基于核桃油的中長鏈甘油三酯的酶法制備及純化

鄒孝強(qiáng)，高 盼，徐林海，張四紅，何東平

(1.江南大學(xué) 食品學(xué)院，國家功能食品工程技術(shù)研究中心，糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122； 2.武漢輕工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，大宗糧油精深加工教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430023)

中長鏈甘油三酯(MLCT)是一類在甘油骨架上同時包含中鏈脂肪酸(MCFA)和長鏈脂肪酸(LCFA)的結(jié)構(gòu)脂。MLCT作為一種特殊的功能性油脂，一方面利用中鏈脂肪酸提供即時能量[1-2]，另一方面利用長鏈脂肪酸提供營養(yǎng)[3-4]。因此，反應(yīng)基料油的脂肪酸組成對于MLCT的營養(yǎng)價值具有重要意義。但是，目前大部分研究主要關(guān)注MLCT的功能性，忽略其營養(yǎng)性，缺乏對MLCT生產(chǎn)的基料油的篩選。就脂肪酸組成而言，核桃油作為一種重要的木本油脂，不飽和脂肪酸含量高達(dá)90%以上，亞油酸含量為51.2%～68.9%，α-亞麻酸含量為6.82%～15.01%，其ω-6/ω-3脂肪酸比例在世界衛(wèi)生組織推薦攝入的比例范圍之內(nèi)(5∶1～10∶1)，是補(bǔ)充ω-6和ω-3脂肪酸的良好油脂來源[5]。因此，以核桃油為基料油生產(chǎn)MLCT對于提升其營養(yǎng)價值具有重要意義。

目前，文獻(xiàn)報(bào)道合成MLCT的方法主要有酯交換法[6-7]、酸解法[8-9]等。其中，采用中鏈甘油三酯(MCT)與食用油脂直接進(jìn)行反應(yīng)獲得MLCT的酯交換法，因其工藝過程簡單易行，被廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中。但是，該方法制備的產(chǎn)物中含有一定量的MCT和長鏈甘油三酯(LCT)，MLCT含量相對較低。MCT消化及吸收速率過快，容易在小腸管腔造成較高的滲透壓，大量食用可能會造成腹瀉、嘔吐、腹脹等腸胃不適癥狀[10]。因此，在合成MLCT反應(yīng)后需要通過一定方法脫除體系中的MCT。

本研究利用脂肪酶催化MCT與核桃油進(jìn)行酯交換反應(yīng)，將核桃油轉(zhuǎn)化為富含亞油酸與亞麻酸的MLCT，通過分子蒸餾脫除游離脂肪酸后，利用MCT與MLCT、LCT極性的差異，采用乙醇萃取酯交換產(chǎn)物中的MCT，降低產(chǎn)物中MCT的含量，從而獲得高M(jìn)LCT含量的產(chǎn)品。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

核桃油，重慶市九重山實(shí)業(yè)有限公司提供，脂肪酸組成與分布如表1所示；辛癸酸甘油三酯(MCT)，浙江建德千島化工有限公司，脂肪酸組成與分布如表2所示；脂肪酶NS40086(酶活275 IUN/g)、Novozym 435(酶活10 000 PLU/g)、Lipozyme RM IM(酶活275 IUN/g)，諾維信(中國) 投資有限公司；Supelco 37種脂肪酸甲酯混標(biāo)，Sigma-Aldrich(上海)貿(mào)易有限公司；TLC硅膠板60G(10 cm×20 cm)，煙臺江友硅膠有限公司；色譜純正己烷、乙腈、異丙醇、甲醇、1 mol/L烯丙基溴化鎂溶液，百靈威科技有限公司(上海)；濃鹽酸、冰醋酸、硼酸，分析純。

表1 核桃油的脂肪酸組成與分布 %

表2 MCT的脂肪酸組成與分布 %

GC-14B氣相色譜儀，日本島津公司；Waters高效液相色譜儀，美國Waters公司；JJ-1B強(qiáng)力恒速攪拌器；GT16-3高速臺式離心機(jī)；AR2140電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋；DL-180A超聲波清洗儀；R-501低壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器；定時恒溫磁力攪拌反應(yīng)器；KDL1短程分子蒸餾設(shè)備，德國UIC公司；MixPlus 旋渦振蕩器。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 MLCT的制備

將MCT與核桃油以一定摩爾比混合，向其中加入一定量(以底物質(zhì)量計(jì))的脂肪酶，充氮，并在一定溫度下，轉(zhuǎn)速600 r/min的條件下反應(yīng)一定時間，得到反應(yīng)產(chǎn)物。

1.2.2 分子蒸餾脫除游離脂肪酸

采用分子蒸餾除去反應(yīng)體系中的游離脂肪酸。分子蒸餾條件：蒸發(fā)器溫度185℃，冷凝器溫度40℃，換熱器溫度60℃，旋轉(zhuǎn)刮膜速率120 r/min，進(jìn)料速度2 mL/min，絕對壓力2 Pa。蒸發(fā)器的加熱源來自于夾套中循環(huán)的加熱硅油。

1.2.3 乙醇萃取純化MLCT

向分子蒸餾重相中添加一定量的乙醇溶液，充分?jǐn)嚢琛⒄袷幉㈦x心，取出油相，采用低壓蒸餾脫除乙醇，獲得脫除MCT的結(jié)構(gòu)脂產(chǎn)品。

1.2.4 反相高效液相色譜分析結(jié)構(gòu)脂TAG組成

采用配備有蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)的反相高效液相色譜分析結(jié)構(gòu)脂TAG組成。分析條件：ELSD溫度55℃，氮?dú)?霧化氣)流速1.8 mL/min，增益1；Lichrospher C18色譜柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)；流動相為乙腈和異丙醇，流速0.8 mL/min，洗脫程序?yàn)?0 min內(nèi)將乙腈從70%降至60%，再在10 min內(nèi)將乙腈降至55%，保持20 min，最后在5 min內(nèi)將其升高至70%；進(jìn)樣質(zhì)量濃度20 mg/mL，進(jìn)樣量10 μL。

1.2.5 脂肪酸組成分析

采用配備火焰離子化檢測器的GC-14B氣相色譜儀分析脂肪酸組成。氣相色譜條件：PEG-20M熔融石英毛細(xì)管柱(30 m×0.32 mm×0.5 μm)；柱升溫程序?yàn)槌鯗?00℃，保留4 min，以15℃/min升溫至180℃，保留4 min，再以4℃/min升溫至215℃；進(jìn)樣口溫度及檢測器溫度均為250℃。

1.2.6 TLC薄板分離TAG

從反應(yīng)體系中取出50 μL樣品，采用TLC薄板分離純化得到TAG，展開劑為正己烷-乙醚-乙酸(體積比80∶20∶1)。分離結(jié)束后，在薄板上均勻噴灑0.2%的2,7-二氯熒光素的甲醇溶液并進(jìn)行紫外顯色。將TAG條帶刮下，并用2 mL乙醚萃取兩次，用無水硫酸鈉干燥，并用氮?dú)獯祾叱ヒ颐选＜尤?0 μL 2 mol/L甲醇?xì)溲趸浫芤杭柞セ磻?yīng)3 min，再用2 mL正己烷萃取脂肪酸甲酯兩次，用無水硫酸鈉干燥，最后使用氮?dú)鉂饪s，進(jìn)氣相色譜儀按1.2.5方法進(jìn)行脂肪酸組成分析。

1.2.7 sn-2脂肪酸組成分析

將30 mg樣品溶解于10 mL乙醚中，添加0.3 mL烯丙基溴化鎂，劇烈攪拌1 min后，加入8 mL酸緩沖液(0.27 mol/L HCl溶于 0.4 mol/L硼酸)終止反應(yīng)[11]。除去水相，將乙醚萃取液用硼酸洗滌兩次，并用無水硫酸鈉干燥。采用氮?dú)鈱⒁颐严酀饪s至150 μL，以氯仿-丙酮(體積比90∶10)為展開劑，在硼酸浸漬的TLC板上分離。將sn-2 MAG條帶刮下，并用2 mL乙醚萃取兩次。用無水硫酸鈉干燥，并采用氮?dú)鉂饪s，最后按1.2.6方法對殘余物進(jìn)行甲酯化后，進(jìn)氣相色譜按1.2.5方法分析脂肪酸組成。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 酶催化酯交換反應(yīng)條件的優(yōu)化

2.1.1 脂肪酶種類的影響

脂肪酶作為催化劑影響酯交換反應(yīng)的因素主要有兩個：一是酶的活力，二是酶的選擇性。脂肪酶的活力影響酯交換反應(yīng)的速率，即達(dá)到反應(yīng)平衡所需的時間，酶的選擇性影響反應(yīng)產(chǎn)物的組成。在加酶量8%、反應(yīng)時間9 h、MCT與核桃油摩爾比1∶1、反應(yīng)溫度55℃條件下，選擇3種常用的商業(yè)性脂肪酶Novozym 435、NS40086、Lipozyme RM IM研究脂肪酶種類對酯交換反應(yīng)的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 脂肪酶種類對酯交換反應(yīng)產(chǎn)物組成的影響

由圖1可以看出，相對于其他兩種脂肪酶，Novozym 435催化的反應(yīng)產(chǎn)物中MLCT的含量最高，達(dá)到65.4%，同時反應(yīng)產(chǎn)物中所含的LCT及MCT含量也最低。原因可能是，一方面Novozym 435對于此反應(yīng)體系的活力較高，另一方面Novozym 435是一種非位置選擇性脂肪酶，在反應(yīng)過程中可以作用于TAG的3個位置，因此TAG 3個位置上的脂肪酸均參與反應(yīng)，從而可獲得較高的MLCT含量；而NS40086和 Lipozyme RM IM為sn-1,3位選擇性脂肪酶，反應(yīng)過程中僅作用于TAG的sn-1,3位脂肪酸，從而導(dǎo)致產(chǎn)物中MLCT含量相對較低，而LCT和MCT含量相對較高。因此，選擇Novozym 435作為催化用酶。

2.1.2 MCT與核桃油摩爾比的影響

在反應(yīng)過程中LCT既是反應(yīng)原料，也是反應(yīng)產(chǎn)物，因此反應(yīng)產(chǎn)物中不可避免有一定含量的LCT。但是，根據(jù)酯交換反應(yīng)脂肪酸平衡分布理論可推測，越高的MCT與核桃油摩爾比，有利于反應(yīng)向生成MLCT方向進(jìn)行，且最終產(chǎn)物中LCT含量越低；而過量的MCT可通過一定濃度乙醇進(jìn)行分離。因此，考慮高M(jìn)CT與核桃油摩爾比進(jìn)行反應(yīng)，同時采用MLCT/(MLCT+LCT)值作為反應(yīng)優(yōu)化的一個指標(biāo)。在加酶量8%、反應(yīng)溫度55℃條件下，研究MCT與核桃油摩爾比對酯交換反應(yīng)的影響，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可以看出，MCT與核桃油摩爾比越高反應(yīng)產(chǎn)物中MCT含量越高，而LCT含量越低。但對于MLCT而言，當(dāng)反應(yīng)時間短于3 h，產(chǎn)物中MLCT的含量隨著MCT與核桃油摩爾比的升高而升高，但當(dāng)反應(yīng)時間超過3 h，MCT與核桃油摩爾比為2∶1的反應(yīng)產(chǎn)物中MLCT的含量最高，直到反應(yīng)達(dá)到平衡。原因可能是反應(yīng)產(chǎn)物中MLCT含量是以反應(yīng)產(chǎn)物中總TAG含量為基數(shù)進(jìn)行計(jì)算的，反應(yīng)物中MCT含量越高，反應(yīng)產(chǎn)物中剩余的MCT含量也越高，影響體系中MLCT含量。通過比較MLCT/(MLCT+LCT)值發(fā)現(xiàn)，MCT與核桃油摩爾比越高，反應(yīng)產(chǎn)物中MLCT/(MLCT+LCT)值越高。原因是越高的MCT與核桃油摩爾比，參與反應(yīng)的MCT含量也越高，反應(yīng)達(dá)到平衡后，LCT含量也越低，最終MLCT/(MLCT+LCT)值越高。但是，由圖2可知，當(dāng)MCT與核桃油摩爾比由1∶1增加至2∶1時，MLCT/(MLCT+LCT)值增加較快，但當(dāng)MCT與核桃油摩爾比大于2∶1時，MLCT/(MLCT+LCT)值增加速率較慢。因此，選擇MCT與核桃油摩爾比為2∶1。

2.1.3 加酶量的影響

在MCT與核桃油摩爾比2∶1、反應(yīng)溫度55℃條件下，研究加酶量對酯交換反應(yīng)的影響，結(jié)果如圖3所示。

由圖3可以看出，隨著加酶量的增加，在不同反應(yīng)時間下，反應(yīng)體系中MCT含量和LCT含量逐漸降低，MLCT含量逐漸升高。但是，當(dāng)加酶量由6%增加至10%時，MLCT的增加量較高，而LCT降低量也較高，當(dāng)加酶量由10%增加至12%時，兩者變化幅度不大。不同加酶量下不同時間點(diǎn)MLCT/(MLCT+LCT)值與MLCT和LCT的變化類似，當(dāng)加酶量由6%增加至10%時，MLCT/(MLCT+LCT)值增加較快，而當(dāng)加酶量由10%增加至12%時，MLCT/(MLCT+LCT)值變化不大。因此，選擇加酶量為10%。

2.1.4 反應(yīng)溫度的影響

本反應(yīng)體系中，由于MCT與核桃油的極性差異影響了兩種油脂的相容性，而較高的溫度能夠增加MCT與核桃油的相容性，從而提高反應(yīng)效率。另外，溫度影響酶的活力，合適的反應(yīng)溫度下，酶具有較好的活力，但較高的反應(yīng)溫度將會導(dǎo)致酶不可逆失活。在MCT與核桃油摩爾比2∶1、加酶量10%條件下，研究反應(yīng)溫度對酯交換反應(yīng)的影響，結(jié)果如圖4所示。

由圖4可以看出，隨著反應(yīng)溫度的升高，在不同反應(yīng)時間下，體系中MCT含量與LCT含量不斷降低，而MLCT含量不斷增加。但是，當(dāng)反應(yīng)溫度由35℃升高至55℃時，體系中MCT、LCT降低量以及MLCT的增加量均較高，當(dāng)溫度由55℃升高至65℃時，體系中MCT、LCT降低量以及MLCT的增加量均較低。不同反應(yīng)溫度下不同反應(yīng)時間點(diǎn)MLCT/(MLCT+LCT)值與MLCT含量的變化類似，當(dāng)反應(yīng)溫度由35℃升高至55℃時，MLCT/(MLCT+LCT)值增加量較高，而當(dāng)反應(yīng)溫度由55℃升高至65℃時，MLCT/(MLCT+LCT)值變化不大。因此，選擇反應(yīng)溫度為55℃。

通過單因素實(shí)驗(yàn)，得到Novozym 435酶催化MCT與核桃油酯交換制備MLCT的優(yōu)化條件：加酶量10%，MCT與核桃油摩爾比2∶1，反應(yīng)溫度55℃，反應(yīng)時間9 h。在優(yōu)化條件下反應(yīng)并通過分子蒸餾脫除游離脂肪酸后，所得產(chǎn)品中MLCT含量為76.2%，MCT含量為14.3%，LCT含量為9.5%。

2.2 乙醇萃取條件的優(yōu)化

2.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響

由于MCT中脂肪酸碳鏈較短，極性相對較高，易溶于乙醇，但LCT中脂肪酸碳鏈較長，難溶于乙醇，因此可用乙醇作為LCT與MCT的分離溶劑。為改變產(chǎn)物中MCT、MLCT以及LCT在萃取溶液中的分布比例，以獲得最高含量的MLCT以及最高的產(chǎn)品得率，實(shí)驗(yàn)通過向乙醇中添加不同比例的水來改變其極性。因此，以萃取產(chǎn)物中MLCT含量及產(chǎn)品得率為指標(biāo)進(jìn)行優(yōu)化。在底物(分子蒸餾重相，下同)與乙醇溶液比例1∶1條件下，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)對萃取效果的影響，結(jié)果如圖5所示。

圖5 乙醇體積分?jǐn)?shù)對萃取效果的影響

由圖5可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的降低，產(chǎn)品得率逐漸升高，而MLCT含量先增高后降低。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為85%時，MCT溶解量最高，有利于產(chǎn)物中MCT的脫除，最終使萃取產(chǎn)物中MLCT含量最大。因此，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)為85%。

2.2.2 底物與乙醇溶液比例的影響

乙醇溶液用量會影響萃取過程中各種成分在溶液中的含量，從而影響產(chǎn)品得率及萃取產(chǎn)物中MLCT含量。在乙醇體積分?jǐn)?shù)85%的條件下，研究底物與乙醇溶液比例對萃取效果的影響，結(jié)果如圖6所示。

由圖6可知，隨著乙醇溶液用量的增加，產(chǎn)品得率逐漸減小，而萃取產(chǎn)物中MLCT含量逐漸增加。當(dāng)?shù)孜锱c乙醇溶液比例由1∶1增加至1∶3時，萃取產(chǎn)物中MLCT含量由83.1%增加至85.4%，但是當(dāng)?shù)孜锱c乙醇溶液比例由1∶3增加至1∶9時，萃取產(chǎn)物中MLCT含量變化較小，但是產(chǎn)品得率降低幅度較大。因此，為獲得相對較高的MLCT含量以及較高的產(chǎn)品得率，選擇底物與乙醇溶液比例為1∶3。

圖6 底物與乙醇溶液比例對萃取效果的影響

經(jīng)過乙醇萃取，所得結(jié)構(gòu)脂產(chǎn)品中MLCT含量為85.4%，MCT含量為3.7%，LCT含量為10.8%，產(chǎn)品得率為80.8%。

結(jié)構(gòu)脂產(chǎn)品的脂肪酸組成及分布如表3所示。

表3 產(chǎn)品的脂肪酸組成及分布 %

由表3可知，產(chǎn)品中C18∶2與C18∶3的比值為5.8，在世界衛(wèi)生組織推薦攝入的比例范圍之內(nèi)，中鏈脂肪酸含量為49.4%，對于消化缺陷患者而言，可提升脂肪的消化吸收效率，同時，產(chǎn)品中sn-2位C18∶2和C18∶3的總含量達(dá)到39.7%，有利于人體對兩種必需脂肪酸的吸收和利用。

3 結(jié) 論

本研究利用脂肪酶催化MCT與核桃油的酯交換反應(yīng)，利用分子蒸餾脫除產(chǎn)物中的游離脂肪酸，再用乙醇萃取獲得高M(jìn)LCT含量的結(jié)構(gòu)脂產(chǎn)品。結(jié)果表明：最佳酶催化酯交換反應(yīng)條件為以Novozym 435為催化用酶，加酶量10%、MCT與核桃油摩爾比2∶1、反應(yīng)溫度55℃、反應(yīng)時間9 h，在此條件下反應(yīng)并通過分子蒸餾脫除游離脂肪酸后，所得產(chǎn)物中MLCT含量為76.2%，MCT含量為14.3%，LCT含量為9.5%。最佳乙醇萃取條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)85%、底物與乙醇溶液比例1∶3，在此條件下所得結(jié)構(gòu)脂產(chǎn)品中MLCT含量為85.4%，MCT含量為3.7%，LCT含量為10.8%，產(chǎn)品得率為80.8%。本產(chǎn)品MLCT含量高，富含亞油酸與亞麻酸，且兩種脂肪酸的含量比值為5.8，比例合理，可作為消化系統(tǒng)缺陷患者補(bǔ)充必需脂肪酸的油脂來源。