時(shí)，尿素分子的包合能力即將達(dá)到極限，α-桐酸純度和產(chǎn)物收率增加都趨于平緩。因此，選擇尿素與乙醇質(zhì)量比為1∶5。

圖2 尿素與乙醇質(zhì)量比對(duì)富集效果的影響

2.2.3 混合脂肪酸與尿素質(zhì)量比對(duì)α-桐酸富集的影響

在95%乙醇作溶劑、尿素與乙醇質(zhì)量比1∶5、包合溫度0℃、包合時(shí)間18 h條件下，考察混合脂肪酸與尿素質(zhì)量比對(duì)α-桐酸富集效果的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 混合脂肪酸與尿素質(zhì)量比對(duì)富集效果的影響

由圖3可以看出：隨著混合脂肪酸與尿素質(zhì)量比的增加，α-桐酸的純度逐漸提高，由35.60%提高到50.20%；而產(chǎn)物收率隨混合脂肪酸與尿素質(zhì)量比的增加從22.66%降低到12.15%。這可能是因?yàn)楫?dāng)尿素用量較低時(shí)，各脂肪酸之間會(huì)相互競(jìng)爭(zhēng)，尿素?zé)o法將單不飽和脂肪酸、飽和脂肪酸完全包合，因此在濾液中殘留較多未被包合的單不飽和脂肪酸和飽和脂肪酸，使得α-桐酸的純度不高而產(chǎn)物收率較高。但是尿素包合脂肪酸的能力是一定的，尿素用量過多時(shí)，剩余的尿素就會(huì)與部分多不飽和脂肪酸進(jìn)行包合，從而導(dǎo)致產(chǎn)物收率降低。此外，多不飽和脂肪酸和尿素分子均具有較強(qiáng)的極性，彼此之間存在相互吸附作用，并能形成氫鍵，在過濾過程中部分多不飽和脂肪酸仍能被尿素吸附。因此，選擇混合脂肪酸與尿素質(zhì)量比為1∶4。

2.2.4 包合時(shí)間對(duì)α-桐酸富集的影響

在95%乙醇作溶劑、尿素與乙醇質(zhì)量比1∶5、混合脂肪酸與尿素質(zhì)量比1∶4、包合溫度0℃條件下，考察包合時(shí)間對(duì)α-桐酸富集效果的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 包合時(shí)間對(duì)富集效果的影響

由圖4可以看出，隨著包合時(shí)間的延長(zhǎng)，α-桐酸純度先增加后趨于平緩，同時(shí)產(chǎn)物收率隨著包合時(shí)間的延長(zhǎng)而減少。這可能是由于在較短的包合時(shí)間內(nèi)，尿素晶粒生長(zhǎng)受到影響，隨著包合時(shí)間的延長(zhǎng)，尿素與飽和脂肪酸和單不飽和脂肪酸的包合更加充分，從而使得α-桐酸純度逐漸提高。然而當(dāng)尿素的晶粒長(zhǎng)到一定限度時(shí)，繼續(xù)包合會(huì)導(dǎo)致尿素對(duì)多不飽和脂肪酸的包合，從而降低產(chǎn)物收率。因此，選擇包合時(shí)間為18 h。

2.2.5 包合溫度對(duì)α-桐酸富集的影響

在95%乙醇作溶劑、尿素與乙醇質(zhì)量比1∶5、混合脂肪酸與尿素質(zhì)量比1∶4、包合時(shí)間18 h條件下，考察包合溫度對(duì)α-桐酸富集效果的影響，結(jié)果如圖5所示。

圖5 包合溫度對(duì)富集效果的影響

由圖5可以看出：隨包合溫度的升高，α-桐酸純度呈下降趨勢(shì)，這是因?yàn)槟蛩匕线^程是一個(gè)放熱的過程，較低的溫度能夠促進(jìn)包合物生成，提高產(chǎn)物純度[16]；但是在包合溫度過低時(shí)，尿素與脂肪酸包合速率過快，反應(yīng)體系在未包合完全的情況下就已經(jīng)凝結(jié)，使得后期過濾困難，導(dǎo)致產(chǎn)物收率偏低，隨著包合溫度的升高，多不飽和脂肪酸在乙醇中的溶解度提高，使產(chǎn)物收率升高。然而包合溫度升高，脂肪酸與尿素的結(jié)合并不穩(wěn)固，包合物晶體之間分布較為松散，飽和脂肪酸和單不飽和脂肪酸很容易與尿素脫離，從而使α-桐酸純度下降。包合溫度為0℃時(shí)，α-桐酸純度和產(chǎn)物收率都較高。因此，選擇包合溫度為0℃。

2.3 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，固定95%乙醇作為尿素溶劑，尿素與乙醇質(zhì)量比1∶5，以混合脂肪酸與尿素質(zhì)量比、包合時(shí)間、包合溫度為因素，α-桐酸純度為指標(biāo)，設(shè)計(jì)三因素三水平的正交試驗(yàn)優(yōu)化α-桐酸富集工藝。正交試驗(yàn)因素水平見表2，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3。

表2 正交試驗(yàn)因素水平

表3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

由表3可以看出，各因素對(duì)α-桐酸富集的影響主次順序?yàn)锳>C>B，即混合脂肪酸與尿素質(zhì)量比的影響最大，其次是包合溫度、包合時(shí)間。最佳工藝組合為A1B3C3，即選擇95%乙醇為尿素溶劑，尿素與乙醇質(zhì)量比1∶5，混合脂肪酸與尿素質(zhì)量比1∶3，包合溫度4℃，包合時(shí)間24 h。在最佳條件下，α-桐酸純度為60.03%，產(chǎn)物收率為33.94%。

2.4 尿素包合前后脂肪酸組成(見表4)

由表4可知：苦瓜籽油中共檢出8種脂肪酸，與張飛等[14]的研究結(jié)果相似；飽和脂肪酸有3種，不飽和脂肪酸有5種，其中共軛亞麻酸包括α-桐酸及其兩種順反異構(gòu)體CLN-B、CLN-C，與文獻(xiàn)[14,17-18]所測(cè)的苦瓜籽油含有高不飽和脂肪酸結(jié)果相同。富集前苦瓜籽油中主要的脂肪酸是硬脂酸和α-桐酸，相對(duì)含量分別為37.64%、32.97%，富集后，硬脂酸相對(duì)含量減少至16.10%，而α-桐酸相對(duì)含量增加至53.94%，此時(shí)α-桐酸純度為60.03%，較苦瓜籽油中的28.83%顯著提高；共軛亞麻酸相對(duì)含量達(dá)到71.28%，比富集前增加了19.65百分點(diǎn)。因此，尿素包合法可用于富集苦瓜籽油中的α-桐酸。

表4 α-桐酸富集前后脂肪酸組成及相對(duì)含量 %

3 結(jié) 論

以超臨界CO2萃取的苦瓜籽油為原料，采用尿素包合法富集苦瓜籽油中的α-桐酸。通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，確定最佳富集工藝條件為：以95%乙醇為尿素溶劑，苦瓜籽油混合脂肪酸與尿素質(zhì)量比1∶3，尿素與乙醇質(zhì)量比1∶5，包合溫度4℃，包合時(shí)間24 h。在最佳條件下，α-桐酸純度為60.03%，產(chǎn)物收率為33.94%，α-桐酸相對(duì)含量為53.94%，共軛亞麻酸相對(duì)含量達(dá)到71.28%。