酶促油酸與棕櫚硬脂反應(yīng)制備OPO工藝條件優(yōu)化

雷祎晨，祝振杰，肖亞浩，徐夢(mèng)琪，張林尚，畢艷蘭

(河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院，鄭州 450001)

1,3-二油酸-2-棕櫚酸甘油三酯(β-OPO，常被簡(jiǎn)寫(xiě)為“OPO”)的結(jié)構(gòu)與人乳脂相似，對(duì)嬰兒有多種有益作用，如平衡腸道健康、促進(jìn)脂肪酸和鈣吸收、提升骨骼密度等[1-4]。2008年，《中華人民共和國(guó)食品衛(wèi)生法》和《食品添加劑衛(wèi)生管理辦法》批準(zhǔn)了OPO作為營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑可用于嬰幼兒配方食品的生產(chǎn)。采用不同原料合成OPO的研究報(bào)道很多。其中，棕櫚硬脂與高純度油酸是制備OPO的理想原料[5]。采用酶法催化合成OPO，其優(yōu)點(diǎn)是反應(yīng)條件溫和，對(duì)環(huán)境友好，產(chǎn)品安全，并且脂肪酶很容易從產(chǎn)物中分離出來(lái)[6-8]。

酶法合成OPO的方法可以分為酯化法和酯交換法。酯化法通常需要兩步完成：先將sn-2位富含棕櫚酸的油脂和乙醇進(jìn)行醇解反應(yīng)得到sn-2位富含棕櫚酸的甘一酯；再將甘一酯與油酸在sn-1,3位專一性脂肪酶的催化下酯化合成OPO。Liu等[9]以PPP和油酸為原料，采用脂肪酶Candidasp. 99-125催化酯化法制備了OPO，OPO產(chǎn)率達(dá)到85.06%，sn-2位棕櫚酸含量達(dá)到80.17%。此方法合成OPO的純度較高，但是工藝較復(fù)雜，并且中間產(chǎn)物sn-2位棕櫚酸甘一酯需分離純化，增加了生產(chǎn)成本。酯交換法可分為酸解法和轉(zhuǎn)酯法。酸解法多采用sn-2位富含棕櫚酸的油脂和油酸為底物，在sn-1,3位專一性脂肪酶的作用下進(jìn)行反應(yīng)，此方法可制備出純度高且副產(chǎn)物少的產(chǎn)品。Wang等[10]以棕櫚硬脂與油酸(純度85%)和亞油酸(純度65%)為原料采用脂肪酶NS40086催化酸解法制備富含OPO和OPL的甘三酯，得到OPO和OPL聯(lián)合收率為69.26%的產(chǎn)品，sn-2位棕櫚酸的相對(duì)含量達(dá)到71.07%。轉(zhuǎn)酯法為兩種甘三酯或甘三酯與簡(jiǎn)單?；ブg發(fā)生?；粨Q反應(yīng)，此方法相比于酸解法而言利用率低，并且產(chǎn)物分離較困難，研究相對(duì)較少。綜合比較，酸解法制備OPO為最經(jīng)濟(jì)有效的方法。

在酶法催化制備OPO反應(yīng)過(guò)程中同時(shí)伴隨著副反應(yīng)，包括甘三酯水解生成甘二酯、甘一酯、脂肪酸，以及OPO發(fā)生?；w移轉(zhuǎn)化成POO等[11]。因此，GB 30604—2015《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑1,3-二油酸-2-棕櫚酸甘油三酯》理化指標(biāo)中明確規(guī)定了OPO含量(≥40%)、三棕櫚酸甘油酯(PPP)含量(<10%)和sn-2位棕櫚酸占所有棕櫚酸的含量(≥52%)。

酶法合成OPO的主要成本來(lái)源之一是脂肪酶，脂肪酶昂貴的價(jià)格是生產(chǎn)OPO產(chǎn)品必須考慮的問(wèn)題，脂肪酶的可重復(fù)利用次數(shù)越多，其生產(chǎn)成本就越低。因此，研究脂肪酶的可重復(fù)利用性具有重要意義。本研究旨在優(yōu)化Novozym 40086酶催化油酸與棕櫚硬脂制備OPO的工藝條件，特別是在加酶量的選擇上考慮脂肪酶的可重復(fù)利用次數(shù)，以期為工業(yè)應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

油酸(純度77.58%)，阿拉丁試劑(上海)有限公司；棕櫚硬脂(熔點(diǎn)62℃，酸值(KOH)0.34 mg/g，過(guò)氧化值4.40 mmol/kg，水分及揮發(fā)物含量0.20%)，豐益(上海)生物技術(shù)研發(fā)有限公司；Novozym 40086酶(sn-1,3位專一性脂肪酶，來(lái)源于米赫根毛酶，載體為樹(shù)脂，酶活為275 IUN/g)，丹麥諾維信公司。正己烷，色譜純；甲醇、乙醚、鹽酸、無(wú)水硫酸鈉，均為分析純；薄層層析硅膠，化學(xué)純；豬胰脂酶，自制。

Agilent 7890B、8860氣相色譜儀，美國(guó)安捷倫科技有限公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器；BSA224S分析天平(0.000 1 g)；TDL-80-2B離心機(jī)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 OPO的制備

稱取油酸與棕櫚硬脂共25 g于圓底燒瓶中，在油浴磁力攪拌(400 r/min)下混合互溶后，加入一定量的Novozym 40086酶開(kāi)始反應(yīng)，一定時(shí)間后停止反應(yīng)，離心除去脂肪酶得到反應(yīng)產(chǎn)物。

1.2.2 OPO含量和PPP含量的測(cè)定

參考宗蕾等[12]的方法測(cè)定OPO含量和PPP含量。取70 mg反應(yīng)產(chǎn)物溶于1 mL正己烷中，加入無(wú)水硫酸鈉除水后，采用氣相色譜儀分析其甘三酯組成，采用峰面積歸一化法計(jì)算OPO和PPP占總甘三酯的相對(duì)含量。

氣相色譜條件：Agilent 7890B氣相色譜儀；DB-1ht色譜柱(30.0 m×250 μm×0.1 μm)；載氣為高純氮?dú)?，流? mL/min；進(jìn)樣口溫度350℃；升溫程序?yàn)槌跏紲囟?00℃，以50℃/min升至300℃，保持5 min，以20℃/min升至360℃，保持15 min；氫火焰離子化檢測(cè)器溫度350℃；分流比20∶1；進(jìn)樣量1 μL。

1.2.3 sn-2位棕櫚酸占所有棕櫚酸含量的測(cè)定

1.2.3.1 總脂肪酸組成的測(cè)定

先采用薄層色譜法將反應(yīng)產(chǎn)物中的甘三酯分離出來(lái)，然后參考GB 5009.168—2016，對(duì)甘三酯進(jìn)行甲酯化處理，采用氣相色譜分析樣品的脂肪酸組成，采用峰面積歸一化法定量，計(jì)算得到總棕櫚酸含量。

氣相色譜條件：Agilent 8860氣相色譜儀；SGE BPX-70色譜柱(30.0 m×250 μm×0.25 μm)；載氣為高純氮?dú)?，流? mL/min；進(jìn)樣口溫度250℃；升溫程序?yàn)槌跏紲囟?70℃，以2℃/min升至210℃；氫火焰離子化檢測(cè)器溫度300℃；分流比20∶1；進(jìn)樣量1 μL。

1.2.3.2 sn-2位脂肪酸組成的測(cè)定

先采用薄層色譜法將反應(yīng)產(chǎn)物中的甘三酯分離出來(lái)，采用正己烷和甲醇萃取后，參考GB/T 24894—2010測(cè)定樣品的sn-2位脂肪酸組成。先將樣品進(jìn)行豬胰脂酶水解處理，然后離心，取上清水解液點(diǎn)板，用展開(kāi)劑(正己烷-乙醚-甲酸，體積比70∶30∶1)展開(kāi)，展開(kāi)完全后，取出晾干，用2′,7′-二氯熒光素顯色，刮下甘一酯條帶，甲酯化后進(jìn)行氣相色譜分析。氣相色譜條件同1.2.3.1。采用峰面積歸一化法定量，得到sn-2位棕櫚酸含量。

sn-2位棕櫚酸占所有棕櫚酸含量(w)按式(1)計(jì)算。

w=c1/(3×c2)×100%

(1)

式中：c1、c2分別為sn-2位棕櫚酸含量和總棕櫚酸含量。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)平行重復(fù)兩次，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示。采用SPSS軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(Duncan檢驗(yàn))，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 棕櫚硬脂的主要組成(見(jiàn)表1)

表1 棕櫚硬脂的主要組成

由表1可見(jiàn)，棕櫚硬脂中OPO含量為10.69%，PPP含量為58.40%，sn-2位棕櫚酸占所有棕櫚酸的含量為32.53%，與OPO的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)相比，需要提高OPO含量、降低PPP含量、提高sn-2位棕櫚酸占所有棕櫚酸含量。

2.2 酶法催化制備OPO單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 加酶量的影響

脂肪酶是催化酯交換反應(yīng)制備OPO的重要催化劑，加酶量影響反應(yīng)效率和生產(chǎn)成本。在油酸與棕櫚硬脂摩爾比8∶1，加酶量分別為4%、6%、8%、10%、12%(以底物總質(zhì)量計(jì))，反應(yīng)溫度60℃條件下制備OPO，反應(yīng)過(guò)程中每隔1 h取樣分析產(chǎn)物中OPO及PPP含量變化情況，結(jié)果如圖1及圖2所示。

由圖1可知，在相同的加酶量下，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，OPO含量逐漸增加。根據(jù)GB 30604—2015規(guī)定，OPO含量需大于或等于40%。加酶量為4%反應(yīng)5 h時(shí)，OPO含量為(40.53±0.13)%，而反應(yīng)10 h時(shí)才達(dá)到平衡；隨著加酶量的增加，反應(yīng)速度加快，加酶量為6%、8%、10%和12%時(shí)，OPO含量達(dá)到平衡的時(shí)間分別為6、4、3 h和3 h，平衡時(shí)OPO含量分別為(47.02±0.08)%、(46.11±0.24)%、(46.66±0.69)%和(47.58±0.08)%，均符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。這說(shuō)明較低的加酶量會(huì)降低反應(yīng)效率，提高酶用量會(huì)加快反應(yīng)效率，與Zheng等[13]的研究結(jié)果一致。

注：圖中不同的小寫(xiě)字母代表反應(yīng)時(shí)間對(duì)指標(biāo)的影響有顯著性差異(P<0.05)。下同

圖2 加酶量對(duì)PPP含量的影響

由圖2可知，在相同的加酶量下，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，PPP含量逐漸減少。根據(jù)GB 30604—2015規(guī)定，PPP含量需低于10%。加酶量為4%反應(yīng)7 h時(shí)達(dá)到平衡，PPP含量為(7.22±0.03)%。加酶量為6%反應(yīng)5 h時(shí)達(dá)到平衡，PPP含量為(6.21±0.19)%。加酶量為8%、10%和12%時(shí)，反應(yīng)速度加快，PPP含量達(dá)到平衡的時(shí)間均為3 h，平衡時(shí)PPP含量分別為(6.75±0.11)%、(5.98±0.20)%和(5.89±0.12)%，均符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。

分析了OPO和PPP含量滿足要求的樣品中的sn-2位脂肪酸組成情況，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 不同反應(yīng)時(shí)間下加酶量對(duì)sn-2位棕櫚酸占所有棕櫚酸含量的影響

由圖3可知：加酶量為4%和6%時(shí)，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，sn-2位棕櫚酸占所有棕櫚酸含量呈現(xiàn)先增加后穩(wěn)定的趨勢(shì)；而加酶量為8%、10%和12%時(shí)，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，sn-2位棕櫚酸占所有棕櫚酸含量呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)，說(shuō)明延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間促進(jìn)了酰基遷移的發(fā)生。另外，隨著加酶量的增加，sn-2位棕櫚酸占所有棕櫚酸含量達(dá)到平衡的時(shí)間縮短。

根據(jù)GB 30604—2015規(guī)定，sn-2位棕櫚酸占所有棕櫚酸含量需大于或等于52%，從圖3可看出，所測(cè)試樣品的結(jié)果均符合要求。加酶量為4%反應(yīng)10 h達(dá)到平衡時(shí)，sn-2位棕櫚酸占所有棕櫚酸含量為(69.08±1.90)%；加酶量為6%、8%、10%和12%時(shí)，sn-2位棕櫚酸占所有棕櫚酸含量達(dá)到平衡的反應(yīng)時(shí)間分別為5、4、3 h和3 h，此時(shí)sn-2位棕櫚酸占所有棕櫚酸含量分別為(69.17±1.00)%、(71.87±0.59)%、(76.41±0.37)%和(77.90±0.18)%。可見(jiàn)較高的加酶量可縮短反應(yīng)達(dá)到平衡的時(shí)間，從而降低?；w移的速率。

加酶量10%和12%相比，制備的產(chǎn)品組成(OPO含量分別為(46.66±0.69)%和(47.58±0.08)%、PPP含量分別為(5.98±0.20)%和(5.89±0.12)%、sn-2位棕櫚酸占所有棕櫚酸含量分別為(76.41±0.37)%和(77.90±0.18)%)相似，且反應(yīng)達(dá)到平衡的時(shí)間一致。因此，從生產(chǎn)成本方面考慮，加酶量12%不適合作為優(yōu)選的條件。

選擇4%、6%、8%和10%的加酶量，考察脂肪酶重復(fù)利用情況(按1.2.1方法每批反應(yīng)結(jié)束后，離心分離出脂肪酶，在室溫下干燥后在下一批次中使用)，結(jié)果見(jiàn)表2。

由表2可知：加酶量4%反應(yīng)10 h脂肪酶可重復(fù)利用3次，即制備3批次合格的產(chǎn)品共需30 h；加酶量6%反應(yīng)6 h脂肪酶可重復(fù)利用6次，共36 h；加酶量8%反應(yīng)4 h脂肪酶可重復(fù)利用7次，共28 h；加酶量10%反應(yīng)3 h脂肪酶可重復(fù)利用8次，共24 h。

從生產(chǎn)成本考慮選擇適宜加酶量：假設(shè)工廠一次反應(yīng)投料1 t(油酸和棕櫚硬脂總質(zhì)量)，1 t反應(yīng)底物可生產(chǎn)0.22 t OPO產(chǎn)品(產(chǎn)品收率是實(shí)驗(yàn)室測(cè)定換算而得)。因原料成本相同，只計(jì)算酶的成本。假設(shè)工廠一年生產(chǎn)300 d，每天生產(chǎn)12 h，則一年共生產(chǎn)3 600 h，加酶量4%、6%、8%、10%在一年內(nèi)需要添加脂肪酶的次數(shù)則分別為120、100、129次和150次。由于生產(chǎn)時(shí)間相同(一年)，在不考慮水、電及工人工資的情況下，假設(shè)工廠用Novozym 40086酶的價(jià)格A元/kg，則每生產(chǎn)1 t OPO產(chǎn)品，加酶量4%、6%、8%、10%時(shí)酶的成本核算(酶成本=(脂肪酶添加次數(shù)×一次投料量1 000×加酶量×酶的價(jià)格)/(脂肪酶添加次數(shù)×酶重復(fù)利用次數(shù)×0.22))分別為60.61A、45.45A、51.95A、56.82A元，加酶量4%、8%、10%時(shí)酶的生產(chǎn)成本分別是加酶量為6%時(shí)的1.33、1.14、1.25倍。說(shuō)明加酶量為6%的綜合生產(chǎn)成本最低，8%、10%次之，成本最高的是4%。該研究結(jié)果與Wei[14]、李世磊[15]、Zou[16]等研究結(jié)果有所不同，主要是因?yàn)檫@些研究均只考慮縮短反應(yīng)時(shí)間，沒(méi)有全面考慮脂肪酶重復(fù)利用次數(shù)，特別是不同添加量下脂肪酶的重復(fù)利用次數(shù)差異很大所致。綜合考慮，選擇加酶量為6%。

2.2.2 底物摩爾比的影響

在油酸與棕櫚硬脂摩爾比分別為4∶1、6∶1、8∶1、10∶1、12∶1，加酶量6%，反應(yīng)溫度60℃條件下，制備OPO，反應(yīng)過(guò)程中每隔1 h取樣分析產(chǎn)物中OPO含量、PPP含量及sn-2位棕櫚酸占所有棕櫚酸含量(對(duì)于OPO和PPP含量滿足國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的才分析sn-2位棕櫚酸占所有棕櫚酸含量，下同)變化情況，結(jié)果分別如圖4～圖6所示。

圖4 底物摩爾比對(duì)OPO含量的影響

圖5 底物摩爾比對(duì)PPP含量的影響

圖6 底物摩爾比對(duì)sn-2位棕櫚酸占所有

由圖4可知：在相同的底物摩爾比下，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，OPO含量逐漸增加，底物摩爾比分別為4∶1、6∶1、8∶1和12∶1時(shí)，OPO含量均在5 h時(shí)達(dá)到平衡，此時(shí)OPO含量分別為(41.65±0.17)%、(44.87±0.07)%、(46.93±0.15)%和(49.46±0.07)%；底物摩爾比10∶1反應(yīng)4 h時(shí)達(dá)到平衡，此時(shí)OPO含量為(47.15±0.78)%。在相同反應(yīng)時(shí)間下，隨著底物摩爾比的增加，OPO含量增加。這是因?yàn)槊复脔ソ粨Q反應(yīng)為可逆反應(yīng)，較高的底物摩爾比有利于平衡向正反應(yīng)方向移動(dòng)。

由圖5可知：在相同的底物摩爾比下，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，PPP含量逐漸減少；隨著底物摩爾比的增加，PPP含量達(dá)到平衡的時(shí)間縮短。底物摩爾比為4∶1和6∶1時(shí)，PPP含量均在5 h達(dá)到平衡，且含量分別為(8.81±0.07)%和(6.95±0.25)%；底物摩爾比為8∶1、10∶1和12∶1時(shí)，PPP含量達(dá)到平衡的時(shí)間分別為3、2 h和3 h，其含量分別為(7.40±0.34)%、(8.94±1.33)%和(6.26±0.15)%。這說(shuō)明較高的底物摩爾比增加了酶與底物之間的反應(yīng)效率，有利于PPP轉(zhuǎn)化為OPO，然而過(guò)高的底物摩爾比會(huì)增加油酸的含量從而增加生產(chǎn)成本。

由圖6可知：在相同的底物摩爾比下，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，sn-2位棕櫚酸占所有棕櫚酸含量逐漸增加，這一結(jié)果與Nagachinta等[17]研究結(jié)果類似；在底物摩爾比為4∶1、6∶1、8∶1、10∶1和12∶1時(shí)，sn-2位棕櫚酸占所有棕櫚酸含量均在5 h達(dá)到平衡，平衡時(shí)sn-2位棕櫚酸占所有棕櫚酸含量分別為(56.61±0.89)%、(62.13±0.53)%、(66.07±1.40)%、(69.95±1.10)%和(72.55±0.82)%?？紤]到較低的底物摩爾比可節(jié)省生產(chǎn)成本，選擇底物摩爾比為6∶1。

2.2.3 反應(yīng)溫度的影響

在油酸與棕櫚硬脂摩爾比6∶1，加酶量6%條件下，分別在50、60、70℃下制備OPO，反應(yīng)過(guò)程中每隔1 h取樣分析OPO含量、PPP含量及sn-2位棕櫚酸占所有棕櫚酸含量的變化情況，結(jié)果分別如圖7～圖9所示。

圖7 反應(yīng)溫度對(duì)OPO含量的影響

圖8 反應(yīng)溫度對(duì)PPP含量的影響

圖9 反應(yīng)溫度對(duì)sn-2位棕櫚酸占所有棕櫚酸含量的影響

由圖7可知：在相同的反應(yīng)溫度下，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，OPO含量逐漸增加；當(dāng)反應(yīng)溫度為50℃時(shí)，反應(yīng)9 h達(dá)到平衡，其產(chǎn)物中OPO含量為(45.06±0.06)%；反應(yīng)溫度為60℃時(shí)，反應(yīng)5 h達(dá)到平衡，其產(chǎn)物中OPO含量為(44.63±0.28)%；反應(yīng)溫度為70℃時(shí)，OPO含量先迅速增加再降低后緩慢增加，在7 h時(shí)達(dá)到平衡，此時(shí)OPO含量為(44.45±0.19)%?？赡苁禽^低的反應(yīng)溫度不利于提高脂肪酶的催化活性，而較高的溫度破壞酶的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致其不可逆失活，從而導(dǎo)致OPO含量降低[18]。該研究結(jié)果與Wang等[19]的研究結(jié)果相似。

由圖8可知：在相同的反應(yīng)溫度下，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，PPP含量逐漸減少；反應(yīng)溫度50、60、70℃達(dá)到平衡的時(shí)間分別為6、3、7 h，平衡時(shí)PPP含量分別為(7.46±0.07)%、(8.23±0.20)%和(6.99±0.15)%，均符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)要求。

由圖9可知，在相同的反應(yīng)溫度下，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，sn-2位棕櫚酸占所有棕櫚酸含量逐漸增加，反應(yīng)溫度50、60℃和70℃時(shí)反應(yīng)達(dá)到平衡的時(shí)間分別為9、5 h和6 h，平衡時(shí)sn-2位棕櫚酸占所有棕櫚酸含量分別為(64.72±0.38)%、(63.42±0.22)%和(63.02±0.48)%，均符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)要求。隨著反應(yīng)溫度的提高，sn-2位棕櫚酸占所有棕櫚酸含量增加的幅度變緩，說(shuō)明較高的反應(yīng)溫度會(huì)增加?；w移的速率。綜合考慮，選擇反應(yīng)溫度為60℃。

2.3 酶法催化制備OPO響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，固定反應(yīng)溫度為60℃，采用Design Expert 8軟件進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面設(shè)計(jì)，以加酶量(A)、反應(yīng)時(shí)間(B)、底物摩爾比(C)為因素，以O(shè)PO含量(Y1)、PPP含量(Y2)和sn-2位棕櫚酸占所有棕櫚酸含量(Y3)為響應(yīng)值，對(duì)工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素及水平如表3所示，響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表4所示。

表3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素及水平

表4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

采用Design Expert 8軟件對(duì)表4中的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到二次多項(xiàng)回歸方程Y1=-22.51+8.59A+7.14B+3.69C-0.23AB+0.02AC+0.01BC-0.48A2-0.48B2-0.23C2，Y2=51.34-5.64A-5.15B-2.71C+0.25AB+0.07AC+0.04BC+0.26A2+0.28B2+0.12C2，Y3=-9.03+8.77A+9.77B+0.84C-0.26AB+0.25AC+0.29BC-0.55A2-0.82B2-0.14C2。

對(duì)回歸方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果分別如表5、表6、表7所示。

表5 OPO含量的方差分析

由表5可知，OPO含量模型極顯著(P<0.000 1)，失擬項(xiàng)不顯著(P>0.05)，說(shuō)明模型可信，可以預(yù)測(cè)OPO的含量。單因素對(duì)OPO含量的影響順序?yàn)榧用噶?底物摩爾比>反應(yīng)時(shí)間。

表6 PPP含量的方差分析

由表6可知，PPP含量模型極顯著(P<0.000 1)，失擬項(xiàng)不顯著(P>0.05)，說(shuō)明模型可信，可以預(yù)測(cè)PPP含量。其中加酶量和反應(yīng)時(shí)間的交互作用對(duì)PPP含量影響極顯著，單因素對(duì)PPP含量的影響順序?yàn)榧用噶?底物摩爾比>反應(yīng)時(shí)間。

表7 sn-2位棕櫚酸占所有棕櫚酸含量的方差分析

由表7可知，sn-2位棕櫚酸占所有棕櫚酸含量模型極顯著(P<0.000 1)，失擬項(xiàng)不顯著(P>0.05)，說(shuō)明模型可信，可以預(yù)測(cè)sn-2位棕櫚酸占所有棕櫚酸含量。其中加酶量和底物摩爾比的交互作用對(duì)sn-2位棕櫚酸占所有棕櫚酸含量影響顯著，單因素對(duì)sn-2位棕櫚酸占所有棕櫚酸含量的影響順序?yàn)榧用噶?底物摩爾比>反應(yīng)時(shí)間。

利用Design Expert 8軟件，綜合考慮3個(gè)指標(biāo)對(duì)制備OPO的最佳工藝條件進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果為加酶量6.3%(以總底物質(zhì)量計(jì))、油酸與棕櫚硬脂摩爾比5.7∶1、反應(yīng)時(shí)間5.2 h、反應(yīng)溫度60℃。在最佳反應(yīng)條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表8。

表8 實(shí)驗(yàn)預(yù)測(cè)值與實(shí)際值比較

由表8可知，在最佳反應(yīng)條件下，產(chǎn)品中OPO含量為43.13%，PPP含量為7.65%，sn-2位棕櫚酸占所有棕櫚酸含量為61.28%，與預(yù)測(cè)值接近，表明響應(yīng)面的分析結(jié)果可靠。

3 結(jié) 論

本研究采用Novozym 40086酶催化油酸與棕櫚硬脂反應(yīng)制備OPO，并在加酶量的選擇上考慮了酶的重復(fù)利用次數(shù)和酶的成本。通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，得到最佳工藝條件為加酶量6.3%(以總底物質(zhì)量計(jì))，油酸與棕櫚硬脂摩爾比5.7∶1、反應(yīng)時(shí)間5.2 h、反應(yīng)溫度60℃。在最佳條件下，制備的產(chǎn)品中OPO含量為43.13%，PPP含量為7.65%，sn-2 位棕櫚酸占所有棕櫚酸含量為61.28%，產(chǎn)品符合GB 30604—2015要求。