漢麻籽抗氧化肽的制備與氨基酸序列分析

魏連會(huì)，董 艷，石 杰，宋淑敏，孫興榮

(1.黑龍江省科學(xué)院 大慶分院，黑龍江 大慶 163319； 2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 大慶分院，黑龍江 大慶 163316)

活性氧(ROS)參與人體生理代謝過(guò)程并起著至關(guān)重要的作用，在正常情況下，多余的ROS能夠通過(guò)生物體內(nèi)的抗氧化酶和非酶因子被有效消除[1]。ROS過(guò)多可導(dǎo)致許多疾病，如糖尿病、冠心病、癌癥、肝病和炎癥性疾病[2]。此外，ROS介導(dǎo)的脂質(zhì)、蛋白質(zhì)氧化會(huì)導(dǎo)致食物變酸，產(chǎn)生異味，并在食物中產(chǎn)生潛在的毒性[3]。因此，開(kāi)發(fā)有效的抗氧化劑，對(duì)于食品加工和保鮮工業(yè)非常重要。目前，一些合成抗氧化劑具有很強(qiáng)的抗氧化性，并且已經(jīng)廣泛用于醫(yī)藥和食品工業(yè)。但是合成抗氧化劑具有副作用，如肝損害和致癌，影響其應(yīng)用[4]。因此，開(kāi)發(fā)天然抗氧化劑替代合成抗氧化劑具有重要的意義。飲食中的抗氧化成分包括維生素、類(lèi)胡蘿卜素、類(lèi)黃酮、酚和多肽等[5]，其中功能活性肽具有生物活性高、毒性低的特點(diǎn)，可開(kāi)發(fā)為天然抗氧化劑[6]。

食物源抗氧化肽在其氨基酸序列中無(wú)活性親本蛋白，具有2～20個(gè)氨基酸殘基，易于吸收并且沒(méi)有有害的免疫反應(yīng)，可以發(fā)揮其作為自由基清除劑、過(guò)氧化物活性分解劑、金屬滅活劑和氧氣抑制劑的作用，保護(hù)食品和生物免受ROS的侵害[7]。研究表明，植物蛋白來(lái)源的多肽如大豆蛋白肽[8]、鷹嘴豆多肽[9]、米糠多肽[10]、玉米多肽[11]、核桃仁多肽[12]具有很強(qiáng)的抗氧化作用，可以用于功能性食品。

漢麻(CannabissativaL.)也稱(chēng)工業(yè)大麻、火麻、漢麻、線(xiàn)麻、黃麻等，是一種一年生草本植物，隸屬于大麻科，在中國(guó)和加拿大地區(qū)廣泛種植[13]。漢麻為無(wú)毒品種，四氫大麻酚含量低于0.3%。漢麻籽具有很好的藥用價(jià)值和食用價(jià)值，其藥用功效在2000年版的《藥典》和2001年“藥食同源”名單中均有記載[14]。漢麻籽脂肪含量為35%～50%，蛋白質(zhì)含量為20%～40%。漢麻籽蛋白營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，致敏性低，易消化，氨基酸種類(lèi)齊全，組成均衡，必需氨基酸含量可以與酪蛋白和大豆蛋白相媲美，且精氨酸和谷氨酸含量豐富，是一種極具開(kāi)發(fā)價(jià)值的優(yōu)質(zhì)蛋白[15]。目前關(guān)于漢麻籽多肽的制備工藝與降血糖、降血脂、抗氧化作用研究已有大量的報(bào)道[13,16-18]，而關(guān)于漢麻籽抗氧化肽組成分析和結(jié)構(gòu)鑒定的研究較少，因此本研究以漢麻籽粕為原料制備漢麻籽抗氧化肽，并對(duì)其進(jìn)行組成分析和結(jié)構(gòu)鑒定，以期為漢麻籽多肽在功能食品中的應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

漢麻籽粕，實(shí)驗(yàn)室采用超臨界技術(shù)由漢麻籽提取油脂后制得；木瓜蛋白酶(酶活力為 8×105U/g)、中性蛋白酶(酶活力為 1.3×105U/g)，無(wú)錫雪梅酶制劑有限公司；其他試劑均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

MALDI-TOF基質(zhì)輔助激光解析飛行時(shí)間質(zhì)譜儀，AB SCIEX公司；Pellicon 切向流超濾系統(tǒng)， Millipore公司；FD-2A-80型真空冷凍干燥機(jī)，上海繼譜電子科技有限公司；UV-5100B紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司； Q Exactive組合型四極桿 Orbitrap質(zhì)譜儀、Easy-nLC 1000納升級(jí)液相色譜，賽默飛世爾公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 漢麻籽多肽的制備與分離純化

以漢麻籽粕為原料制備漢麻籽多肽。按質(zhì)量比1∶5將漢麻籽粕加入蒸餾水溶解，然后調(diào)整溶液pH為5.0，溫度為70℃，加入漢麻籽粕質(zhì)量3.0%的中性蛋白酶、0.4%的木瓜蛋白酶，酶解3 h。95℃水浴滅酶活10 min，以10 000 r/min離心15 min，取上清液，備用。采用不同截留分子質(zhì)量超濾膜(1、3、5 kDa)對(duì)上清液進(jìn)行分離，超濾條件為溫度25℃、壓力0.15 MPa、轉(zhuǎn)速125 r/min。收集各個(gè)組分的多肽液冷凍干燥，計(jì)算各組分所占比例。

1.2.2 抗氧化活性測(cè)定

1.2.2.1 DPPH自由基清除率的測(cè)定

根據(jù)You等[19]的方法測(cè)定DPPH自由基清除率，略作修改。冷凍干燥的漢麻籽多肽樣品用蒸餾水溶解得到質(zhì)量濃度分別為0.1、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0 mg/mL的溶液。取100 μL漢麻籽多肽溶液，與100 μL 0.1 mmol/L 的DPPH 溶液充分混勻后，在37℃水浴中反應(yīng)1.5 h，測(cè)定在517 nm 處的吸光度?？瞻捉M為100 μL乙醇溶液和100 μL一定質(zhì)量濃度的漢麻籽多肽溶液，對(duì)照組為100 μL乙醇溶液和100 μL DPPH 溶液。DPPH自由基清除率(E)按式(1)計(jì)算。

(1)

式中：A1為漢麻籽多肽溶液吸光度；A2為空白組吸光度；A3為對(duì)照組吸光度。

1.2.2.2 總還原力的測(cè)定

參照Oyaizu[20]的方法測(cè)定總還原力，略作修改。反應(yīng)管中依次加入0.1、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0 mg/mL的漢麻籽多肽溶液1.0 mL，2.5 mL 0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH 6.6)和2.5 mL 10 mg/mL 鐵氰化鉀溶液，充分混合后，于50℃的水浴中充分反應(yīng)20 min，以3 000 r/min離心10 min，取2.5 mL上清液與0.1 mL 1 mg/mL FeCl3混合，測(cè)定在700 nm處的吸光度,以吸光度的大小表示總還原力的強(qiáng)弱。

1.2.3 漢麻籽抗氧化肽分子質(zhì)量分布的測(cè)定

采用MALDI-TOF 基質(zhì)輔助激光解析飛行時(shí)間質(zhì)譜儀對(duì)漢麻籽抗氧化肽的分子質(zhì)量分布進(jìn)行測(cè)定[21]。取質(zhì)量濃度為1 mg/mL的漢麻籽多肽溶液1 μL，點(diǎn)至樣品靶位上，自然干燥后，再取1 μL CHCA基質(zhì)溶液點(diǎn)至對(duì)應(yīng)靶位上并自然干燥，用相同方法在樣品靶位相鄰靶位上點(diǎn)校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)品 (4700 Proteomics Analyzer Calibration Mixture 1)。采用校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)品 Calibration Mixture 1進(jìn)行外標(biāo)一級(jí)校準(zhǔn)，質(zhì)量誤差小于 0.5 Da。圖譜采集條件：一級(jí)質(zhì)譜(MS)范圍(m/z)100～5 000，每張譜圖累加 500個(gè) Laser Shots。

1.2.4 漢麻籽抗氧化肽的氨基酸序列分析

參照文獻(xiàn)[21]方法，采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)對(duì)漢麻籽抗氧化肽的氨基酸序列進(jìn)行分析，采用ESI質(zhì)譜鑒定及質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 漢麻籽多肽各組分所占比例

對(duì)漢麻籽粕酶解液進(jìn)行分離純化后得到4個(gè)多肽組分，各組分分子質(zhì)量及所占比例見(jiàn)表1。

表1 漢麻籽多肽各組分分子質(zhì)量及所占比例

由表1可知，得到的4個(gè)多肽組分中，HP-Ⅲ組分(分子質(zhì)量為1～3 kDa)所占比例最高，為54.32%，其次為HP-Ⅳ組分(分子質(zhì)量<1 kDa)，所占比例為40.18%。

2.2 漢麻籽多肽的抗氧化活性

2.2.1 DPPH自由基清除能力

漢麻籽多肽對(duì)DPPH自由基的清除能力如圖1所示。

圖1 漢麻籽多肽的DPPH自由基清除能力

DPPH自由基在乙醇溶液中穩(wěn)定，且在517 nm處有最大的吸光度。當(dāng)DPPH自由基遇到提供質(zhì)子的物質(zhì)，如抗氧化劑時(shí)，自由基被清除，吸光度降低。這個(gè)方法可評(píng)價(jià)抗氧化劑對(duì)DPPH自由基的清除能力。由圖1 可見(jiàn)，漢麻籽多肽對(duì)DPPH 自由基具有清除能力，且呈現(xiàn)出劑量相關(guān)性。漢麻籽多肽的分子質(zhì)量越大，相同質(zhì)量濃度的漢麻籽多肽對(duì)DPPH 自由基清除能力越小。一般來(lái)說(shuō)，生物活性肽的分子質(zhì)量、疏水性、氨基酸組成和序列被認(rèn)為在抗氧化作用中起關(guān)鍵作用，抗氧化肽的生物活性高度依賴(lài)于其分子大小，因?yàn)樾》肿拥目寡趸瘎└锌赡芘c自由基相互作用，以防止過(guò)氧化反應(yīng)[22]。

2.2.2 總還原力

漢麻籽多肽的總還原力如圖2所示。

圖2 漢麻籽多肽的總還原力

總還原力是評(píng)價(jià)活性肽抗氧化活性的重要指標(biāo)。從圖2可見(jiàn)，在0.1～10.0 mg/mL范圍內(nèi)，漢麻籽多肽的總還原力均隨著漢麻籽多肽質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)，并呈現(xiàn)出顯著的量效關(guān)系，相同質(zhì)量濃度條件下，分子質(zhì)量越大，總還原力越低，HP-Ⅳ組分的分子質(zhì)量(分子質(zhì)量<1 kDa)最小，其總還原力最強(qiáng)。

2.3 漢麻籽抗氧化肽的分子質(zhì)量分布

經(jīng)測(cè)定，HP-Ⅳ組分豐度較高的 6個(gè)峰對(duì)應(yīng)的肽段分子質(zhì)量分別為 364.84、539.77、630.30、662.33、718.90、827.41 Da。

2.4 漢麻籽抗氧化肽的氨基酸序列分析

為了確定可能引起抗氧化活性的肽段結(jié)構(gòu)，根據(jù)HP-Ⅳ組分的分子質(zhì)量分布，對(duì)HP-Ⅳ組分豐度較高的6個(gè)峰對(duì)應(yīng)的肽段進(jìn)行氨基酸序列分析，多肽序列分析結(jié)果如表2所示，質(zhì)譜圖如圖3～圖8所示。

表2 漢麻籽抗氧化肽肽段的氨基酸序列

圖3 NRDDMRER 質(zhì)譜圖

圖4 ANQLDQFSR質(zhì)譜圖

圖5 NPEDEFEQLRREGGRG 質(zhì)譜圖

圖6 NHNNQLDLTPR 質(zhì)譜圖

圖7 TVNSYNLPILRF 質(zhì)譜圖

圖8 VSLLDTSNVNNQLDDNPRRFY 質(zhì)譜圖

據(jù)報(bào)道，天冬氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、谷氨酸、賴(lài)氨酸、組氨酸、色氨酸、亮氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸等對(duì)肽的抗氧化性有貢獻(xiàn)[23]。由表2和圖3～圖8可知，鑒定的6個(gè)肽段中，均含具有抗氧化活性的氨基酸。已有研究證明多肽序列中異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和纈氨酸等疏水性氨基酸使其具有較好的抗氧化活性[24]。因此，研究認(rèn)為 NRDDMRER、ANQLDQFSR、NPEDEFEQLRR-EGGRG、NHNNQLDLTPR、TVNSYNLPILRF、VSLLD-TSNVNNQLDDNPRRFY多肽序列組成是使分子質(zhì)量小于1 kDa 的漢麻籽多肽組分具有較好抗氧化活性的主要因素。

3 結(jié) 論

本文采用復(fù)合蛋白酶法制備了具有較高抗氧化活性的漢麻籽多肽。利用切向流超濾系統(tǒng)分離純化，通過(guò)比較不同組分漢麻籽多肽的抗氧化活性，確定分子質(zhì)量小于1 kDa的漢麻籽多肽具有最強(qiáng)的抗氧化活性。分子質(zhì)量小于1 kDa的漢麻籽多肽組分中豐度較高的6個(gè)峰對(duì)應(yīng)的肽段分子質(zhì)量分別為 364.84、539.77、630.30、662.33、718.90、827.41 Da，采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜對(duì)其進(jìn)行氨基酸序列分析，得到的氨基酸序列分別為NRDDMRER、ANQLDQFSR、NPEDEFEQLRREGGRG、NHNNQL-DLTPR、TVNSYNLPILRF、VSLLDTSNVNNQLDDN-PRRFY。研究認(rèn)為分子質(zhì)量小于1 kDa的漢麻籽蛋白水解物是抗氧化功能食品開(kāi)發(fā)的優(yōu)良原料。